1734 DOI:10.16016/j.10005404.201612168 下调 STYK1 基因表达可抑制结直肠癌细胞生长与侵袭 唐佳佳, 叶林 (400016 重庆, 重庆医科大学附属第一医院重症医学科 ) [ 摘要 ] 目的探讨 STYK1 基因下调对结直肠癌细胞 HCT15 增殖 凋亡和迁移以及 MEK/ERK 和 PI3K/AKT 信号通路的影响 方法采用基因干扰技术抑制结直肠癌细胞 HCT15 中 STYK1 的表达,Westernblot 检测抑制效果,CCK8 检测 STYK1 表达下调对 HCT15 细胞增殖的影响, 流式细胞仪检测 STYK1 表达下调对 HCT15 细胞凋亡的影响,Transwel 小室实验检测 STYK1 表达下调对 HCT15 细胞侵袭的影响, 通过 Westernblot 检测 STYK1 表达下调对 HCT15 细胞 MEK/ERK 和 PI3K/AKT 信号通路活性的影响 结果与干扰对照组相比,STYK1 表达下调明显抑制 HCT15 细胞增殖活性 (P<001) 和侵袭能力 (P<0.01), 并诱导细胞凋亡 (P<0.01); 同时,STYK1 表达下调明显抑制 HCT15 细胞 ERK1/2 和 AKT 蛋白的磷酸水平 结论 STYK1 基因干扰可以抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭, 并诱导凋亡, 其机制可能与抑制 MEK/ERK 和 PI3K/AKT 信号通路活性有关 [ 关键词 ] mir671; 直肠癌 ; 增殖 ; 迁移 [ 中图法分类号 ] R394.3;R730.23;R735.3 [ 文献标志码 ] A STYK1downregulationsuppresescolorectalcancercelgrowthandinvasionin vitro TANG Jiajia,YE Lin(DepartmentofCriticalCareMedicine,theFirstAfiliatedHospitalofChongqingMedical University,Chongqing,400016,China) [Abstract] Objective Todeterminetheefectsofdownregulatingserine/threonine/tyrosinekinase 1(STYK1)ontheproliferation,apoptosisandinvasionandonMEK/ERKandPI3K/AKTsignalingpathways inhumancolorectalcancercellinehct15.methods TheexpresionofSTYK1proteinwasdown regulatedbyrnainterferencetechniqueinhct15cels.then,thestyk1proteinexpresionwasdetected bywestern bloting.cck8 asaywasused tomeasuretheefectofstyk1 downregulation on the proliferationofthecels,flowcytometrywasemployedtodetectthecelapoptosis,andtranswelchamber asaywasadoptedforcelinvasionability.theexpresionlevelsofperk1/2andpaktweredetectedby Westernbloting.Results ComparedwiththesiRNA NC group,styk1downregulationsignificantly inhibitedtheproliferation(p<0.01)andinvasion(p<0.01),inducedcelapoptosis(p<0.01),and suppresedtheexpresionlevelsofperk1/2andpaktinthehctcelstransfectedwithstyk1sirna (P<0.01).Conclusion STYK1downregulationinhibitstheproliferationandinvasionandinducesthe apoptosisincolorectalcancercels,whichmayberelatedtoitsinhibitiononthemek/erkandpi3k/akt signalingpathways. [Keywords] serine/threonine/tyrosinekinase1;colorectalcancer;proliferation;invasion Corespondingauthor:YELin,Email:329464286@qq.com [ 通信作者 ] 叶林,Email:329464286@qq.com [ 优先出版 ] htp://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1095.r.20170425.1730.011.html
htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2017,39(17) 1735 目前, 结直肠癌是世界上第三大常见的恶性肿瘤 [1-2] 在美国, 其死亡率在癌症患者中高居第 2 位, 仅次于肺癌 [3] 当结直肠癌被早期诊断发现且未转移时, 通过手术可以治愈 但是, 仅有 39.6% 的结肠癌患者会在早期被发现 [4] 当结直肠癌被诊断为晚期时, 化疗药物的疗效变得非常有限 因此, 迫切需要新的治疗手段和治疗靶点 STYK1 也称为 NOK, 是一种潜在人类受体蛋白激酶, 属于受体酪氨酸激酶家族, 由一个跨膜结构域和一个胞内结构域组成 [5-6] 近些年来, 研究表明 STYK1 在多种肿瘤组织中表达上调, 其中包括乳腺癌 非小细胞肺癌 肝癌和卵巢癌等 [7-11] 在肝癌中, 下调 STYK1 的蛋白表达可以抑制肝癌细胞的增殖和侵袭与迁移 [10] 因此,STYK1 的异常表达与肿瘤发生和发 [12] 展关系密切 ORANG 等发现 STYK1 在结直肠癌 [13] 肿瘤组织中高表达 而 HU 等发现 STYK1 在结直肠癌肿瘤组织中明显高表达, 并且与肿瘤分化程度 肿瘤分期 淋巴结转移和不良预后均密切相关 但是 STYK1 在结直肠癌发生与发展中的作用还少见报道 本研究拟探讨 STYK1 在结直肠癌细胞系中的功能, 以期为结直肠癌的治疗提供潜在的作用靶点 1 材料与方法 1.1 材料 人结直肠癌细胞株 HCT15 购自 ;RPMI1640 培养基购自美国 LifeTechnologies 公司 ; 胎牛血清 TRIzol 和 Lipofectamine2000 购自美国 Invitrogen 公司 ;RIPA 蛋白抽提裂解液购自武汉博士德公司 ;CCK8 购自上海 Beyotime 公司 ;AnnexinV/PI 凋亡检测试剂盒和 Transwel 小室购自美国 BD Bioscience 公司 ; 兔抗人 STYK1 多克隆抗体购自 Abcam; 兔抗人 ERK1/2 ERK1/2 AKT 和 pakt 单克隆抗体购自 CelSignaling Technology 公司 ; 兔抗人 GAPDH 多克隆抗体购自武汉博士德公司 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 HCT15 细胞用 RPMI1640( 含 10% 优质胎牛血清 ) 培养基培养, 并置于 37 95% 空气和 5% CO 2 的培养箱环境中, 每 2~3 天传代 1 次 1.2.2 STYK1 干扰靶点设计与细胞转染由上海生博生物医药科技有限公司设计并合成 STYK1 的 3 条 sirna 和对照序列, 信息如下 :STYK1siRNA1:5 CAAGTATATCACATCGGAAAG3 ;STYK1siRNA2:5 GCCCATCTTTCGAGCCAATAT3 ;STYK1siRNA3:5 CGGGATGTGATGACTATGGAT3 ;sirnanc:5 TTC TCCGAACGTGTCACGT3 取对数生长期的 HCT15 细胞, 经过胰蛋白酶消化后, 在 1000r/min 的条件下离心 5min, 将 HCT15 细胞用新鲜培养基重悬, 然后按 50% 的汇合度接种到 6 孔板中, 接种 12h 后按 50nmol/L 的浓度将 sirna NC 和 STYK1siRNA 转染到 HCT15 细胞中 1.2.3 Westernblot 检测蛋白表达将转染 72h 后的细胞收集, 并用 RIPA 蛋白抽提裂解液提取各组细胞的总蛋白, 然后用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量 然后, 加入 5 BuferSDS 上样缓冲液于沸水中将蛋白变性, 再根据目的蛋白分子量配置 SDS PAGE 凝胶, 按照每孔 50μg 总蛋白量进行上样, 然后电泳并转膜, 转膜完成后用 5% 的脱脂奶粉在室温条件下封闭 2h, 加入一抗,4 条件过夜, 次日用 TBST 洗膜, 然后添加辣根过氧化酶标记的二抗,37 条件下孵育 1h, 孵育完毕后 TBST 洗膜, 用 ECL 化学发光发进行显影, 最后用 Quantityone 软件进行目的条带的灰度分析 1.2.4 CCK8 实验取对数生长期的 HCT15 细胞, 将其接种到 96 孔板中, 将实验分成空白对照组 干扰对照组和 STYK1siRNA 组, 分别于 1 2 3 4d 连续进行 CCK8 检测 检测前每孔中加入 CCK8 试剂 10μL, 然后在 37 条件下孵育 3.5h, 然后用酶标仪检测波长 450nm 处的光密度值 D(450) 1.2.5 流式测凋亡实验收集转染 72h 后的 HCT15 细胞, 在 1000r/min 条件下低速离心后用预冷的 PBS 冲洗 2 次, 然后加入 2μLAnnexinVFITC (20μg/mL), 轻轻混匀, 在避光条件下于冰上静置 20min, 然后加入 PBS 洗涤, 最后加入 1 μl PI (50μg/mL), 作用约 2min 后通过流式检测各样品的凋亡情况 1.2.6 Transwel 小室实验 Transwel 小室实验根据本课题组前期实验方法 [14] 收集转染 24h 后的 HCT15 细胞, 在 1000r/min 低速条件下离心 6min, 并用血球计数板进行细胞计数, 按每孔 5 10 4 个细胞接种于 Transwel 小室的上室, 下室添加 RPMI1640( 含 10% 优质胎牛血清 )700μL, 置于 37 条件培养箱中继续培养 48h, 迁移完成后底膜用冰甲醇固定 10min, 用 1% 的结晶紫染色 15min, 利用 PBS 清洗 2 遍, 然后用树脂封片, 最后进行细胞计数 1.3 统计学处理采用 SPSS22.0 统计软件进行数据统计分析, 计量资料以 x±s 珋表示, 两组之间的差异比较均采用 t 检验, 检验水准 :α=0.05
1736 2 结果 2.1 Westernblot 实验验证 STYK1 干扰靶点效果 Westernblot 检测结果显示,3 个干扰靶点转染 HCT15 细胞后 STYK1 蛋白分别为 (0.19±0.06) (027±0.04) (0.33±0.03), 与干扰对照组相比 (100±0.16), 本研究设计的 3 个干扰靶点均能有效抑制 STYK1 蛋白的表达 (P<0.01, 图 1); 其中, STYK1siRNA1 靶点的抑制效果最明显 ( 图 1), 后续实验将采用此靶点进行 STYK1 蛋白抑制 A:Westernblot 检测结果 ;B: 半定量分析结果 ;1: 空白对照组,2: 干扰对照组,3:STYK1siRNA1 组,4:STYK1siRNA 2 组,5:STYK1siRNA3 组 a:p<0.01, 与干扰对照组比较 图 1Westernblot 实验验证 STYK1 干扰靶点效果 2.2 STYK1 下调后对 HCT15 细胞增殖的影响 CCK8 实验检测结果表明 : 与空白对照组 HCT15 细胞相比, 干扰对照组细胞在 1 2 3 4d 的增殖活力没有明显的变化趋势 (P>0.05); 与干扰对照组 HCT15 细胞相比,STYK1 下调后在第 3 天和第 4 天的增殖能力明显降低 (P<0.01, 图 2) a:p<0.01, 与干扰对照组比较 图 2 CCK8 实验检测 STYK1 干扰后对 HCT15 细胞增殖的影响 2.3 STYK1 干扰后对 HCT15 细胞凋亡的影响 流式细胞术检测 STYK1 下调是否会诱导 HCT15 细胞的凋亡 结果表明 : 空白对照组 干扰对照组和 STYK1siRNA 组细胞凋亡率分别为 (7.29±0.77)% (7.80±0.81)% (13.65±1.10)%; 与空白对照组 HCT15 细胞的凋亡率相比, 干扰对照组 HCT15 细胞凋亡百分率差异没有统计学意义 (P>0.05); 与干扰对照组 HCT15 细胞相比,STYK1 下调后能够明显诱导 HCT15 细胞凋亡 (P<0.01, 图 3) 2.4 STYK1 干扰后对 HCT15 细胞侵袭能力的影响 Transwel 检测结果表明空白对照组 干扰对照组和 STYK1siRNA 组细胞侵袭数分别为 (75±6) (72± 8) 和 (42±4); 与空白对照组 HCT15 细胞相比, 干扰对照组 HCT15 细胞侵袭数差异无统计学意义 (P> 005); 与干扰对照组 HCT15 细胞相比,STYK1 下调后可明显抑制 HCT15 细胞侵袭 (P<0.01, 图 4) " " A: 空白对照组 ;B: 干扰对照组 ;C:STYK1siRNA 组 图 3 流式细胞术检测 STYK1 干扰后对 HCT15 细胞凋亡的影响
htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2017,39(17) 1737 A: 空白对照组 ;B: 干扰对照组 ;C:STYK1siRNA 组 图 4 Transwel 实验检测 STYK1 干扰后对 HCT15 细胞侵袭的影响 ( 结晶紫 400) 2.5 STYK1 干扰后对 HCT15 细胞 MEK/ERK 和 PI3K/AKT 信号通路活性的影响 Westernblot 检测结果表明, 空白对照组 干扰对照组和 STYK1siRNA 组细胞 perk1/2 蛋白相对表达量分别为 (0.37±0.05) (0.38±0.05) 和 (0.19± 003), 而 pakt 蛋白相对表达量分别为 (1.06± 009) (1.12±0.11) 和 (0.53±0.09); 与空白对照组 HCT15 细胞相比, 干扰对照组 HCT15 细胞 perk1/ 2 和 pakt 蛋白相对表达量差异无统计学意义 (P> 0.05); 与干扰对照组 HCT15 细胞相比,STYK1 下调后能够明显抑制 HCT15 细胞 perk1/2 和 pakt 蛋白相对表达量 (P<0.01, 图 5) 1: 空白对照组,2: 干扰对照组,3:STYK1siRNA 组 图 5 Westernblot 检测 STYK1 干扰后对 HCT15 细胞 3 讨论 MEK/ERK 和 PI3K/AKT 信号通路活性的影响 越来越多的证据表明在结直肠癌中特异性上调或者下调的基因可以作为早期诊断标记 预后指标或治疗靶点 [15-16] STYK1 就是这样一个基因, 它在多种肿瘤中表达上调 [6-10,17] [13] 同时,HU 等的研究发现, STYK1 在结直肠癌肿瘤组织中明显高表达, 并且与肿瘤分化程度 肿瘤分期 淋巴结转移和不良预后均密切相关 这预示 STYK1 可能与结直肠癌细胞的增殖和 迁移密切相关 因此, 本研究利用基因干扰技术抑制结直肠癌细胞中 STYK1 的表达, 我们发现 STYK1 表达下调明显抑制 HCT15 细胞增殖活性和侵袭能力, 并诱导细胞凋亡 本研究结果与 STYK1 在其他肿瘤中的功能是一致的 例如, 在 BaF3 细胞中,STYK1 可以促进其增殖和迁移 [6] [17] 而 CHUNG 等在前列腺癌的研究中发现,STYK1 干扰后能抑制前列腺癌细胞 [10] 的增殖活力 同时,WANG 等在肝癌的研究中也发现,STYK1 干扰后抑制肝癌细胞的增殖和迁移, 而 STYK1 过表达促进肝癌细胞的增殖和迁移 综上所述,STYK1 在多种肿瘤中发挥癌基因的作用 虽然上述研究中我们探讨了 STYK1 在结直肠癌中发挥癌基因的作用, 但是其调控机制还不清楚 在肝癌中,STYK1 可以通过激活 MEK/ERK 和 PI3K/ AKT 信号通路活性来促进肝癌细胞的增殖和迁移能力 [10] 同时, 大量研究表明 :MEK/ERK 和 PI3K/AKT 信号通路激活可以促进细胞的增殖, 提高细胞的迁移能力, 并诱导 EMT [18-20] 在结直肠癌中,MEK/ERK 和 PI3K/AKT 信号通路活性与肿瘤细胞的侵袭和凋亡等密切相关 [21-22] 因此, 我们推测 STYK1 干扰可能会影响结直肠癌细胞中 MEK/ERK 和 PI3K/AKT 信号通路的活性 因此, 我们通过 Westernblot 检测 STYK1 干扰对结直肠癌细胞 MEK/ERK 和 PI3K/AKT 信号通路活性的影响, 结果表明 STYK1 表达抑制后明显降低两个通 [10] 路的活性, 与 WANG 等在肝癌中的研究结果相符 综上所述, 本研究通过基因干扰技术成功抑制了 STYK1 蛋白的表达, 并证明 STYK1 干扰可以抑制结直肠癌细胞增殖 侵袭, 诱导凋亡, 并且抑制结直肠癌细胞 MEK/ERK 和 PI3K/AKT 信号通路活性, 为结直肠癌的治疗提供了一定的理论依据 参考文献 : [1] FERLAYJ, SOERJOMATARAM I, DIKSHIT R, etal. Cancerincidenceandmortalityworldwide:sources,methods
1738 andmajorpaternsinglobocan2012[j].intjcancer, 2015,136(5):E359-E386.DOI:10.1002/ijc.29210. [2]ZHAOM,LIUY,HUANGF,etal.Agenebrowserofcolorec talcancerwithliteratureevidenceandprecomputedregulatory informationtoidentifykeytumorsuppresorsandoncogenes[j]. SciRep,2016,6:30624.DOI:10.1038/srep30624. [3]ROSAB,DEJESUSJP,DEMELLOEL,etal.Efective nesandsafetyofmonoclonalantibodiesformetastaticcolor ectalcancertreatment:systematicreview andmetaanalysis [J].Ecancermedicalscience,2015,9:582.DOI:10.3332/ ecancer.2015.582. [4]DENGB,WANGB,FANGJ,etal.MiRNA203suppreses celproliferation,migrationandinvasionincolorectalcancer viatargetingofeif5a2[j].scirep,2016,6:28301. DOI:10.1038/srep28301. [5] YEX,JIC,HUANGQ,etal.Isolationandcharacterization ofahumanputativereceptorproteinkinasecdna STYK1 [J].MolBiolRep,2003,30(2):91-96.DOI:10.1023/ b:mole.0000043622.57408.6b. [6] LIUL,YU X Z,LITS,etal.A novelproteintyrosine kinasenokthatshareshomologywithplateletderivedgrowth factor/fibroblastgrowthfactorreceptorsinducestumorigenesis andmetastasisinnudemice[j].cancerres,2004,64(10): 3491-3499.DOI:10.1158/00085472.CAN032106. [7] KIMBROKS,DUSCHENEK,WILLARDM,etal.Anovel genestyk1/nok isupregulatedinestrogenreceptoralpha negativeestrogenreceptorbetapositivebreastcancercelsfol lowingestrogentreatment[j].molbiolrep,2008,35(1): 23-27.DOI:10.1007/s1103300690471. [8] AMACHIKAT,KOBAYASHID,MORIAIR,etal.Diag nosticrelevanceofoverexpresedmrna ofnoveloncogene withkinasedomain(nok)inlungcancers[j].lungcancer, 2007,56(3):337-340.DOI:10.1016/j.lungcan.2007. 01.002. [9] JACKSON K A,OPREA G,HANDY J,etal.Aberant STYK1expresioninovariancancertisuesandcellines [J].JOvarianRes,2009,2(1):15.DOI:10.1186/1757 2215215. [10]WANGZ,QUL,DENGB,etal.STYK1promotesepithe lialmesenchymaltransitionandtumormetastasisinhuman hepatocelularcarcinomathroughmek/erkandpi3k/akt signaling[j].scirep,2016,6:33205.doi:10.1038/ srep33205. [11] 陈鹏, 张志培, 金河天, 等.STYK1/NOK 基因转染对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响 [J]. 中华肿瘤防治杂志, 2011,18(8):564-567. CHENP,ZHANGZP,JINHT,etal.ImpactofSTYK1/ NOKgenetransfectiononthemigrationandinvasionoflung adenocarcinomacelline[j].chinjcancerpreventreat, 2011,18(8):564-567. [12] ORANGAV, SAFARALIZADEH R, HOSSEINPOUR M A,etal.Diagnosticrelevanceofoverexpresedserinethreo ninetyrosinekinase/noveloncogene with kinase domain (STYK1/NOK)mRNAincolorectalcancer[J].AsianPac JCancerPrev,2014,15(16):6685-6689. [13] HUL,CHENHY,CAIJ,etal.Serinethreoninetyrosine kinase1isapotentialprognosticmarkerincolorectalcancer [J].BMCCancer,2015,15:246.DOI:10.1186/s12885 0151285y. [14] 唐佳佳, 叶林.miRNA671 上调抑制胃癌细胞增殖与迁移 [J]. 第三军医大学学报,2017,39(16):1643-1647. DOI:10.16016/j.10005404.201612169. TANGJJ,YEL.UpregulationofmiRNA671inhibitspro liferationandinvasionofgastriccancercels[j].jthirdmil MedUniv,2017,39(16):1643-1647,DOI:10.16016/j. 10005404.201612169. [15]KAWAMURAM,TOIYAMAY,TANAKAK,etal.Evalu ationofserum CXCL5asaserum markerforprognosisof colorectalcancerpatients[j].journalofclinicaloncology, 2011,29(4):442-442.DOI:10.1200/jco.2011.29.4_ suppl.442. [16] ZUC,LIUT,ZHANGG.MicroRNA506inhibitsmalig nancyofcolorectalcarcinomacelsbytargetinglamc1[j]. AnnClinLabSci,2016,46(6):666-674. [17]CHUNGS,TAMURA K,FURIHATA M,etal.Overex presionofthepotentialkinaseserine/threonine/tyrosine kinase1(styk1)incastrationresistantprostatecancer [J].CancerSci,2009,100(11):2109-2114.DOI:10. 1111/j.13497006.2009.01277.x. [18]BERTACCHINIJ,HEIDARIN,MEDIANIL,etal.Targe tingpi3k/akt/mtor networkfortreatmentofleukemia [J].CelMolLifeSci,2015,72(12):2337-2347. DOI:10.1007/s0001801518675. [19] JIANGL,DONGP,ZHANGZ,etal.Aktphosphorylates prohibitin1tomediateitsmitochondriallocalizationandpro moteproliferationofbladdercancercels[j].celdeath Dis,2015,26;6:e1660.DOI:10.1038/cddis.2015.40. [20] YOOYA,KANGM H,LEEH J,etal.Sonichedgehog pathwaypromotesmetastasisandlymphangiogenesisviaacti vationofakt,emt,andmmp9pathwayingastriccancer [J].CancerRes,2011,71(22):7061-7070.DOI:10. 1158/00085472.CAN111338. [21] JIANGQG,LITY,LIUDN,etal.PI3K/Aktpathway involvingintoapoptosisandinvasioninhumancoloncancer celslovo[j].molbiolrep,2014,41(5):3359-3367. DOI:10.1007/s1103301431982. [22] YEQ,CAIW,ZHENGY,etal.ERKandAKTsignaling cooperatetotranslationalyregulatesurvivinexpresionfor metastaticprogresionofcolorectalcancer[j].oncogene, 2014,3;33(14):1828-1839.DOI:10.1038/onc.2013.122. ( 收稿 :20161224; 修回 :20170303) ( 编辑邓强庭 )