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卯瓜符
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1 1942 第三军医大学学报,2016,38(17) htp://aammt.tmmu.edu.cn DOI: /j LETM1 在肝癌中的表达及其对 SMMC 7721 细胞增殖和凋亡的影响周宝勇, 蒋宁, 廖锐, 郑军, 杜成友 ( 重庆, 重庆医科大学附属第一医院肝胆外科 ) [ 摘要 ] 目的探讨亮氨酸拉链 EF hand 结构域跨膜蛋白 1(leucinebnzipper/EF hand containing transmembraneprotein1,letm1) 在肝癌组织中的表达水平及通过 RNAi 技术靶向 LETM1 基因对肝癌细胞株 SMMC 7721 的增殖及凋亡的影响方法采用免疫组织化学方法 Westernblot 检测重庆医科大学附属第一医院肝胆外科 2012 年 9 月至 2013 年 4 月共 60 例肝癌组织及其癌旁肝组织中 LETM1 蛋白表达情况 Westernblot 检测人肝癌细胞株 SMMC 7721 和 HepG2 及人正常肝细胞株 LO2 中的 LETM1 蛋白表达情况将 LETM1siRNA 经 Lipofectamine2000 TM 脂质体转染 SMMC 7721( 实验组为 si LETM1 对照组为 si NC), 实时荧光定量 PCR 及 Westernblot 分别检测 LETM1 转染后肝癌 SMMC 7721 细胞株中 LETM1mRNA 及蛋白的表达 CKK 8 及流式细胞术检测 LETM1 低表达对肝癌细胞增殖及细胞凋亡的影响结果 1 免疫组织化学结果显示,LETM1 蛋白在肝癌组织中的阳性表达率为 73.33% (44/60), 明显高于癌旁组织中的表达率 28.33%(17/60,P<0.01);Westernblot 检测结果显示,LETM1 蛋白在肝癌组织中的表达相对量 (2.335±0.221) 较癌旁组织 (1.386±0.081) 明显增高 (P<0.01) 2LETM1 蛋白表达与肝癌肿瘤直径及门静脉侵犯有关 (P<0.05), 而与肝癌患者性别年龄甲胎蛋白 HBsAg Edmondson 分级及 TNM 分期无关 (P>0.05) 3LETM1 蛋白在 SMMC 7721 及 HepG2 中的表达相对量 [( 分别为 (1.447±0.149) (1.190±0.113)] 均明显高于 LO2[(0.918±0.027),P<0.05] 4si LETM1 组与 si NC 组和空白组比较,si LETM1 组细胞的增殖受到抑制 (P<0.01), 尤以 72h 及 96h 最为显著 ;si LETM1 早期细胞凋亡数 (14.6±2.3)% 与 si NC 早期细胞的凋亡数 (6.3±0.7)% 比较, 差异有统计学意义 (P=0.04) 结论 LETM1 蛋白在肝癌组织的表达显著高于癌旁组织 ; 基因沉默 LETM1 后的肝癌细胞其增殖能力明显减弱, 凋亡能力明显增强 [ 关键词 ] 肝细胞癌 ;RNA 干扰 ;LETM1; 细胞增殖 ; 凋亡 [ 中图法分类号 ] R394.3;R730.23;R735.7 [ 文献标志码 ] A ExpresionofLETM1inhepatocelularcarcinomaanditsefectonproliferationand apoptosisinhepatocelularcarcinomacellinesmmc 7721 ZhouBaoyong,JiangNing,LiaoRui,ZhengJun,DuChengyou(DepartmentofHepatobiliarySurgery,theFirst AfiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing,400016,China) [Abstract] Objective To analyze the expresion ofleucine zipper/ef hand containing transmembraneprotein1(letm1)inthehumanhepatocelularcarcinoma(hcc)andtodeterminetheefect ofrnainterferencetargetedtosilenceletm1geneontheproliferationandapoptosisofhcccellinesmmc 7721.Methods ImmunohistochemicalasayandWesternblotingwereusedtoanalyzetheexpresionlevel ofletm1proteininhcc tisuesandparaneoplastictisuesfrom 60HCC patientswhoadmitedinour departmentfrom September2012toApril2013.TherelationshipbetweenLETM1expresionandclinical pathologicalparameterswasstudied.westernblotingwasalsousedtoanalyzetheexpresionofletm1 [ 基金项目 ] 国家自然科学基金青年科学基金项目 ( ); 国家临床重点专科建设资助项目 ([2012]649 号 ); 重庆市渝中区科技计划项目 ( ) [ 通信作者 ] 杜成友,E mail:duchengyou@126.com [ 优先出版 ] htp:// )

2 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2016,38(17) 1943 proteininsmmc 7721,HepG2andnormalliverLO2cels.RNAinterferencetargetedtosilenceLETM gene wastransfectedintothesmmc 7721celswithLipofectamine2000(representingthecontrolgroupsi NCand theexperimentalgroupsi LETM1).Quantitativereal timepcr(qrt PCR)andWesternblotingwereused todetectthemrnaandproteinlevelsofletm1inthesilencedcels.theproliferationandapoptosisofthe transfectedcelswereasesedbycck 8asayandflowcytometry.Results Immunohistochemicalasay indicatedthatletm1proteinwasexpresedin73.33% HCCtisues(44/60),significantlyhigherthanthat ofparaneoplastictisues(28.33%,17/60,p<0.01).theresultsshowedthattheexpresionatprotein levelwasalsohigherinthehcctisuesthantheparaneoplastictisues(2.335±0.220vs1.386±0.080, P<0.01).TheexpresionofLETM1proteinwascorelatedwithtumorsizeandportalveininvasion(P< 0 05),butnotwithgender,age,alphafetoprotein,HBsAg,EdmondsongradeandTNMstage(P>0.05). TheexpresionlevelofLETM1proteinwassignificantlyhigherintheSMMC 7721(1.447±0.149)and HepG2cels(1.190±0.113)thantheLO2cels(0.918±0.027,P<0.05).Comparedwithsi NCgroup andblankgroup,thecelproliferationwasinhibitedsignificantlyinsi LETM1treatedcels(P<0.01), especialyat72and96h.theearlyapoptosisofsi LETM1transfectedcelshadasignificantincreasewhen comparedwithsi NCtreatedcels[(14.6±2.3)% vs(6.3±0.7)%,p=0.04].conclusion The proteinexpresionofletm1issignificantlyhigherinhcctisuesthantheparaneoplastictisues.rnaiof LETM1mayinhibitcelsproliferationandinduceapoptosisintheSMMC 7721cels. [Key words] human hepatocelular carcinoma; RNAi; leucine zipper/ef hand containing transmembraneprotein1;celproliferation;apoptosis SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationforYoungScholarsofChina( ),theNationalClinicalKey desciplineconstructionprogramof China( )andtheScienceandTechnologyProjectofYuzhongDistrictofChongqing( ).Corespondingauthor:DuChengyou,E mail: duchengyou@126.com 肝癌是一种常见的恶性肿瘤, 其恶性程度极高, 我国是世界上肝癌发病集中的国家, 每年新发病例及死亡病例约占全球的 50% [1] 现有的治疗方法主要以肝切除及肝移植为主, 然而术后肿瘤复发率高, 预后不容乐观亮氨酸拉链 EF hand 结构域跨膜蛋白 1 (leucinezipper/ef hand containingtransmembranepro tein1,letm1) 是最新发现的线粒体蛋白, 报道指出其能诱发 Wolf Hirschhorn 综合征 [2] [3] Piao 等发现, LETM1 在宫颈癌中高表达, 可激活 PI3K Akt 信号传导通路从而影响宫颈癌的发生发展 ; 同时研究报道 LETM1 蛋白在结肠癌组织中高表达 [4] LETM1 可能在肝癌的发生发展过程中也发挥着一定的作用本研究采用免疫组织化学方法 Westernblot 检测 LETM1 在肝癌组织的表达情况及其与临床参数的关系, 并应用 RNA 干扰 (RNAinterference,RNAi) 技术靶向沉默肝癌细胞 SMMC 7721 中的 LETM1 基因, 使细胞中 LETM1 蛋白表达减少, 观察其对细胞增殖和凋亡的影响, 以期为肝癌治疗提供新方向和新的治疗策略 1 材料与方法 1.1 标本来源 60 例取自重庆医科大学附属第一医院肝胆外科 2012 年 9 月至 2013 年 4 月手术切除并经病理确诊的肝细胞癌及其相应癌旁组织标本 ( 距癌组织边缘 > 3cm), 所取组织部分用 4% 多聚甲醛固定, 部分存于液氮中患者术前均未行放疗化疗及免疫抑制等治疗其中男性 47 例, 女性 13 例年龄 18~79 岁, 中位年龄 57 岁肿瘤直径 0.8~16cm, 肿瘤最大 1 例, 最小 1 例, 肿瘤直径 >5cm 有 40 例, 5cm 有 20 例 ; Edmondson 标本分级 :Ⅰ~Ⅱ 级 26 例,Ⅲ~Ⅳ 级 34 例所选标本均进行术前谈话, 并获得患者或其家属同意人肝癌细胞株 SMMC 7721 HepG2 及人正常肝细胞株 LO2 由重庆医科大学附属第一医院实验研究中心惠赠 1.2 主要试剂兔抗人 LETM1 多克隆抗体兔抗人 GAPDH 多克隆抗体 HRP 标记羊抗兔二抗 (Proteintech 公司 ); 免疫组织化学法 (S P) 试剂盒 DAB 显色试剂盒 ( 北京中杉金桥生物技术公司 );Lipofectamine TM 2000( 美国 Invitrogen 公司 );si RNA(Origene 公司 ); 全蛋白提取试剂 BCA 试剂盒 ECL 发光试剂盒 RNATRIzol 提取试剂盒 TRIzol 提取试剂逆转录和 PCR 试剂盒 CCK 8 试剂盒 AnnexinV FITC 细胞凋亡检测试剂盒等 ( 碧云

3 1944 第三军医大学学报,2016,38(17) htp://aammt.tmmu.edu.cn 天生物技术公司 );LETM1 和 GAPDH 引物由上海生工生物工程有限公司合成 ; 其余实验材料及试剂取自重庆医科大学附属第一医院实验研究中心 1.3 免疫组织化学法 4% 多聚甲醛溶液固定的标本行常规石蜡包埋, 制成 4μm 厚切片参照免疫组化试剂盒说明书操作 : 切片经二甲苯脱蜡水化后, 枸橼酸微波高温修复抗原, 3% 过氧化氢 10min 阻断内源性过氧化物酶, 血清 37 封闭 20min,LETM1 抗体 (1 50)4 孵育过夜, 二抗孵育后加入辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育 20min,DAB 显色, 苏木精复染, 常规脱水, 封片用 PBS 代替 LETM1 抗体作为空白对照 1.4 结果判定在排除非特异性染色的前提下,LETM1 在细胞质内以黄色棕黄色棕褐色为阳性计分方法 A: 按切片中细胞染色的深浅评分,0 分为无染色,1 分为浅黄色,2 分为棕黄色,3 分为棕褐色 ;B: 按切片中的阳性细胞比例评分, 每个标本计数 3 张切片, 每张切片随机选择 5 个视野, 每个视野 100 个细胞, 计数 500 个细胞中染色阳性的细胞数,0 分为染色细胞数 5%,1 分为染色细胞数占 >5% ~25%,2 分为染色细胞数占 > 25% ~50%,3 分为染色细胞数占 >50% ~75%,4 分为染色细胞数 >75% 每例标本染色积分 =A B, 若乘积 1 为阴性,>1 为阳性 1.5 Westernblot 检测提取肝癌组织癌旁组织及 LO2 SMMC 7721 HepG2 细胞株的总蛋白 4,12000r/min, 离心 20min(r=10cm), 取上清,-20 保存备用 BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度, 按每孔上样量 50μg 进行 SDS PAGE 电泳, 恒流冰浴电转至 PVDF 膜上, 5% 脱脂牛奶封闭 2h, 一抗孵育 4 过夜 (LETM ,GAPDH ),HRP 标记羊抗兔二抗 (1 2000),ECL 显色, 暗室曝光显影,GAPDH 为内参, 实验重复 3 次 LETM1 蛋白表达抑制率计算 : 抑制率 (%)=[1- (si LETM1 组 LETM1 条带灰度 /si LETM1 组 GAPDH 条带灰度 )/(si NC 组 LETM1 条带灰度 /si NC 组 GAPDH 条带灰度 )] 1.6 细胞培养及细胞转染将人肝癌细胞 SMMC 7721 细胞接种于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中, 于 5% CO 2 37 恒温培养箱中培养转染前 24h 按 / 孔接种于 6 孔板, 加入无血清的培养基 2mL, 使转染时细胞密度约为 40% 将 sirnalipofectamine TM 2000 复合体 ( 复合体的配置按照说明书操作 ) 加到 6 孔板中, 转染体系为 500μL,siRNA 终浓度为 50nmol/L, 其中实验组为 si LETM1 组, 阴性对照组为无义 sirna 表达载体的转染, 即 si NC 组, 空白组孔内加入相同密度的未转染的 SMMC 7721 细胞 1.7 实时荧光定量 PCR 按 TRIzol 和反转录试剂说明书要求提取 si NC 细胞 si LETM1 细胞中总 RNA, 反转录成 cdna, 以 cdna 为模板行 PCR 扩增 LETM1 基因上游引物为 5 CCCAAGCTTATGGCGTCCATCTTACTGAGG 3, 下游引物为 5 CCGCTCGAGTCACTAGCTCTTCACCTCTGCG 3 [5] ;GAPDH 为内参, 上游引物为 5 AGAAGGCT GGGGCTCATTTG 3, 下游引物为 5 AGGGGCCATC CACAGTCTTC 3 反应体系 20μL, 包括 cdna 模板 1μL, 上下游引物各 0.5μL,2 PCRmixture10μL, DEPC 水 8μL,PCR 反应条件 :95 预变性 5min;95 变性 30s,55 退火 30s,72 延伸 60s,35 个循环每孔设计 2 个复孔采用 2 -ΔΔCt 分析法, 按照公式分别计算实验组对照组及空白组的 ΔCt, 以空白组的 ΔCt 为参照, 计算 2 -ΔΔCt, 即为 LETM1mRNA 相对表达量 ΔCt=Ct 实验组 -Ct 对照组 ΔΔCt=ΔCt 靶基因 -ΔCt 内参基因 1.8 CCK 8 实验将指数生长期的 si NC 细胞 si LETM1 细胞接种于 96 孔板内, 按接种密度 70% ~80%, 每孔 5000 个 / 200μL, 设 6 个复孔, 空白孔为未转染的 SMMC 7721 细胞分别于 h 和 96h 分别终止培养终止培养前 4h, 每孔中加入 CCK 8 溶液 20μL, 放置培养箱中孵育 4h, 选择 450nm 波长, 在酶标仪上测定各孔光密度值 [D(450)], 记录结果, 绘制生长曲线 1.9 细胞凋亡实验取接种密度 70% ~80% 的转染细胞, 消化收集细胞, 用 4 预冷的 PBS 洗细胞 2 次, 以 1mL 结合缓冲液重悬细胞, 调整细胞浓度为 /ml, 用 AnnexinV 和碘化丙啶 (PI) 双染 15min 后用流式细胞术检测细胞凋亡率 1.10 统计学方法采用 SPSS22.0 进行统计学分析, 定量资料用 x±s 珋进行描述, 用 t 检验进行均值差异的比较 ; 临床病理特征的数据采用 χ 2 检验及校正的 χ 2 检验检验水准 α=0.05

htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2016,38(17) 1945 2 结果 2.1 肝癌组织中 LETM1 的表达 HE 染色及免疫组织化学结果显示,LETM1 主要定位于细胞质, 阳性表达主要染成黄色棕黄色或棕褐色 ( 图 1) LETM1 在肝癌组织和癌旁组织的阳性表达率分别为 73.33%(44/60) 及 28.

01] A: 癌旁组织 ;B: 癌组织图 1 LETM1 在肝癌组织及癌旁肝组织中的表达 (S P 400) 1 3 5: 癌组织 ;2 4 6: 癌旁组织图 2 Westernblot 检测 LETM1 在肝癌组织及癌旁组织中的表达 2.2 LETM1 与肝癌临床参数的关系 LETM1 蛋白与肝癌肿瘤直径及门静脉侵犯有关, (P<0.

113)] 均明显高于人正常肝细胞株 LO2[(0.918±0.027),P<0.05], 而 SMMC 7721 与 HepG2 相比两者差异无统计学意义 (t=1.976,p=0.187, 图 3) 2.4 RNAi 沉默 SMMC 7721 中 LETM1 的鉴定 RT PCR 检测结果显示, 对照组 LETM1 的 Ct 值为 (21.787±0.

4 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2016,38(17) 结果 2.1 肝癌组织中 LETM1 的表达 HE 染色及免疫组织化学结果显示,LETM1 主要定位于细胞质, 阳性表达主要染成黄色棕黄色或棕褐色 ( 图 1) LETM1 在肝癌组织和癌旁组织的阳性表达率分别为 73.33%(44/60) 及 28.33%(17/60), 差异有统计学意义 (χ 2 =24.307,P<0.01) Western blot 检测结果如图 2 所示,LETM1 在肝癌组织的表达量为 (2.335±0.221), 明显高于癌旁组织的相对表达量 [(1.386±0.081),t=16.579,P<0.01] A: 癌旁组织 ;B: 癌组织图 1 LETM1 在肝癌组织及癌旁肝组织中的表达 (S P 400) 1 3 5: 癌组织 ;2 4 6: 癌旁组织图 2 Westernblot 检测 LETM1 在肝癌组织及癌旁组织中的表达 2.2 LETM1 与肝癌临床参数的关系 LETM1 蛋白与肝癌肿瘤直径及门静脉侵犯有关, (P<0.05), 而与肝癌患者性别年龄甲胎蛋白 HBsAg Edmondson 分级及 TNM 分期无关 (P>0.05, 表 1) 2.3 LO2 HepG2 及 SMMC 7721 细胞株中 LETM1 的表达 Westernblot 检测结果显示,LETM1 蛋白在人肝癌细胞株 SMMC 7721 及 HepG2 中的表达相对量 [ 分别为 (1.447±0.149) (1.190±0.113)] 均明显高于人正常肝细胞株 LO2[(0.918±0.027),P<0.05], 而 SMMC 7721 与 HepG2 相比两者差异无统计学意义 (t=1.976,p=0.187, 图 3) 2.4 RNAi 沉默 SMMC 7721 中 LETM1 的鉴定 RT PCR 检测结果显示, 对照组 LETM1 的 Ct 值为 (21.787±0.059),GAPDH 的 Ct 值为 (11.110± 0 095), 实验组 LETM1 的 Ct 值为 (24.880±0 217), GAPDH 的 Ct 值为 (11.913±0.304);LETM1mRNA 在 si NC 细胞中的相对表达量为 1 在 si LETM1 细胞中的相对表达量为 (0.214±0.079),2 组细胞之间差异有统计学意义 (t=17.147,p=0.003) 组织部位性别表 1 LETM1 表达与肝癌临床参数的关系 LETM1 蛋白的表达组别例数 χ 2 值 P 值阴性阳性癌癌旁男女年龄 ( 岁 ) > 肿瘤直径 (cm) > 甲胎蛋白 (ng/ml) > HBsAg 阳性阴性门静脉侵犯有无 TNM 分期 (AJCC) Ⅰ ~Ⅱ Ⅲ ~Ⅳ Edmondson 分级 Ⅰ ~Ⅱ Ⅲ ~Ⅳ :LO2;2:HepG2;3:SMMC < 图 3 Westernblot 检测 LETM1 在 LO2 HepG2 及 SMMC 7721 中的表达 Westernblot 检测结果显示,LETM1 蛋白在 si NC 细胞 si LETM1 细胞中的相对表达量分别为 (0.377± 0.013) (0.180±0.016), 两组细胞比较差异有统计

1946 第三军医大学学报,2016,38(17) htp://aammt.tmmu.edu.cn 学意义 (t=14.208,p=0.005, 图 4) si LETM1 组 LETM1 蛋白表达抑制率约为 52.2% 1:si NC 组 ;2:si LETM1 组图 4 Westernblot 检测转染细胞中 LETM1 蛋白的表达 2.

6 对转染后 SMMC 7721 细胞凋亡的影响流式细胞术检测结果显示,si LETM1 组早期细胞凋亡数为 (14.6±2.3)%,si NC 组早期细胞的凋亡数为 (6.3±0.7)%, 差异有统计学意义 (t=4.

5 1946 第三军医大学学报,2016,38(17) htp://aammt.tmmu.edu.cn 学意义 (t=14.208,p=0.005, 图 4) si LETM1 组 LETM1 蛋白表达抑制率约为 52.2% 1:si NC 组 ;2:si LETM1 组图 4 Westernblot 检测转染细胞中 LETM1 蛋白的表达 2.5 对转染后 SMMC 7721 细胞增殖的影响根据 CCK 8 检测结果绘制的生长曲线, 结果显示 si LETM1 组较 si NC 组和空白组曲线降低, 尤其在 72 96h 时, 差异有统计学意义 (P<0.01, 图 5)!" a:p<0.01, 与空白组 si NC 组比较图 5 CCK 8 检测 LETM1 转染对 SMMC 细胞增殖的影响 2.6 对转染后 SMMC 7721 细胞凋亡的影响流式细胞术检测结果显示,si LETM1 组早期细胞凋亡数为 (14.6±2.3)%,si NC 组早期细胞的凋亡数为 (6.3±0.7)%, 差异有统计学意义 (t=4.871,p= 0 04, 图 6) A:si NC 组 ;B:si LETM1 组 # 图 6 流式细胞术检测 LETM1 转染对 SMMC 7721 细胞凋亡的影响 3 讨论 LETM1 是一种线粒体内膜结合蛋白, 其中包含 # 2 个 EF 手, 一个跨膜结构域, 一个亮氨酸拉链和几个卷曲螺旋结构域, 最先发现为 Wolf Hirschhorn 综合征患者中的染色体上缺失的基因之一 [2-3] Wolf Hir schhorn 综合征是由 4 号染色体短臂末端片段缺失引起的一种染色体疾病, 主要临床表现为特殊面容生长迟缓智力低下癫痫和多发畸形 [6] LETM1 是线粒体和核糖体之间形成的络合物的一种锚固蛋白, 编码人类同源酵母线粒体形态相关的 Mdm38 蛋白, Mdm38/LETM1 的缺乏可减少线粒体编码稳态水平的蛋白质, 降低呼吸链中细胞色素 b 和 ATP 的插入, 影响呼吸链的生物合成 [7-8] LETM1 可以调节线粒体的生物合成和翻译系统, 并参与细胞中 Ca 2+ 及 K + 的运输 [9] 随后又有研究表明,LETM1 蛋白在肿瘤细胞浆中通过糖酵解产生能量,LETM1 蛋白高表达诱导线粒体功能障碍, 导致糖酵解的增加, 使 ATP 增加, 进而影响 NADH/NADPH 的比值, 活化人第 10 号染色体缺失的磷酸酶 (phosphataseandtensinhomologdeletedon chromosome10,pten), 进一步激活 PI3K/Akt 信号转导通路, 使 Akt 持续的活化, 从而参与细胞生长凋亡及肿瘤细胞侵袭 [10-11] [12] Lee 等通过质谱分析发现 MATR3 LETM1 ILF2 及 IQGAP2 等可能是 HCC 的潜在的分子靶点本研究结果显示,LETM1 蛋白在肝癌组织中的表 [3] 达水平显著高于癌旁组织这与 Piao 等发现 [4] LETM1 蛋白在宫颈癌中高表达及高爱花等指出 LETM1 蛋白在结肠癌组织中高表达是一致的 LETM1 蛋白在 SMMC 7721 及 HepG2 中的表达相对量均明显高于 LO2(P<0.05) LETM1 不仅在宫颈癌结肠癌三阴性乳腺癌 [13] [14] 头颈部鳞状细胞癌等肿瘤中高表达, 本研究结果显示 LETM1 在肝癌组织也呈高表达我们进而分析了 LETM1 蛋白与临床参数的相关性, 结果显示 LETM1 蛋白表达与肝癌肿瘤直径及门静脉侵犯有关, 而与肝癌患者性别年龄甲胎蛋白 HBsAg Edmondson 分级及 T 分期无关这表明 LETM1 可能参与了肝癌细胞的增殖与侵袭转移在体外研究中进一步对 SMMC 7721 中的 LETM1 基因进行沉默, 观察其对肝癌细胞株的增殖及凋亡的影响 CCK 8 实验中 si LETM1 组较 si NC 组和空白组曲线明显降低 (P<0.01), 说明 LETM1 低表达的肝癌细胞增殖能力明显减弱流式细胞术检测结果显示,si NC 组早期细胞的凋亡数 (6.3±0.7)%, 与 si LETM1 组早期细胞凋亡数 (14.6±2.3)% 比较, 差异

6 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2016,38(17) 1947 有统计学意义 (P<0.01), 说明沉默 LETM1 的肝癌细胞凋亡明显增多综上所述, 本研究表明,LETM1 蛋白在肝癌病程进展中可能发挥了一定的作用, 但 LETM1 在肝癌发生发展中的具体作用机制有待进一步研究参考文献 : [1]ToreLA,BrayF,SiegelRL,etal.Globalcancerstatis tics,2012[j].cacancerjclin,2015,65(2): DOI: /caac [2] NowikovskyK, FroschauerE M, ZsurkaG, etal. The LETM1/YOL027genefamilyencodesafactorofthemito chondrialk + homeostasiswithapotentialroleinthewolf Hirschhornsyndrome[J].JBiolChem,2004,279(29): DOI: /jbc.M [3] PiaoL,LiY,Kim SJ,etal.AsociationofLETM1and MRPL36contributestotheregulationofmitochondrialATP productionandnecroticceldeath[j].cancerres,2009,69 (8): DOI: / CAN [4] 高爱花, 金永民, 孙红花, 等.LETM1 蛋白在结肠癌组织中的表达及临床意义 [J]. 世界华人消化杂志,2014,22 (5): DOI: /wcjd.v22.i5.718 [5] 金艳花, 郑善子, 姜昌镐.LETM1 基因真核表达载体的构建 [J]. 延边大学医学学报,2013,36(4): DOI: /j [6] MisceoD,BaroyT,HeleJR,etal.1.5Mbdeletionof chromosome4p16.3asociatedwithpostnatalgrowthdelay, psychomotorimpairment,epilepsy,impulsivebehavioranda synchronousskeletaldevelopment[j]. Gene,2012,507 (1):85-91.DOI: /j.gene [7] BauerschmitH,MickD U,DeckersM,etal.Ribosome bindingproteinsmdm38andmba1displayoverlappingfunc tionsforregulationofmitochondrialtranslation[j].molbiol Cel,2010,21(12): DOI: /mbc. E [8] NowikovskyK,PozanT,RizutoR,etal.Perspectiveson: SGPsymposium onmitochondrialphysiologyandmedicine: thepathophysiologyofletm1[j].jgenphysiol,2012,139 (6): DOI: /jgp [9] HashimiH,McDonaldL,StribrnaE,etal.Trypanosome Letm1proteinisesentialformitochondrialpotasiumhomeo stasis[j].jbiolchem,2013,288(37): DOI: /jbc.M [10]LiT,WangG.Computer aidedtargetingofthepi3k/akt/ mtorpathway:toxicityreductionandtherapeuticopportu nities[j].intjmolsci,2014,15(10): DOI: /ijms [11]ChengGZ,ParkS,ShuS,etal.AdvancesofAKTpath wayinhumanoncogenesisandasatargetforanti cancer drugdiscovery[j].curcancerdrugtargets,2008,8 (1):2-6.DOI: / [12] LeeY Y,McKinneyK Q,GhoshS,etal.Subcelular tisueproteomicsofhepatocelularcarcinomaformolecular signaturediscovery[j].jproteomeres,2011,10(11): DOI: /pr [13] WangCA,LiuQ,ChenY,etal.Clinicalimplicationof leucinezipper/efhand containingtransmembrane 1overex presionintheprognosisoftriple negativebreastcancer[j]. ExpMolPathol,2015,98(2): DOI: / j.yexmp [14] ChenL,YangY,LiuS,etal.Highexpresionofleucine zipper EF handcontainingtransmembraneprotein1predicts poorprognosisinheadandnecksquamouscelcarcinoma [J].BiomedResInt,2014,2014: DOI: /2014/ ( 收稿 : ; 修回 : ) ( 编辑邓强庭 )

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot