期唐曦胡娅徐炎华等 $#' 通过下调 ( 抑制肺腺癌细胞系 &)#' 的迁移侵袭微小 $%&#'$#' 已被证实是一种抑癌 -/$%& 可参与调控直肠癌乳腺癌卵巢癌等多种肿瘤细胞生长转移和侵袭从而发挥抑制肿瘤进展的作用有研究显示 $#' 在肺腺癌组织中 # 表达减少但尚未

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妤敏
5 years ago
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1 第卷第期年月西安交通大学学报医学版!"#$## %&'&!& 基础研究通过下调抑制肺腺癌细胞系的迁移侵袭唐曦胡娅徐炎华汪春林邱萍王向辉华中科技大学同济医学院附属荆州医院肿瘤科湖北荆州 # 长江大学医学院湖北荆州 # 华中科技大学同济医学院附属荆州医院胸外科湖北荆州 # 摘要目的探索微小 $%&#'$#' 是否通过下调 ( 抑制肺癌细胞系 &)#' 细胞的迁移和侵袭方法转染 $#' 和 $%* 至培养的 &)#' 细胞中 +","-./ 检测 &)#' 细胞中 *0&*0&)( 的表达情况划痕试验和 1-,". 法观察细胞迁移侵袭情况荧光素酶试验验证 ( 是 $#' 的靶基因再通过转染过表达 ( 的质粒至已成功转染 $#' 的 &)#' 细胞中检测 &)#' 细胞中 *0&*0&)( 的表达情况划痕试验和 1-,". 法观察细胞迁移侵袭情况结果与空质粒组比较转染 $#' 的 &)#' 细胞中 *0&*0&)( 的表达减少 )&)#' 细胞的迁移侵袭减少荧光素酶实验结果显示 $#' 能够显著降低 (1$ 质粒的荧光素活性 ) 与 $#' 空质粒组比较转染过表达 ( 质粒的 &)#' 细胞中 *0&*0&) 表达增加 ) 细胞的迁移侵袭增加结论 $#' 可以通过下调 ( 而抑制 &)#' 的迁移和侵袭关键词肺腺癌微小 $%&#'$#'*0&*0&)( 侵袭中图分类号 $# 文献标志码 & )#!"#$%&'"#!(%')&"' 1&% 2 3 3! +&%*! &% 7! 8"-"/9 /./7:7;/!2/,./91/ 7(".*/."7"2!;/ 7 "-,/9""1" /./7:7;/!#(".*/."7" 37;" "-,:7;/!#8"-"/9*-//-!-7"- :7;/!2/,./91/ 7(".*/."7"2!;/ 7 "-,/9 ""1" /./7:7;/!#* *+,-, #'#())#'#"( " *+!&#'#"', #"))#'#&-"" "." ( "( ))#'#-( ""#/.,+0),+0))"*+!))#'#&0# "# *+! #'&,." #. /.,+0),+0))"*+! "#"" "())#' #"#"#'. (&&## *+!." #.."( #'&)/.*+!#"##' ))#'#& #'())#'#"( "*+!&./0 1+ "## #',+0),+0))*+! 收稿日期修回日期 ' 项目基金湖北省教育厅项目 %/ 湖北省卫生厅项目 %/3!/-"6-/"/92!"8"-"/9!/ %/6-/"/92!"8"-"/92".%/3 通讯作者胡娅.!,/ 优先出版 ",".''$#.

2 期唐曦胡娅徐炎华等 $#' 通过下调 ( 抑制肺腺癌细胞系 &)#' 的迁移侵袭微小 $%&#'$#' 已被证实是一种抑癌 -/$%& 可参与调控直肠癌乳腺癌卵巢癌等多种肿瘤细胞生长转移和侵袭从而发挥抑制肿瘤进展的作用有研究显示 $#' 在肺腺癌组织中 # 表达减少但尚未有研究报道 $#' 影响肺腺癌的进展以及具体机制我们在前期研究利用 1-7", 软件预测 $#' 潜在的靶点为 ( 本研究采用目前常用的肺腺癌细胞系 &)#' 细胞用 $#' 干预并观察 &)#' 细胞迁移侵袭能力改变检测与细胞迁移侵袭能力密切相关的 *0& 和 *0&) 蛋白的表达变化并进一步验证 $#' 是否通过靶向抑制 ( 的表达而抑制 &)#' 细胞的迁移和侵袭材料与方法主要试剂 &)#' 细胞购于上海拜力生物公司 8(( 培养液胰蛋白酶 7 公司胎牛血清 5* 公司限制性内切酶 2 1#8%& 连接酶 $%& 提取试剂 5-/7" 公司 1<$ 逆转录试剂盒大连宝生物公司 3$ -"" 荧光染料试剂盒 $/" 公司无内毒素质粒小大提取试剂盒兔或鼠抗人 *0&*0&) ( 多克隆抗体 & 公司脂质体上海英骏公司 8&65$/" 公司 (11 -",/ 公司辣根过氧化酶标记的山羊抗兔或者抗鼠二抗 51* 标记的山羊抗兔 57:,/ 公司 +", "- /. 相关试剂江苏碧云天生物技术研究所转染及分组首先构建过表达质粒 $#' 由上海吉玛公司设计合成 $#' 序列正义链 )&&&&&*******&& & 反义链 **&**&&* )( 过表达质粒由上海吉玛公司设计合成通过 6!" 查找 ( 基因序列引物根据 " 中 ( $%& 序列设计引物其上游引物 )&1&*1&11&&***&*1 下游引物 )1**&&11*&&1&1 1( 基因和质粒 8%& 连接后筛选重组质粒并测序验证后进行重组质粒转染 $#' 转染 &)#' 细胞并分为空白对照组过表达 $#' 组和空质粒组再用过表达 ( 的质粒转染已经转染 $#' 的 &)#' 细胞后将细胞分为过表达 $#' 组过表达 $#' 空质粒组过表达 $#'( 组将 &)#' 细胞系接种至孔板生长融合至 )== 时以脂质体分别转染 $#' 或对照 ( 过表达质粒或空质粒各 /.# 后提取总 $%& 蛋白后 6*$+","-./ 鉴定转染效率并进行后续实验荧光定量,- 检测基因表达提取细胞总 $%& 并逆转录成 8%& 反应体系为 0 反应条件为 > #) > ) >) 用 3$ -"" 法检测 $#' 的表达反应条件为 '#>) '#>,>,>, 共循环 # 次最后 > 延伸每组样品个复孔实验重复次统计分析各标本中 $#' 的表达细胞划痕实验 () %&' 检测细胞迁移 &)#' 细胞先用 /.0 羟基脲作用以抑制细胞增殖 0 枪头垂直孔板作细胞划痕弃细胞培养液 6 冲洗孔板次继续培养细胞并于 # 拍照记录用 57"6-/6.!, 软件分析计算细胞迁移率以迁移面积和原划痕面积比值表示各组 &)#' 的迁移率,#(%& 法检测细胞迁移 &)#' 细胞先用无血清饥饿培养使细胞同步化 /.0 羟基脲作用用以抑制细胞增殖用 )70 胰蛋白酶消化 &)#' 细胞后用 8(( 培养基 00 血清配成细胞悬液并计数 )? # 个 0 各组 # 孔板配套 1-,". 小室上室加入 0 细胞悬液下室加入含有 00 的培养液 )0 培养以棉签擦去上层未穿透膜的 &)#' 细胞取下 1-,". 半透膜 6 洗次用 70 多聚甲醛室温固定 ) 再 6 洗次用 70 的 8&65 染核 6 洗次荧光显微镜下每组随机取 ) 个视野观察计数并记录穿膜细胞数 1%#"%!&" 检测蛋白表达提取细胞总蛋白 *& 法定量 86& 胶每孔加入 0 进行蛋白电泳并用孔径 #) 的 6@8 膜 )&' 转膜转膜后常温下 11 洗膜次封闭后加入兔鼠抗人 *0& 一抗或抗 *0&)( 一抗 A 稀释 #> 孵育过夜常温下 11 洗膜次辣根过氧化物酶标记羊抗兔鼠二抗孵育后 *0 化学发光法检测柯达胶片暗室显影 4! " 软件分析荧光素酶实验设计合成 (1$ 的序列及突变序列以 ( 质粒为载体分别构建能够表达荧光素酶的包含 (1$ 和 (1$ 突变序列的质粒然后将 &)#' 细胞系按每孔? ) 接种至 # 孔板 # 后以脂质体共转染 7 包含 (1$ 或 (1$ 突变序列的荧光素

结果 #' 转染 &)#' 细胞后实时荧光定量 6*$ 检测结果显示 $#' 组中 $#'

+1 (1$ 组荧光素酶活性显著低于 -." 对照 +1(1$ 组图 +","-.

* 过表达可以逆转抑制细胞迁移侵袭的作用过表达 ( 的质粒转染 &)#' 细胞后 (

3 西安交通大学学报医学版第卷酶质粒和 7 海肾荧光质粒以及 /.$#' 或对照 # 后用荧光检测仪检测荧光强度海肾荧光作为内参照每组实验重复次统计学处理用 6 软件统计分析数据实验数据以 B 表示两组间均数比较用检验多组间均数比较用单因素方差分析 " &%@& 两两比较用 08 检验 ) 为差异有统计学意义结果 #' 转染 &)#' 细胞后实时荧光定量 6*$ 检测结果显示 $#' 组中 $#' 的表达较对照组和空质粒组明显升高图 &$#' 转染 &)#' 细胞组较对照组和空质粒组的 &)#' 的迁移减少侵袭能力降低均图 *+","-./ 结果显示与空白对照组和空质粒组比较 $#' 组 &)#' 细胞中 *0& *0&) 细胞侵袭迁移相关蛋白的表达减少图 8 对细胞侵袭迁移的影响 $ 图抑制细胞的侵袭和迁移 7$#'"&)#'7-/,/ & 各组细胞中 $#' 的相对表达情况干预 # 后各组细胞的迁移情况 * 干预 # 后各组细胞穿透 1-,". 小室情况 8 各组细胞中 *0&*0&) 蛋白的表达情况与空质粒组比较通过识别 23, 抑制的表达分别构建包含 (1$ 和其突变序列的荧光素酶质粒图 & 与 $#' 或者空质粒对照共转染 &)#' 细胞培养 # 后各组细胞荧光素酶活性检测结果显示 $#' +1 (1$ 组荧光素酶活性显著低于 -." 对照 +1(1$ 组图 +","-./ 结果显示与空白对照组和空质粒组比较 $#' 组 &)#' 细胞中 ( 的表达明显降低图 * 过表达可以逆转抑制细胞迁移侵袭的作用过表达 ( 的质粒转染 &)#' 细胞后 ( 表达较空质粒组增加图 &$#'( 组中 &)#' 的迁移增和侵袭较 $#' 组和 $#' 空质粒组增加图 *+","-./ 结果显示 $ #'( 组 &)#' 细胞中 *0&*0&) 表达较 $#' 组和 $#' 空质粒组增加图 8

从而调控多种肿瘤的发生发展 6&0&% 等研究发现 $#' 在结肠癌组织中表达减少

4 期唐曦胡娅徐炎华等 $#' 通过下调 ( 抑制肺腺癌细胞系 &)#' 的迁移侵袭 ' 讨论侵袭转移是恶性肿瘤的基本生物学特征不仅与肿瘤细胞的侵袭性增强粘附能力下降有关还与肿瘤的血管生成细胞外基质的降解及间质重构等密切 ) 相关因此抑制肿瘤细胞侵袭迁移对临床治疗肿瘤有重要意义 -/$%&, 是一类在进化上高度保守的小分子非编码单链 $%& 目前越来越多的证据表明 -/$%&, 参与了对肿瘤细胞迁移侵袭的调控 $#' 是一种抑癌 -/$%& 可调节多种与肿瘤生长侵袭转移调节有关的抑癌基因或蛋白从而调控多种肿瘤的发生发展 6&0&% 等研究发现 $#' 在结肠癌组织中表达减少并进一步通过细胞实验证实 $#' 可以抑制结肠癌细胞的增殖 (&1&(&0& 等研究结果显示 $#' 可以通过下调 $*& 基因从而抑制三阴性乳腺癌图通过识别 23, 抑制的表达 7 $#'"("-",,/ -7"7 1$ &$#' 识别 ( 的 1$ 荧光酶素报告基因显示 $#' 组荧光素酶活性降低 *+","-./ 结果显示 $#' 可以抑制 &)#' 细胞中 ( 的表达与空质粒组相比细胞的增殖与迁移同样的 05 等通过用 $ #' 干预卵巢癌细胞发现 $#' 可以抑制卵巢癌细胞增殖并进一步阐明其机制可能通过靶向抑制基因与上述研究结果相符本研究通过用 $#' 干预 &)#' 细胞发现 $#' 可以抑制 &)#' 细胞的迁移和侵袭 *0& 和 *0&) 可以促 ' 进肿瘤细胞的迁移和侵袭已被大量的研究所证实图过表达增加细胞的侵袭和迁移 7"-"-",,"(-","&)#'7-/,/ &+","-./ 检测转染后 &)#' 细胞中 ( 的表达干预 # 后各组细胞的迁移情况 * 干预 # 各组细胞的侵袭情况 8 各组细胞中 *0&*0&) 蛋白的表达情况与 $#' 空质粒组相比

5 西安交通大学学报医学版第卷本研究结果显示 $#' 可以减少 &)#' 细胞中 *0& 和 *0&) 的表达进一步证实 $#' 具有抑制 &)#' 细胞迁移和侵袭的作用 ( 属于基因家族之一在细胞凋亡增殖 8%& 损伤以及肿瘤形成等许多病理生理过程都具有重要作用既往研究结果显示在多种肿瘤组 #) 织中 ( 基因的表达都增加 % 和的研究都发现 ( 基因的表达与多发性骨髓瘤以及结肠癌患者预后相关 ( 可以作为肿瘤治疗的一个靶向位点此外 5%*25 等研究结果显示 $# 可以通过靶向抑制 ( 的表 ' 达而抑制膀胱癌细胞的增殖与此同时 1&% 等发现 $) 可以通过下调 ( 的表达而抑制乳腺癌细胞的上皮间叶细胞转化 ""../ ",".-,/ (1 过程在前期研究中我们利用 1-7", 网站预测 ( 是 $ #' 潜在的靶点鉴于 ( 在肿瘤细胞增殖侵袭中的重要性本实验用 $#' 干预 &)#' 细胞后检测发现 ( 表达减少之后我们通过荧光素酶实验发现 $#' 可以与 ( 的 1$ 靶向结合证实 $#' 可以靶向抑制 ( 的表达在此基础上我们进一步用 ( 过表达质粒转染 &)#' 细胞发现 ( 过表达质粒的转染可以逆转 $#' 抑制 &)#' 迁移侵袭的作用最终证实 $#' 是通过下调 ( 的表达从而发挥抑制 &)#' 细胞迁移侵袭的作用本实验通过用 $#' 干预 &)#' 细胞发现 $#' 可以抑制 &)#' 细胞的迁移和侵袭并进一步通过荧光素酶和转染过表达 ( 质粒的方法证明其机制是通过靶向抑制 ( 的表达为肺腺癌的治疗提供了新的思路参考文献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编辑国荣

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽