胃肠病学 2014 年第 19 卷第 8 期 459 PKM2expresioninhumangastricadenocarcinomacellineSGC 7901cels,therebyinhibitscelproliferationandglycolysis. Keywords Stomach

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1 458 ChinJGastroenterol,2014,Vol.19,No 8 sirna 沉默 PKM2 抑制人胃腺癌 SGC 7901 细胞 增殖能力和糖酵解水平 # 朱珠陈敏张晓琦张斌丁希伟杨燕邹晓平 南京大学医学院附属鼓楼医院消化科 (210008) 背景 :M2 型丙酮酸激酶 (PKM2) 在肿瘤组织中呈特异性高表达, 与肿瘤的生长和糖酵解水平密切相关, 是潜在的治疗靶点 目的 : 探讨 sirna 沉默 PKM2 对胃癌 SGC 7901 细胞增殖 凋亡 迁移 侵袭以及糖酵解水平的影响 方法 : 选择未转染 SGC 7901 细胞 转染空质粒 pu6sgc 7901 细胞以及转染 PKM2siRNA 的 SGC 7901 细胞, 采用蛋白质印迹法和 Real timepcr 检测 PKM2mRNA 和蛋白表达 ; 免疫荧光法检测 PKM2 在细胞内的表达和分布 ;CCK 8 法 流式细胞分析 细胞迁移和细胞侵袭实验检测细胞增殖 凋亡 迁移以及侵袭能力 ; 蛋白质印迹法 分光光度法分别检测葡萄糖转运蛋白 1(Glut 1) 乳酸脱氢酶 A(LDHA) 蛋白表达以及葡萄糖 乳酸浓度 乳酸脱氢酶 (LDH) 活性 结果 : 与其余两组相比,PKM2siRNA 转染组细胞 PKM2mRNA 和蛋白表达明显下降 (P<0.05), 胞内表达明显减弱, 细胞增殖 迁移和侵袭能力明显下降, 细胞凋亡明显增加 (P<0.05),Glut 1 LDHA 蛋白表达明显下降 (P< 0.05), 葡萄糖摄取率 乳酸产量 LDH 活性明显减低 (P<0.05) 结论:RNA 干扰能抑制胃癌 SGC 7901 细胞 PKM2 mrna 和蛋白表达, 进而抑制胃癌细胞的增殖能力和糖酵解水平 关键词 胃肿瘤 ; 细胞增殖 ; 有氧糖酵解 ; RNA 干扰 ; M2 型丙酮酸激酶 SilencingPKM2bysiRNA InhibitsProliferationandGlycolysisofHumanGastricAdenocarcinomaCelLine SGC 7901 ZHUZhu,CHENMin,ZHANGXiaoqi,ZHANGBin,DINGXiwei,YANGYan,ZOUXiaoping.Department ofgastroenterology,nanjingdrum TowerHospital,theAfiliatedHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing (210008) Correspondenceto:ZOUXiaoping, @163.com Background:PyruvatekinaseM2(PKM2),whichishighlyexpresedincancercels,playsanimportantrolein cancercelgrowthandaerobicglycolysisandisapromisingtargetforcancertherapy.aims:toinvestigatetheefectof silencingpkm2bysirnaonproliferation,apoptosis,migration,invasionandglycolysisofgastriccancercellinesgc 7901cels.Methods:SGC 7901celsweredividedintothreegroups:non transfectdsgc 7901cels,SGC 7901cels transfectedwithemptyplasmidandscg 7901celstransfectedwithPKM2siRNA.ExpresionofPKM2wasdetectedby fluorescentquantitativepcrandwesternblotingatmrnaandproteinlevels.intracelularexpresionanddistributionof PKM2wasdeterminedbyimmunofluorescence.CCK 8asay,flowcytometry,migrationandinvasionexperimentwereused toasescelproliferation,apoptosis,migrationandinvasion,respectively.westernblotingwasusedtodeterminethe expresionofglucosetransporter 1(Glut 1)andlactatedehydrogenaseA(LDHA).Spectrophotometrywasusedtodetect levelsofextracelularglucoseandlacticacidandintracelularlactatedehydrogenase(ldh).results:comparedwithnon transfectedgroupandnegativecontrol(emptyplasmid)group,pkm2mrna andproteinexpresionsweresignificantly decreasedinpkm2sirnaplasmidtransfectedgroup(p<0.05).intracelularexpresionofpkm2wasmarkedlydecreased inpkm2sirna cels.aftertransfectedwithpkm2sirna plasmid,celproliferation,migrationandinvasionwere significantlyinhibited,andcelapoptosiswasincreasedsignificantly(p<0.05).expresionsofglut 1andLDHAwere down regulatedinpkm2silencedcels(p<0.05).glucoseuptake,lacticacidproductionandldh activitieswere significantlydecreasedinpkm2silencedcels(p<0.05).conclusions:rnainterferencetargetingpkm2geneinhibits DOI: /j.isn 本课题由国家自然科学基金青年项目 ( ) 国家自然科学基金面上项目 ( ) 南京市卫生青年人才培养工程 ( 第三层次 ) 中央高校基本科研业务费小额项目 ( ) 资助 # 本文通信作者, @163.com

2 胃肠病学 2014 年第 19 卷第 8 期 459 PKM2expresioninhumangastricadenocarcinomacellineSGC 7901cels,therebyinhibitscelproliferationandglycolysis. Keywords StomachNeoplasms; CelProliferation; AerobicAlycolysis; RNA Interference; Pyruvate KinaseM2 肿瘤细胞不同于正常细胞, 即使在氧气充足的条件下, 仍主要依赖糖酵解代谢, 消耗大量葡萄糖并产生乳酸, 肿瘤细胞这种活跃的有氧糖酵解代谢特性被称为 Warburg 效应 [1] 研究显示 M2 型丙酮酸激酶 (pyruvatekinasem2,pkm2) 在大多数的肿瘤细胞中高表达 近年来, 随着肿瘤代谢机制的深入研究, 关于 PKM2 的研究成为热点 大量研究证实 PKM2 与肿瘤的发生发展密切相关 [2] 然而, PKM2 在胃癌细胞中的作用尚不明确 本研究通过 RNA 干扰技术沉默人胃癌细胞株 SGC 7901 中 PKM2 的表达, 观察对胃癌细胞体外增殖 凋亡 迁移 侵袭以及糖酵解水平的影响, 旨在为 PKM2 成为胃癌临床治疗的潜在靶点提供理论依据 材料与方法一 细胞株和主要试剂人胃腺癌中分化细胞株 SGC 7901 人胃腺癌低分化细胞株 BGC 823 由南京鼓楼医院肿瘤科惠赠, 人永生化胃黏膜上皮细胞株 GES 1 人宫颈癌细胞株 HeLa 为本实验室所保存 PKM2siRNA 干扰质粒 ( 上海吉凯基因化学技术有限公司 ), 兔抗人 PKM2(D78A4)XP 单克隆抗体 兔抗人 β actin (13E5) 单克隆抗体 (CelSignalingTechnology 公司 ), 山羊抗兔二抗 ( 杭州联科生物技术有限公司 ), AlexaFluor 594 山羊抗兔 IgG(H+L)(Invitrogen 公司 ),DAPI 葡萄糖检测试剂盒 (Sigma Aldrich 公司 ),CCK 8 细胞增殖 / 细胞毒性检测试剂盒 [ 东仁化学科技 ( 上海 ) 有限公司 ],AnnexinV PE/7 AAD 细胞凋亡检测试剂盒 (ebioscience 公司 ),Matrigel (BD 公司 ),Transwel 小室 (Corning 公司 ), 乳酸试剂盒 ( 南京建成生物工程研究所 ), 乳酸脱氢酶 (LDH) 细胞毒性检测试剂盒 ( 碧云天生物技术研究所 ) 二 方法 1. 细胞培养 :SGC 7901 BGC 823 GES 1 HeLa 细胞以含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培养基培养于 5% CO 2 37 恒温细胞培养箱内, 常规消化传代, 取对数生长期细胞进行实验 2.siRNA 转染 : 取对数生长期 SGC 7901 细胞接种于 6 孔板, 待细胞密度达 80% 左右准备转染 按 Lipofectamine TM 2000 转染试剂说明书, 分别转染空载体 pu6 质粒 ( 空载体组 ) 和 PKM2siRNA 干扰质粒 (PKM2siRNA 组 ), 以 400μg/mLG418 培养液进行高转染效率细胞株筛选 2 周, 收集细胞进行后续实验 3. 蛋白质印迹法检测 PKM2 蛋白 糖酵解相关基因表达 :1 收集对数生长期 SGC 7901 BGC 823 GES 1 HeLa 细胞 ;2 常规培养未转染组 空载体组 PKM2 sirna 组细胞,48h 收集细胞 预冷 PBS 洗涤 2 次, 加蛋白裂解液冰上裂解, g 离心 10min, 取上清, 行蛋白定量检测 取 30μg 总蛋白上样,SDS PAGE 电泳分离 1~2h, 蛋白转移至 PVDF 膜,5% BSA 封闭 2h, 加入 稀释的 PKM2 葡萄糖转运蛋白 1(Glut 1) 乳酸脱氢酶 A (LDHA) 一抗,4 孵育过夜,TBST 洗涤, 加入山羊抗兔二抗孵育 2h,TBST 洗涤, 暗室曝光, 扫描图像, QuantityOne4.6.2 凝胶定量软件分析目的蛋白相对表达量 实验重复 3 次, 结果取平均值 4.Real timepcr 检测 PKM2mRNA 表达 : 取未转染组 空载体组 PKM2siRNA 组 SGC 7901 细胞, 加入 1mLTrizol 提取总 RNA 按 TakaraPCR 逆转录试剂盒说明书合成 cdna 采用 SYBRGreen 荧光法定量检测 PKM2mRNA 表达,qPCR 引物序列由 Invitrogen 公司合成 PKM2 引物上游 :5 AGTACC ATGCGGAGACCATC 3, 下游 :5 GCGTTATCC AGCGTGATTTT 3 ; 以 β actin 作为内参照, 引物上游 :5 CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT 3, 下游 : 5 AGCACTGTGTTGGCGTACAG 3 每组设 3 个复孔, 每次实验至少重复 3 次, 所得结果以 2 - Ct 法分析 5. 免疫荧光法检测 PKM2 在细胞内的表达和分布 : 将空载体组 PKM2siRNA 组细胞接种于 24 孔板 (10 5 / 孔,0.5mL), 常规培养 48h PBS 洗涤, 4% 多聚甲醛固定 15min, 山羊血清封闭 1h, 加入 稀释的 PKM2 一抗孵育过夜,PBS 洗涤, 加入

3 460 ChinJGastroenterol,2014,Vol.19,No 8 荧光二抗孵育 1h, 加入 DAPI(2μg/mL) 染核 5min,1h 内于荧光显微镜下观察 拍照 6.CCK 8 法检测细胞增殖 : 将未转染组 空载体组 PKM2siRNA 组细胞接种于 96 孔板, 每组设 4 个复孔, 设置空白孔, 培养 24 或 48h 后, 每孔加入 10μLCCK 8, 混匀后孵育 1h, 于酶标仪 450nm 波长处读取吸光度值 (A 值 ), 细胞相对增殖率 = (A 实验组 -A 空白组 )/(A 对照组 -A 空白组 ) 100% 7. 流式细胞分析检测细胞凋亡 : 将未转染组 空载体组 PKM2siRNA 组细胞培养 48h, 每组设 3 个复孔 收集细胞, 按 AnnexinV PE/7 AAD 细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作, 以流式细胞仪检测细胞凋亡 8. 细胞迁移 侵袭能力检测 : 取胰酶消化空载体组和 PKM2siRNA 组细胞, 调整细胞密度至 /ml 对于细胞侵袭, 需先用 Matrigel1 8 稀释液 30μL 包被上室面 将小室放置于 24 孔板, 下室添加 500μL 含 10% 胎牛血清的培养基 取细胞悬液 200μL 加入 Transwel 小室, 常规培养 24h 取出 Transwel 小室用 PBS 清洗, 甲醇固定 15min,PBS 清洗, 湿棉签小心擦去小室表面细胞 每孔加入 500μL0.1% 结晶紫, 室温 30min,PBS 清洗, 倒置风干 每组细胞设立 3 个平行复孔, 实验重复 3 次 9. 分光光度法检测细胞外葡萄糖 乳酸浓度以及细胞内 LDH 活性 : 将未转染组 空载体组 PKM2 sirna 组细胞培养 48h, 每组设 3 个复孔 收集细胞和培养基, 参照试剂盒说明书检测培养基中葡萄糖 乳酸浓度和细胞内 LDH 活性 三 统计学分析应用 SPSS17.0 软件, 计量资料以 x±s 珋表示, 两组间比较采用 t 检验, 多组间比较采用单因素方差分析, 多组间两两比较采用 SNK q 检验,P<0.05 为差异有统计学意义 结果一 PKM2 在人胃腺癌细胞中呈高表达 PKM2 在 GES 1 细胞中呈相对低表达, 在 SGC 7901 BGC 823 HeLa 细胞中呈高表达 ( 图 1) PKM2 在不同细胞株中的表达差异有统计学意义 (P<0.05) 本实验选取人胃腺癌 SGC 7901 细胞 作为研究对象 二 验证 PKM2siRNA 的干扰效果 1.PKM2siRNA 转染 SGC 7901 细胞对 PKM2 mrna 和蛋白表达的影响 : 用 Real timepcr 蛋白质印迹法分别验证 sirna 干扰 PKM2 后 mrna 蛋白表达, 结果显示 PKM2siRNA 组与未转染组和空载体组相比,PKM2mRNA 蛋白表达明显降低 (P< 0.05)( 图 2 图 3) P<0.05 图 2 三组细胞中 PKM2mRNA 表达 2.PKM2 sirna 转染 SGC 7901 细胞后对 PKM2 蛋白定位表达的影响 : 免疫荧光法检测可见细胞内 PKM2 蛋白定位发生变化 PKM2siRNA 转染前 PKM2 蛋白主要定位于细胞质, 而转染后细胞内 PKM2 蛋白明显减弱 ( 图 4), 提示 PKM2siRNA 靶向干扰的有效性 三 转染 PKM2siRNA 对 SGC 7901 细胞增殖的影响细胞培养 24h 后,PKM2siRNA 组较未转染组和空载体组细胞增殖能力明显降低 (P<0.05), 且随着培养时间延长, 差异更为显著 (P<0.05)( 图 5), 提示 PKM2 可促进 SGC 7901 细胞增殖 四 转染 PKM2siRNA 对 SGC 7901 细胞凋亡的影响流式细胞仪检测显示, 未转染组 空载体组 PKM2siRNA 组细胞早期凋亡率分别为 (4.82± 1.39)% (7.16±1.43)% (27.03±1.46)%( 图 6) PKM2siRNA 组细胞早期凋亡率明显高于未转染组和空载体组 (P<0.05), 提示 PKM2 有抑制胃癌细胞早期凋亡的作用 五 转染 PKM2siRNA 对 SGC 7901 细胞迁移和侵袭能力的影响

4 胃肠病学 2 14年第 19卷第 8期 461 图 1 不同细胞株 PKM2蛋白的表达 蛋白质印迹法 P 5 图 3 三组细胞中 PKM2蛋白表达 蛋白质印迹法 图 4 PKM2s RNA转染 SGC 791细胞后对细胞内 PKM2蛋白定位变化的影响 免疫荧光法 2 PKM2s RNA组较空载体组迁移和侵袭的细胞 LDH活性 结果显示 PKM2s RNA组细胞葡萄糖摄 数目明显减少 组间差异有统计学意义 P 5 取率 乳酸产量 LDH活性较未转染组 空载体组细 图 7 提示 PKM2可促进 SGC 7 9 1细胞的迁移 胞明显减低 P 5 图 8B D 侵袭 六 转染 PKM2s RNA对 SGC 7 9 1有氧糖酵解 的影响 未转染组 空载体组 PKM2s RNA组细胞培养 48h 提取总蛋白检测 结果显示 PKM2s RNA组较 未转染组 空载体组细胞的 Gl ut 1和 LDHA蛋白表 达水平明显降低 P 5 图 8A 未转染组 空载体组 PKM2s RNA组细胞培养 48h 检测细胞液内葡萄糖 乳酸浓度以及细胞内 P 5 图 5 PKM2s RNA转染对 SGC 791细胞增殖的影响

5 Ch njga s t r o e n t e r o l 2 14 Vo l 1 9 No 8 462 图 6 PKM2s RNA转染对 SGC 791细胞凋亡的影响 流式细胞术 A 光镜下观察穿透小室细胞数目 结晶紫染色 1 B 柱形图 图 7 PKM2s RNA转染对胃癌 SGC 791细胞迁移和侵袭的影响 P 5 A 三组蛋白表达水平 蛋白质印迹法 B 三组葡萄糖摄取率 C 三组乳酸产量 D 三组 LDH活性 图 8 PKM2s RNA转染对 SGC 791细胞有氧糖酵解的影响 路中最 后 一 个 限 速 酶 催 化 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 讨 论 PEP 去磷酸化 产生丙酮酸和 ATP PK在哺乳动 物中存在 四 种 亚 型 PKL PKR PKM1以 及 PKM2 丙酮酸激酶 p y r u v a t ek na s e PK 是糖酵解通 PKM2主要表达于胚胎组织以及高增殖细胞 尤其

6 胃肠病学 2014 年第 19 卷第 8 期 463 是肿瘤细胞中 PKL/R/M1 在体内主要以稳定的高活性的四聚体形式存在, 而 PKM2 在体内可以三种形式存在, 单体 二聚体和四聚体 PKM2 在肿瘤细胞中主要以低活性的二聚体形式存在 [3], 可以单体形式移位至细胞核, 调控细胞周期进展和 Warburg 效应 [4] 细胞增殖对于碳骨架和 NADPH 的需求远远高于对 ATP 的需求, 低活性的 PKM2 可以为肿瘤细胞提供充分的代谢中间产物用于糖酵解旁路如磷酸戊糖途径 [5] PKM2 可以平衡肿瘤细胞生长和能量供给的关系, 是肿瘤细胞增殖的开关和增殖的速度调节器 [6] PKM2 除了作为糖酵解酶主要定位于细胞质外, 在某些情况下, 可以单体形式迁移入细胞核 人肿瘤细胞表皮生长因子受体 (EGFR) 活化可诱导 PKM2 向核内转移, 与 β catenin 结合, 促进细胞周期蛋白 D1 和 c Myc 表达 [7] 此外,PKM2 在核内有蛋白激酶的功能, 能在 705 酪氨酸位点磷酸化 STAT3, 促进 MEK5 转录激活 [8] ; 与组蛋白 H3 结合, 磷酸化 11 位点的苏氨酸, 促进 HDAC3 从 CCND1 和 MYC 基因启动子解离, 促进细胞周期蛋白 D1 和 c Myc 表达, 进而促进肿瘤细胞生长, 加速细胞周期进程和肿瘤的发生 [9] 本实验利用 RNA 干扰技术沉默胃癌 SGC 7901 细胞 PKM2 后, 细胞增殖 抗凋亡 迁移以及侵袭能力明显减弱, 糖酵解相关基因 Glut 1 LDHA 表达明显受抑制, 葡萄糖摄取率 LDH 活性以及乳酸产量明显减低, 提示 PKM2 与胃癌发生发展以及糖酵解密切相关 实验选取 PKM2 较 GES 1 细胞表达轻度偏高的胃癌 SGC 7901 细胞作为研究对象, 提示 PKM2 轻度升高即可以对肿瘤生长和代谢起到重要作用 PKM2 在胃癌不同分化程度的细胞株中表达有显著的差异, 肿瘤代谢的差异可能是导致其不同分化程度以及增殖 转移能力的原因之一, 有待进一步研究证实 随着 PKM2 在肿瘤代谢 进展中的作用逐渐被认识, 有关 PKM2 的研究也逐渐深入 肿瘤细胞有多种方式调节 PKM2 表达和活性, 包括转录水平的调节, 选择性剪切, 翻译后修饰, 变构调节等, 以利于肿瘤细胞的生长 [10 11] 此外,PKM2 作为一种蛋白激酶, 可间接调控其他代谢酶和细胞周期相关蛋白, 其在胃癌发生 发展中起着重要作用 PKM2 sirna 的可能作用机制是通过影响糖酵解, 打破细胞供能与生物大分子合成的平衡, 或是抑制了细胞周期蛋白和 c Myc 的表达, 也可能存在其他仍不明确的机制, 需进一步研究 总之,PKM2 有望成为胃癌治疗的潜在靶点之一 参考文献 1 WarburgO.Ontheoriginofcancercels[J].Science,1956, 123(3191): MazurekS,BoschekCB,HugoF,etal.Pyruvatekinase typem2anditsroleintumorgrowthandspreading[j]. SeminCancerBiol,2005,15(4): MazurekS.PyruvatekinasetypeM2:akeyregulatorwithin thetumourmetabolomeandatoolformetabolicprofilingof tumours[j].ernstscheringfoundsympproc,2007, (4): YangW,ZhengY,XiaY,etal.ERK1/2 dependent phosphorylation and nuclear translocation of PKM2 promotesthewarburgefect[j].natcelbiol,2012,14 (12): VanderHeidenMG,CantleyLC,ThompsonCB.Understanding thewarburgefect: themetabolicrequirementsofcel proliferation[j]. Science, 2009, 324 (5930): MazurekS.PyruvatekinasetypeM2:akeyregulatorofthe metabolicbudgetsystemintumorcels[j].intjbiochem CelBiol,2011,43(7): YangW,XiaY,JiH,etal.NuclearPKM2regulatesbeta catenintransactivationuponegfractivation[j].nature, 2011,480(7375): GaoX,WangH,YangJJ,etal.PyruvatekinaseM2 regulatesgenetranscriptionbyactingasaproteinkinase [J].MolCel,2012,45(5): YangW,XiaY,HawkeD,etal.PKM2phosphorylates histone H3 and promotes gene transcription and tumorigenesis[j].cel,2012,150(4): ChanetonB,HilmannP,ZhengL,etal.Serineisa naturalligandandalostericactivatorofpyruvatekinasem2 [J].Nature,2012,491(7424): KelerKE,TanIS,LeeYS.SAICARstimulatespyruvate kinaseisoform M2andpromotescancercelsurvivalin glucose limited conditions[j]. Science, 2012, 338 (6110): ( 收稿 ; 修回 )

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