第 期 焦霞 等 上调! 基因表达对肺腺癌细胞增殖与凋亡的影响 性肿瘤的发生发展 转移及血管形成 有望成为候选抑癌基因 但目前对其抑制肿瘤进展的具体机制尚不完全明了 本实验采用脂质体介导的稳定转染 将! 导入人肺腺癌, 细胞 经 1 筛选后获得稳定高表达! 的, 细胞克隆 观察该转基因细胞克隆 +

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1 第 卷第 期 年 月 江苏大学学报 医学版!"#$%&#'#'$ #($ 上调! 基因表达对肺腺癌细胞增殖与凋亡的影响 焦霞 朱晓蔚 李顺龙 戴桂红 蒋小芹 姚娟 肖蔚 于鸿 泰州市人民医院 病理科 普外科 肿瘤科 江苏泰州 摘要 目的 建立稳定转染 7% 下游调节基因 7%' $#7#$#' ##;01 的, 细胞株 探讨! 对, 细胞增殖与凋亡的影响及其可能的分子机制 方法 经脂质体介导将含有! 的重组表达质粒转染人肺腺癌, 细胞株 采用 1 筛选阳性细胞克隆并进行实时荧光定量 +/00+/0 蛋白质印迹鉴定 0+/0 和蛋白质印迹检测阳性细胞克隆 + 及鼠双微体基因 7#'9#7$#&;& 的表达 & 比色法检测阳性细胞克隆的增殖活性 流式细胞仪检测阳性细胞克隆凋亡率 结果 成功建立高表达 ;01 的阳性, 细胞克隆 细胞 + 表达及细胞凋亡率显著增高 而 &;& 表达及细胞增殖显著降低 结论 上调, 细胞 ;01 表达后 细胞凋亡增加而细胞增殖降低 其作用机制可能与 + 表达增高而 &;& 表达降低有关 关键词 7% 下游调节基因 + 鼠双微体基因 细胞增殖 细胞凋亡 中图分类号 0 文献标志码, 文章编号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下游调节基因 7%' $#7# $#' ##;01 作为近年来新发现的! 基 因家族成员 不仅与细胞增殖和分化密切相关 而且参与抑制乳腺癌 宫颈癌 食管癌 膀胱癌等多种恶 基金项目 江苏省六大人才基金资助项目 = 作者简介 焦霞 女 江苏泰州人 硕士 主治医师 主要从事肺肿瘤研究 李顺龙 通讯作者 副主任医师 7%*: 87 共同第一作者

2 第 期 焦霞 等 上调! 基因表达对肺腺癌细胞增殖与凋亡的影响 性肿瘤的发生发展 转移及血管形成 有望成为候选抑癌基因 但目前对其抑制肿瘤进展的具体机制尚不完全明了 本实验采用脂质体介导的稳定转染 将! 导入人肺腺癌, 细胞 经 1 筛选后获得稳定高表达! 的, 细胞克隆 观察该转基因细胞克隆 + 鼠双微体基因 7#'9#7$# &;& 表达及细胞增殖 凋亡的改变 并探讨! 对, 细胞生物学特征影响的可能分子机制 材料与方法 主要材料 (;,;01 重组真核表达质粒由日本久留米大学医学部 &%7 博士馈赠 人肺腺癌, 细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所 无血清培养液 0+&- 胎牛血清均购自美国 19 公司 # 试剂盒 1 试剂 3( #$7# 转染试剂盒购自德国 0*# 公司 2/, 蛋白检测试剂盒及硝酸纤维素膜购自美国 - "$# 公司 &;3 ;, 标准参照物, #)?-/ 试剂盒购自美国 7 公司 /3 化学发光试剂盒购自美国 $/ 公司 鼠抗人 ;01 鼠抗人 + 鼠抗人 &;& 单克隆抗体购自丹麦 ;< 公司 +/0 引物由上海生工生物有限公司合成 细胞转染及阳性克隆筛选 (;,;01 经 0 和 & 双酶切 及 0 单酶切鉴定 测序 上海芯超生物科技有限公司 后扩增 # 试剂盒纯化, 饱和湿度培养箱内 用含 A 胎牛血清的 0+&- 培养基培养 A 胰蛋白酶消化传代 阳性克隆用 1.73 筛选 具体流程参照文献 以未转染 仅加入 0+&- 培养液, 细胞及转染空载体 (;,, 细胞作为对照 实时荧光定量聚合酶链式反应 0+/0 法及蛋白质印迹法检测 ;01+ 和 &;& 的表达 0+/0 按照 试剂盒说明书步骤提取各组细胞总 0,;+/ 水溶解 核酸蛋白分析仪检测 0, 浓度及纯度 7. 7 值在 D 之间 取总 0, 7 在 20'!+/0 仪上进行反转录反应 合成的 ;, 保存备用 引物序列如下 内参照 肌动蛋白 上游 B 1/,/,/,//,/,,1,,/1/11B 下游 B/1,1/,11,,,1,//,/1/1/1/1B 产物 9( ;01 上游 B,1,//////,1 1,/,1/B 下游 B///11/,,//1/,//1 /,B 产物 9( + 上游 B/,11,1 /,,,111//11/B 下游 B1/1/,/ /111/1,1/B 产物 9( &;& 上游 B //,1//11,,/,,1,1,/B 下游 B1,/, /,11,,/11,1B 产物 9( 以反转录产物为模板在,2- 荧光定量 +/0 仪进行 0+/0 预变性 延伸 7 共 个循环,2- +7 软件 系统分析 +/0 结果 在调整基线循环和计算阈值后 采用 /$ 法进行分析 蛋白质印迹 收集各组细胞 按本实验室常规方法提取总蛋白 2/, 法测定蛋白浓度 取 3 蛋白行 A;+,1 变性电泳 恒定电压 7 恒定电流 7, * 转至硝酸纤维素膜 A 脱脂奶粉室温封闭 一抗分别为鼠抗人 ;01 C 鼠抗人 + C 鼠抗人 &;& 单克隆抗体 孵育过夜 辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗 C 室温孵育 洗膜 /3 化学发光法曝光显影 /,&-, 图像分析仪扫描分析显影条带 以目的条带与内参 肌动蛋白条带灰度比值表示蛋白相对表达量 & 比色法检测细胞增殖活性取对数生长期的各组细胞 A 胰蛋白酶消化 调整细胞密度为.73 接种于 孔培养板 每孔 3 每组设 个复孔 各组细胞分别于培养 及 * 时 每孔加入 3& 7.73 继续培养 * 每孔加入 3;&> 振荡 7 在酶标仪上 7 波长处测定各孔光密度 值 同一时间 个复孔数值取均值 流式细胞仪检测细胞凋亡率各组细胞经 A 胰蛋白酶消化 预冷 +2 洗涤 离心收集细胞 3,#) 结合液悬浮细胞 加入 3,#)?-/ 避光孵育 7 再加入 3+- 避光孵育 7 置?,//9 流式细胞仪 美国 2; 公司 检测 每组各取 孔细胞 取平均值 计算细胞凋亡率 统计分析应用 + 软件进行统计分析 计量资料

3 江苏大学学报 医学版 第 卷 以均数 标准差 2- 表示 组间比较采用单因素方差分析 进一步两两比较采用 3; 检验 为差异有统计学意义 + 结果 阳性细胞克隆筛选转染 (;,;01 的, 细胞经 1 筛选 周后 共获得 个克隆 命名为 D 0+/0 和蛋白质印迹检测结果显示 与空载体组及未转染组比较 克隆组稳定高表达! 70, 及蛋白 均 详见下文 以下实验中仅选择 克隆组作为研究对象 阳性细胞克隆鉴定 (;,;01 质粒经 0 和 & 双酶切及 0 单酶切鉴定 结果显示! 基因正确地重组至 (;, 载体中 图 测序结果显示 与基因库 1-! ;, 序列一致 克隆组 空载体组 未转染组 & ;3 ;, 标准参照物 图 +)'&,' 法检测转染细胞 9',+ 及 $9$+ ' 表达 - +)'&,''6*9',+ $9$+ &;,.#' ;, 标准参照物 (;,;01 经单酶切显示 9( 条带 (;,;01 经双酶切显示 9( 及 9( 两条带 图 重组质粒 *90:2&9' 的酶切鉴定 -. **9& 0:2&9' / 各组细胞中 ;01+ 及 &;& 70, 及蛋白的表达 0+/0 结果显示 克隆组 + 70, 表达较空载体组显著增加 E 空载体组与未转染组间差异无统计学意义 EF 克隆组 &;& 70, 表达较空载体组显著降低 E 空载体组与未转染组间差异无统计学意义 EF 见图 图 蛋白质印迹结果显示 克隆组 + 蛋白表达较空载体组显著增加 E 空载体组与未转染组间差异无统计学意义 E F 克隆组 &;& 蛋白表达较空载体组显著降低 E 空载体组与未转染组间差异无统计学意义 EF 见图 图 与 克隆组比较 图 0 各组细胞 9',+ 及 $9$+ ' 的表达 - 0*'6*9',+ $9$+ %* 图 1 蛋白质印迹法检测各组细胞 9',+ 及 $9$+ 蛋白表达 - 1; 9',+ $9$+ 6**

4 第 期 焦霞 等 上调! 基因表达对肺腺癌细胞增殖与凋亡的影响 与 克隆组比较 图 4 各组细胞 9',+ 及 $9$+ 蛋白的表达 - 4**6*9',+ $9$+ %* 各组细胞增殖活性的比较 & 结果显示 与空载体组及未转染组相比 克隆组在培养 及 * 后 7 值均降低 均 其中 在培养 * 时下降最为显著 见图 与 克隆组比较 图 各组细胞增殖活性 - ** 各组细胞凋亡率的比较 克隆组 空载体组及未转染组细胞凋亡率分别为 A A A 与空载体组相比 克隆组凋亡率显著增加 E 空载体组与未转染组间差异无统计学意义 EF 见图 图 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率 - - **%* 0 讨论! 是 6* 等在 7% 敲除的小鼠胚胎组织中发现的一种与细胞分化及增殖相关的基因 定位于人染色体 编码相对分子质量为 的蛋白质 7 等研究发现! 在多种肿瘤细胞株和肿瘤组织中表达降低 而上调! 的表达则可显著抑制乳腺癌 前列腺癌 膀 胱癌等癌细胞的生长与侵袭 $# 等采用? 1 稳定转染法 将含人类全长! ;, 质粒导入人结肠癌 / 细胞 结果细胞凋亡显著增加 而细胞增殖显著降低 其机制与 ;01 依赖 的 + 信号通路激活有关 "#" 等报道 采用胺苯硫脲铁螯合剂介导法将! 基因转入胰腺癌 +,/ 细胞 可显著抑制该细胞增殖及转移能力 并促进该细胞的凋亡 我们在前期工作中也发现! 通过下调宫颈癌 细胞环氧合酶 />4 血管内皮生长因子 1? 的表达及细胞增殖而抑制宫颈癌的进展 本实验结果进一步显示 将外源性! 基因导入肺腺癌细胞 获得稳定高表达! 的阳性细胞克隆 其细胞增殖活性显著降低 细胞凋亡显著增加 基因作为一种抑癌基因 是细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂 /- 家族一员 是目前已知的最具有广泛激酶抑制活性的 /- 不仅在肺癌 子宫内膜癌 胃癌等恶性肿瘤组织中表达缺失或表达减少 而且与肿瘤的分化程度 侵袭转移密切相关 &;& 主要与 + 蛋白结合 参与调节细胞增殖和凋亡的相关信号通路 多种恶性肿瘤组织存在 &;& 异常表达 &;& 高表达与肿瘤的发生发展及预后不良密切相关 &;& 有望成为肿瘤治疗的

5 江苏大学学报 医学版 第 卷 一个新靶点 "#" 等采用脂质体介导法将! 基因导入人前列腺癌 +/&& 细胞株 结果细胞凋亡增加而增殖降低 其机制与 ;01 通过非 + 依赖性信号通路调节 + 与 &;& 的表达有关 本实验为探讨 ;01 对, 细胞生物学特征影响的可能分子机制 采用脂质体介导细胞转基因法 1 筛选获得稳定高表达! 的肺腺癌细胞克隆 与空载体组相比 克隆组 + 表达增加 而 &;& 表达降低 结果表明 ;01 不仅参与调节, 细胞 + 和 &;& 的表达 而且通过上调 + 的表达和下调 &;& 的表达来抑制肺腺癌细胞增殖 促进细胞凋亡 尽管如此! 作为近年来发现的与细胞分化相关的基因 其抑制肺腺癌进展的确切机制及相关调控机制尚未完全明确 ' 等研究发现 抑癌基因 "" 缺氧诱导因子 及多种分化调节剂可调控体外培养的肿瘤细胞中 ;01 的表达 同时 7%.;01 信号通路与 0,? 丝裂原活化蛋白激酶 0,?&,+ 细胞外信号调节激酶 0 核因子.<((2?.<( (20, 等信号通路之间存在着复杂的联系 但是 ;01 在体内对肿瘤的确切功能及作用机制尚未完全明了 因此 还必须加强体内 ;01 对肿瘤的作用及相关信号通路关系的研究 才可能从本质上阐明 ;01 的抑癌机制 参考文献 * &+ * ; 3#'* #$;01. #) (# *9$#' (7%$#7%#' #<#7 3#< 0# 许斌 陈寅 戴桂红 等 转染 1!" 基因对乳腺癌细胞 &&+ 及 -&+ 表达的影响 江苏大学学报 医学版 6*,06 #$('#(#'#$;01 #)(# '# *9$ $#$#($*## (#$ 9$$(($$#(%7#'#(#$,7+*%/#+*% / 7,7&#$((#?<( (2$"$%9%;01 #)(# $#$# $*#" "#($#$**%7$$7# / ## $# *7 #2 #$;01 ## %('#(#'#$(($ 2/*#7 "#"6 /*<* 3"#:%;2 #$"#$* #79# *#$'# (#$ ' (*(*%$ $*# 7#$$ ((# 7% '$#7 #$#' ## # $$#%$*# $#$7#$(#$# &+*7 钱华 王华 袁冬兰 等 转染! 基因对宫颈癌细胞 />41? 表达及增殖的影响 江苏大学学报 医学版 ' <, < #$0#"## 7$* $( $* ' ($*9(#$ $$($* ='#& 3/ =*1&&;& &;&4' ( ##' #$*#(%$0#"/# "#"6 "$* & #$*# 7#$$ ((# 7% ' $#7 #$#' ## ;01 (#$# ( "('#(#'#$ 7#*7/## ' &$# #7 /#$>)%#'#(#'#$ #$ ;01 *7 9$7## ' # >0#( 收稿日期 编辑 刘星星

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