2014 年 12 月世界科技研究与发展研究论文 1 引言骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤, 恶性程度高预后比较差, 目前缺少有效的早期诊断方法, 诊断时大多已为晚期, 患者预后不理想, 因此骨肉瘤的化疗和新的疗法对患者预后非常重要研究表明环氧合酶 2(cyclooxygenase 2,COX 2

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璃争俊杨
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1 第 36 卷 2014 年 12 月第 6 期页世界科技研究与发展 WORLDSCI TECH R&D Vol.36 Dec.2014 No.6 pp RNA 干扰靶向沉默 COX 2 基因对 MG 63 骨肉瘤细胞生物学特性的研究陈秀锦杨明宣崔兆辉胡旭昌汪静安丽萍马靖琳王栓科 ( 兰州大学第二临床医学院骨科 / 甘肃省骨关节疾病研究重点实验室, 兰州 ) 摘要 : 目的通过构建小干扰 RNA(smalinterferingRNA,siRNA) 降低 MG 63 骨肉瘤细胞环氧合酶 2(COX 2) 基因的表达, 并进一步研究其对 MG 63 骨肉瘤细胞增值侵袭迁移能力的影响及分子机制方法设计靶向干扰 COX 2 基因的 sirna, 通过脂质体转染 MG 63 骨肉瘤细胞, 使其抑制 MG 63 骨肉瘤细胞 COX 2 基因的表达, 后采用噻唑蓝 (MTT) 比色法 Transwel 小室实验研究其对 MG 63 骨肉瘤细胞增殖侵袭迁移能力的影响, 采用 RFQ PCR 和 Westernblot 分别从基因和蛋白的水平检测 MG 63 骨肉瘤细胞侵袭性相关因子基质金属酶 (MMP 9) 的表达及血管内皮生长因子 (VEGF) 的表达结果转染 MG 63 骨肉瘤细胞后, 实验组与阴性对照组和空白对照组比较, 通过 RFQ PCR 和 Westernblot 检测 COX 2 基因表达降低约 90%(P<0 05),MTT 检测 MG 63 骨肉瘤细胞增值能力明显受到抑制 (P<0 05),Transwel 实验检测 MG 63 骨肉瘤细胞侵袭迁移能力明显下降 (P<0 05), 经 RFQ PCR Westernblot 检测侵袭性相关因子 MMP 9 和血管内皮生长因子 VEGF 的 mrna 及蛋白表达降低 (P<0 05) 空白对照组和阴性对照组比较无明显变化, 差异无统计学意义 (P<0 05) 结论人 MG 63 骨肉瘤细胞 COX 2 基因被抑制后,MG 63 骨肉瘤细胞增值侵袭迁移能力明显下降关键词 :MG 63 骨肉瘤细胞 ;RNA 干扰 ; 迁移 ; 侵袭中图分类号 :R733.3 文献标识码 :A doi: /j.isn EfectofsiRNAInhibitedCOX 2GeneonBiological CharacteristicsofMG 63Cels CHENXiujin YANG Mingxuan CUIZhaohui HUXuchang WANG Jing ANLiping MAJinglin WANG Shuanke (DepartmentofOrthopaedics,theSecondHospitalofLanzhouUniversity/OrthopaedicKey LaboratoryofGansuProvince,Lanzhou730000) Abstract:ObjectiveThroughestablishingthesmalinterferingRNA(siRNA)todecreasetheexpresionofMG 63osteo sarcomacel scyclooxygenase 2(COX 2)gene,andfurtherresearchtheinfluenceandmolecularmechanismofthepower forproliferation,invasionandmigrationformg 63osteosarcomacel.MethodsDesignedthetargetedinterferenceCOX 2 gene ssirna,transfectedmg 63osteosarcomacelbythelipidosome,soastosupprestheexpresionofCOX 2genein MG 63osteosarcomacel,thenweusedtheMTTcolorimetricmethod,andTranswelsmalroomexperimenttoresearchthe influencetothepowerofproliferation,invasionandmigrationformg 63osteosarcomacel.UsingRFQ PCRandWestern blottodetecttheexpresionofthemg 63osteosarcomacelinvasiverelatedfactormatrixmetalenzyme(MMP 9)expres sionandtheexpresionofvascularendothelialgrowthfactor(vegf)fromthegenelevelandtheproteinlevel.resultsaf tertransfectingthemg 63osteosarcomacels,comparingtheexperimentgroupwiththenegativecontrolgroupandtheblank controlgroup,throughtherfq PCRandWesternblotdetectingCOX 2gene sexpresionabout90%(p<0 05),MTTde tectingthemg 63osteosarcomacels multiplicationcapacitywhichissuppresedobviously(p<0 05),usingTranswelex perimenttodetectmg 63osteosarcomacels invasion,migrationabilitydecreasesignificantly(p<0 05),throughtheRFQ PCR,WesternblotdetectingtheinvasiverelatedfactorMMP 9andvascularendothelialgrowthfactorVEGF smrnaand proteinexpresionreduced(p<0 05).Theblankcontrolgroupandthenegativecontrolgrouphadnosignificantchange, therewasnostatisticalysignificantdiference(p<0 05).ConclusionCOX 2siRNAcansignificantsupprestheCOX 2 gene sexpresioninpeople smg 63osteosarcomacel,andthenfurtherinduceMG 63osteosarcomacel spowerofprolifer ation,invasionandmigration. Keywords:MG 63osteosarcomacel;RNAinterference;migration;invasion 收稿, 接受甘肃省自然科学基金 (1010RJZA1240) 资助通讯作者,E mail:chen_xiujin@126.com 第 668 页

2 2014 年 12 月世界科技研究与发展研究论文 1 引言骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤, 恶性程度高预后比较差, 目前缺少有效的早期诊断方法, 诊断时大多已为晚期, 患者预后不理想, 因此骨肉瘤的化疗和新的疗法对患者预后非常重要研究表明环氧合酶 2(cyclooxygenase 2,COX 2) 在多种肿瘤组织中呈现高表达,COX 2 的过度表达与多种肿瘤细胞的形成发展密切相关 [1], 在骨肉瘤细胞中亦可检测到 COX 2 基因的高表达 [2] 作为特异性阻断基因表达的方法,RNA 干扰 (RNAinterference) 是近年来出现的一种较成熟的基因沉默技术, 能快速高效地阻滞肿瘤细胞和组织中相关基因的表达, 目前已成功应用于基因功能检测肿瘤治疗的研究中 [3] 本实验采用 RNA 干扰技术, 设计特异性阻断 COX 2 基因的 sirna, 并用脂质体转染 MG 63 骨肉瘤细胞, 抑制 MG 63 骨肉瘤细胞 COX 2 基因的表达, 观察其对 MG 63 骨肉瘤细胞增值侵袭迁移能力的影响及其分子机制, 以期对骨肉瘤的化疗和基因治疗提供可能的治疗靶点 2 材料与方法 2.1 材料 1) 主要试剂化学合成的 COX 2siRNA 试剂盒及 sirnare agentsystem 转染试剂盒购自 Santacruz 公司, SYBR PremixExTaq TM I 试剂盒和 PrimeScript RTre agentkit 试剂盒及 RNAisoPlus 细胞裂解液均购自 Takara 公司, 实验所用引物由 Takara 公司设计, 用于 Westernblot 实验的试剂购自 ABCOM 公司用于 MTT 试剂和 Transwel 小室购自 Sigma 公司 DMEM 血清及胰酶双抗购自 Hyclone 公司 2) 细胞培养人骨肉瘤细胞 (MG 63) 购自中国医学科学院细胞中心,MG 63 骨肉瘤细胞按常规将细胞株培养于含 10% 胎牛血清青霉素和链霉素双抗的 DMEN 培养液中, 置于 37,5%CO 2 细胞培养箱中, 待细胞单层覆盖瓶底达 80% 时用 2 5g/L 胰蛋白酶消化传代, 取其对数期生长的细胞用于实验传代并增殖用以进行 RNA 干扰 2.2 实验方法 1) 实验分组实验分为 3 组 :COX 2siRNA 组 ( 实验组 ) NegativesiRNA 组 ( 转染 ControlsiRNA 组, 阴性对照组 ) Blank 组 ( 无转染组, 空白组 ) 2) 经脂质体介导, 将 sirna 转染 MG 63 骨肉瘤细胞个 / 孔接种 MG 63 骨肉瘤细胞于 6 孔培养板中, 待细胞贴壁达 60% ~80%, 将 sirna 转染 MG 63 骨肉瘤细胞, 将细胞孵育 6 小时, 加入 1ml 含有 2 倍正常血清和双抗的生长培养基, 继续孵育细胞, 分别于 24h 36h 48h 72h 观察 MG 63 骨肉瘤细胞中的荧光数量以确定转染 sirna 进入细胞的最佳时间以 Blank 组和 NegativesiRNA 组作为对照, 用 RFQ PCR Westernblot 法评估转染 COX 2 sirna 进入 MG 63 骨肉瘤细胞后 COX 2 基因抑制情况 3)MTT 检测细胞增值将各组处理后的 MG 63 骨肉瘤细胞用 0 25% 胰蛋白酶消化收集贴壁细胞, 制备成细胞悬液, 以每孔 100μl 种于 96 孔培养板中, 每组设 5 个复孔每孔加 20μlMTT 培养 4h 后弃上清, 再加入二甲基亚砜每孔 100μl, 于微量振荡器充分振荡 5min, 使结晶物充分溶解, 用全自动酶标仪按参比波长为 490nm, 测定各孔吸收 OD 值 4)Transwel 实验检测细胞侵袭迁移能力, 在低温环境下将基质胶涂于小室上层制作好的小室在紫外线下消毒 30min 将转染的 MG 63 骨肉瘤细胞悬液 300 μl( 约含细胞 ), 无血清 DMEM 培养液加入小室的上室, 在下室中加入 500μl 含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液,37 培养 36 小时取出滤膜, 拭去滤膜表面残留细胞,PBS 清洗 2 遍, 后进行结晶紫染色,400 倍光镜下随机选取 5 个视野, 计数侵袭到滤膜背面的穿膜细胞数, 以穿膜细胞的相对数目表示细胞侵袭力大小实验重复 4 次, 取平均值迁移实验 : 不涂基质胶步骤外其余同侵袭实验, 以穿膜细胞的相对数目表示细胞迁移能力大小应用 t 检验进行统计学分析, 比较各组细胞侵袭迁移能力 5)RFQ PCR 检测 COX 2siRNA 转染 MG 63 骨肉瘤细胞后 COX 2 MMP 9 VEGF 的 mrna 表达 COX 2siRNA 转染 MG 63 骨肉瘤细胞后用 RNAisoPlus 细胞裂解液提取各组细胞中总 RNA 实时荧光定量 PCR 检测目的基因,37 15min 85 5sec 进行反转录, 后预变性 Reps: 秒 Stage2:PCR 反应 Reps: 秒秒计算 COX 2 MMP 9 VEGF 基因 mrna 的相对表第 669 页

研究论文世界科技研究与发展 2014 年 12 月达量, 以 GADPH 为内参照校正每个样本的循环阈值 CT 得到 CT, 实验组和阴性对照组目的基因相对表达量以 2 Ct 表示, 本实验重复 3 次表 1 用于实时荧光定量 PCR 反应的引物序列 Table1 Primersequencesusedforthereal timefluorogenicquantita tive PCR

3 研究论文世界科技研究与发展 2014 年 12 月达量, 以 GADPH 为内参照校正每个样本的循环阈值 CT 得到 CT, 实验组和阴性对照组目的基因相对表达量以 2 Ct 表示, 本实验重复 3 次表 1 用于实时荧光定量 PCR 反应的引物序列 Table1 Primersequencesusedforthereal timefluorogenicquantita tive PCR Primer Sense(5 3 ) Anti sense(5 3 ) COX 2 CCAGCACTTCACGCATCAG GCTGTCTAGCCAGAGTTTCAC VEGF ACTACTTCTCCCGCCGCTAC GAAATCAAACAGAGGCCGCATG MMP 9 ACGCACGACGTCTTC CAGTA CCACCTGGTTCAACTCACTCC GADPH GCACCGTCAAGGCTGAGAAC TGGTGAAGACGCCAGTGGA 6) 蛋白免疫印迹 (Westernblot) 检测转染 COX 2siRNA 后对 MG 63 骨肉瘤细胞中 COX 2 MMP 9 VEGF 蛋白表达的影响取 MG 63 骨肉瘤细胞对数生长期个细胞, 转染 COX 2siRNA, 以未转染组为空白对照, 转染 Control 组为阴性对照, 采用细胞裂解的方法提取 MG 63 骨肉瘤细胞总蛋白, 后行 10% SDS PAGE 分离蛋白并转移至硝酸纤维素膜上, 分别加入一抗 (COX 2 MMP 9 VEGF,1 1000) 进行反应, 利用 BIO RADVersaDoc4000 凝胶成像分析系统, 选择化学发光通道与合适的曝光时间检测目的蛋白和内参, 以 GADPH 为内参照拍照分析条带灰度值进行统计分析, 实验重复 3 次 2.3 统计学处理应用 SPSS19.0 软件对结果数据进行统计分析, 计量资料以 x±s 珋表示, 采用单因素方差分析, 组间两两比较采用 SNK 检验方法对结果进行统计分析,P<0 05 为差异有统计学意义 3 结果 1)COX 2siRNA 转染进入 MG 63 骨肉瘤细胞并能明显抑制其 COX 2 基因的表达把带有荧光的 ControlsiRNA 转染 MG 63 骨肉瘤细胞, 后对带有荧光的 MG 63 骨肉瘤细胞计数 ( 图 1), 经绿色荧光显微镜观察,36 小时转染荧光进入 MG 63 骨肉瘤细胞最高约 96% 经 RFQ PCR 和 Westernblot 检测, 转染 COX 2siRNA36 小时后 MG 63 骨肉瘤细胞 COX 2 基因表达抑制率约 90% ( 图 4 5) 2)MTT 检测 COX 2siRNA 转染 MG 63 骨肉瘤细胞后 MG 63 骨肉瘤细胞增值能力下降 MTT 结果显示 COX 2siRNA 组 MG 63 骨肉瘤细胞生长检测 OD 值 (0 411±0 047) 明显小于 Neg 图 1 绿色荧光显微镜下 ( 原始放大 400) 观察带有荧光 Control sirna 的 MG 63 骨肉瘤细胞 Figure1 MG 63osteosarcomacelswithfluorescentcontrolsiRNA observed by Green fluorescence microscope (Original magnification 400) ativesirna 组 (0 892±0 104) 和 Blank 组 (0 887± 0 119), 差异具有统计学意义 (P<0 05) Negative sirna 组与 Blank 组比较差异没有统计学意义 (P> 0 05)( 图 2) 图 2 不同处理组的 MTT 检测 OD 值 Figure2 MTTasayresultsindiferentgroups 3)Transwel 实验检测 COX 2siRNA 转染 MG 63 骨肉瘤细胞后细胞的侵袭迁移能力下降转染 36 小时后, 通过 Transwel 侵袭实验可以观察到 COX 2siRNA 组 ( 图 3d)MG 63 骨肉瘤细胞较 NegativesiRNA 组 ( 图 3c)MG 63 骨肉瘤细胞侵袭能力明显下降 (P<0 05) 通过 Transwel 迁移实验可以观察到 COX 2siRNA 组 ( 图 3b)MG 63 骨肉瘤细胞较 NegativesiRNA 组 ( 图 3a)MG 63 骨肉瘤细胞迁移能力明显下降 (P<0 05)( 图 3) 4)RFQ PCR 检测 COX 2siRNA 转染 MG 63 骨肉瘤细胞后 COX 2mRNA 表达明显被抑制, 侵袭性相关因子 MMP 9mRNA 和血管内皮生长因子 VEGF 第 670 页

２０１４年１２月世界科技研究与发展研究论文５Ｗｂ检测ＣＯＸ２ＲＮＡ转染ＭＧ３骨肉瘤细胞后ＣＯＸ２蛋白表达明显被抑制侵袭性相关因子ＭＭＰ９蛋白和血管内皮生长因子ＶＥＧＦ蛋白表达下调成功转染ＭＧ３骨肉瘤细胞后经

ｋ组比较差异没有统计学０５图５意义Ｐ０图３不同处理组ＭＧ３骨肉瘤细胞的侵袭迁移情况Ｆｕ３ＴｈＭＧ３ｄｍｄｍｕｐｍｒｎａ表达下调ＣＯＸ２转染ＭＧ３骨肉瘤细胞３小时后ＲＦＱＰＣＲ监测

Ｗｂ检测ＣＯＸ２ＲＮＡ转染ＭＧ３骨肉瘤细胞后对ＣＯＸ２ＭＭＰ９ＶＥＧＦ蛋白表达的影响Ｆｕ５ＥｐｘｐＣＯＸ２ＭＭＰ９ＶＥＧＦＭＧ３ｄｃｏｘ２ＲＮＡｂｙｗｂ统计学意义Ｐ００５图４４

促进肿瘤细胞过度增殖增加肿瘤细胞浸润转移能力从而促进了肿瘤的发生发展和侵袭转移４５２阳性表达者的术后生存有研究发现骨肉瘤ＣＯＸ图４ＲＦＱＰＣＲ检测ＣＯＸ２ＲＮＡ转染ＭＧ３骨肉瘤细胞后对ＣＯＸ２ＭＭＰ９ＶＥＧＦ的

4 ２０１４年１２月世界科技研究与发展研究论文５Ｗｂ检测ＣＯＸ２ＲＮＡ转染ＭＧ３骨肉瘤细胞后ＣＯＸ２蛋白表达明显被抑制侵袭性相关因子ＭＭＰ９蛋白和血管内皮生长因子ＶＥＧＦ蛋白表达下调成功转染ＭＧ３骨肉瘤细胞后经Ｗｂ检测ＣＯＸ２ＲＮＡ组与ＮＲＮＡ组和Ｂｋ组比较ＭＧ３骨肉瘤细胞ＣＯＸ２蛋白侵袭性相９蛋白和血管内皮生长因子ＶＥＧＦ蛋关因子ＭＭＰ白表达均降低差异具有统计学意义Ｐ００５ＮＲＮＡ组与Ｂｋ组比较差异没有统计学０５图５意义Ｐ０图３不同处理组ＭＧ３骨肉瘤细胞的侵袭迁移情况Ｆｕ３ＴｈＭＧ３ｄｍｄｍｕｐｍｒｎａ表达下调ＣＯＸ２转染ＭＧ３骨肉瘤细胞３小时后ＲＦＱＰＣＲ监测ＣＯＸ２ＲＮＡ组与ＮＲＮＡ组和Ｂｋ组比较ＣＯＸ２ｍＲＮＡ抑制率约９０Ｐ００５侵袭性相关因子ＭＭＰ９ｍＲＮＡ表达下调Ｐ００５血管内皮生长因子ＶＥＧＦ表达下调Ｐ００５ＮＲＮＡ组与Ｂｋ组比较差异无图５Ｗｂ检测ＣＯＸ２ＲＮＡ转染ＭＧ３骨肉瘤细胞后对ＣＯＸ２ＭＭＰ９ＶＥＧＦ蛋白表达的影响Ｆｕ５ＥｐｘｐＣＯＸ２ＭＭＰ９ＶＥＧＦＭＧ３ｄｃｏｘ２ＲＮＡｂｙｗｂ统计学意义Ｐ００５图４４结束语骨肉瘤的产生增值侵袭转移是一个多步骤多因素参与的复杂过程多种因子在骨肉瘤的发生发展中产生作用ＣＯＸ２又称前列腺素内过氧化物合成酶现大量研究表明在多种肿瘤组织和转移灶中高表达ＣＯＸ２表达增高可促进肿瘤血管的生成促进肿瘤细胞过度增殖增加肿瘤细胞浸润转移能力从而促进了肿瘤的发生发展和侵袭转移４５２阳性表达者的术后生存有研究发现骨肉瘤ＣＯＸ图４ＲＦＱＰＣＲ检测ＣＯＸ２ＲＮＡ转染ＭＧ３骨肉瘤细胞后对ＣＯＸ２ＭＭＰ９ＶＥＧＦ的ｍｒｎａ表达的影响Ｆｕ４ＥｍｒｎａｘｐＣＯＸ２ＭＭＰ９ＶＥＧＦＭＧ３ｄｃｏｘ２ＲＮＡｂｙＲＦＱＰＣＲｗｗｗｂｍ率较低其表达可以反映骨肉瘤的预后目前关于ＣＯＸ２抑制剂对肿瘤的抑制作用及其机制的２可通过多种途径在肿瘤的研究已成为热点ＣＯＸ第７１页

5 研究论文世界科技研究与发展 2014 年 12 月发生发展过程中起作用, 包括 :1) 促进肿瘤细胞增殖 :COX 2 代谢路径中的产物 PGE2 在正常细胞及肿瘤细胞都有促进增殖的作用 [7 9] ;2) 促进肿瘤组织血管生长 :COX 2 的表达导致 PGE2 产生,PGE2 细胞膜受体的激活促使细胞内 camp 增加, 从而诱导血管内皮生长因子 (vas cularendothelialgrowthfac tor,vegf) 的表达, 促进了肿瘤新生血管的形成 [9] ; 3) 促进肿瘤细胞的侵袭迁移能力 :COX 2 的过度表达能够使肿瘤细胞的迁移和侵袭能力增强, 与其能够上调肿瘤细胞基质金属蛋白酶和尿激酶型纤溶酶原激活物的表达密切相关 [11] 以上研究均表明 COX 2 与肿瘤的生成发展与转移关系密切本实验 COX 2siRNA 转染 MG 63 骨肉瘤细胞 36 小时后,MTT 法检测 MG 63 骨肉瘤细胞增值能力受到明显抑制, 通过 RFQ PCR 和 Westernblot 检测 MG 63 骨肉瘤细胞中 COX 2 基因表达抑制约 90%, 说明所构建的 sirna 达到了有效抑制 MG 63 骨肉瘤细胞中 COX 2 基因表达的目的, 从而使 MG 63 骨肉瘤细胞的增值能力下降阴性对照组和空白对照组通过 RFQ PCR,Westernblot 检测差异无统计学意义 (P< 0 05), 说明所设计的 COX 2siRNA 特异性较强且 sirna 及转染过程对实验结果不造成影响侵袭和转移是影响骨肉瘤患者生存和预后的关键因素 MMP 9 金属蛋白酶 9(MMP 9) 主要由巨噬细胞结缔组织细胞和某些肿瘤细胞以酶原形式分泌, 激活后通过降解破坏 Ⅳ V Ⅸ Ⅺ 型胶原, 使肿瘤细胞可以沿着受损的基底膜向周围组织浸润, 还可以降低肿瘤细胞之间的黏附性, 使肿瘤细胞容易脱离原发灶, 提高肿瘤细胞的侵袭迁移能力, 最终导致恶性肿瘤的浸润及转移 [12],COX 2 抑制剂通过阻断 ERK/Spl 途径可抑制肿瘤细胞 MMPs 的表达 [13] 利用 Matrigel 胶研究肿瘤侵袭力的影响是体外研究肿瘤细胞侵袭和转移行为的简便且快速的方法, 本实验通过 Transwel 细胞体外侵袭迁移实验, 利用 Matrigel 胶重建基底膜系统, 结果发现转染后 36h, 实验组细胞侵袭迁移能力较对照组细胞明显下降, 说明利用 COX 2siRNA 干扰能明显抑制 MG 63 骨肉瘤细胞的体外侵袭和迁移能力本实验成功转染 MG 63 骨肉瘤细胞后, 通过 RFQ PCR 和 Westernblot 检测 MG 63 骨肉瘤细胞中 MMP 9 表达降低, 证明 MMP 9 表达降低后可诱导 MG 63 骨肉瘤细胞侵袭和迁移能力下降 COX 2 选择性抑制剂可明显抑制新生血管的生成, 这表明 COX 2 与肿瘤血管的生成密切相关 [14] VEGF 主要作用于血管的内皮细胞, 具有促进血管内皮细胞增殖迁移增加血管通透性等作用, 在肿瘤细胞发生及转移过程中起重要作用, 一方面 COX 2 可使肿瘤中 VEGF 的表达上调, 另一方面 VEGF 又可上调 COX 2 的表达, 从而形成一个正反馈网络, 协同刺激肿瘤血管生成 [15], 通过抑制 COX 2 降低 VEGF 的表达从而抑制肿瘤血管生成或许是肿瘤治疗的一种新方法骨肉瘤中血液循环非常丰富, 降低 VEGF 将降低骨肉瘤微血管的生成本实验研究结果显示 COX 2 抑制后 VEGF 表达明显降低, 表明 COX 2 VEGF 有可能成为抗骨肉瘤微血管生成的靶点, 为骨肉瘤治疗提供新的干预途径综上所述, 实验结果说明 COX 2 与骨肉瘤细胞增值血管生成及侵袭迁移能力密切相关 COX 2 基因在 MG 63 骨肉瘤细胞中的高表达促进了骨肉瘤的血管生成, 加速了骨肉瘤细胞的浸润转移能力本实验证明,COX 2 表达下调能有效诱导降低 MMP 9 与 VEGF 在 MG 63 骨肉瘤细胞中的表达, 同时 MG 63 骨肉瘤细胞增值能力明显被抑制,MG 63 骨肉瘤细胞的侵袭迁移能力明显下降因此, 检测 COX 2 表达情况或许有助于骨肉瘤诊断及病情判断,COX 2 特异性抑制剂可能在骨肉瘤的化学治疗中发挥重要作用, 其分子机制的进一步明确有助于为骨肉瘤肿瘤的基因沉默治疗提供新的靶点和思路本研究通过设计的特异性 COX 2siRNA 阻断 MG 63 骨肉瘤细胞内 COX 2 基因的表达, 与反义寡核苷酸和核酶等其他基因沉默手段相比,RNA 干扰对基因抑制作用更强, 特异性更高 [16], 有望成为骨肉瘤基因治疗的一种新手段参考文献 [1]DANNENBERGAJ,ALTORKINK,BOYLEJO,etal.Inhibitionof cyclooxygenase 2:anapproachtopreventingcanceroftheupperaero digestivetract[j].newyorkacademyofsciences,2001,952: [2]NARUSET,NISHIDAY,HOSONOK,etal.Meloxicam inhibitsos teosarcomagrowth,invasivenesandmetastasisbycox 2 dependent andindependentroutes[j].carcinogenesis,2006,27(3): [3]MCMANUSM T,SHARPPA.Genesilencinginmammalsbysmal interferingrnas[j].naturereviewsgenetics,2002.3(10): [4]HEXP,SHAOY,LIXL,etal.DownregulationofmiR 101ingas triccancercorelateswithcyclooxygenase 2overexpresionandtumor growth[j].federationofeuropeanbiochemicalsocieties, 第 672 页

6 2014 年 12 月世界科技研究与发展研究论文 (22): [5]LIY,DAIL,ZHANGJ,etal.Cyclooxygenase 2polymorphismsand theriskofgastriccancerinvariousdegreesofrelationshipinthechi nesehanpopulation[j].oncollet,2012.3(1): [6] 耿艳华, 王昌兴, 陈培辉.COX 2 和 HIF 1 仪在骨肉瘤中的表达及其与临床病理的相关性 [J]. 肿瘤杂志,2008,28(5): [7]PAIR,SOREGHANB,SZABOIL,etal.ProstaglandinE2transacti vatesegfreceptor:anovelmechanism forpromotingcoloncancer growthandgastrointestinalhypertrophy[j].naturemedicine, (3): [8]FUJINOH,WESTK A,REGAN JW.Phosphorylationofglycogen synthasekinase 3andstimulationofT celfactorsignalingfolowing activationofep2andep4prostanoidreceptorsbyprostaglandine2 [J].JournalofBiologicalChemistry, (4): [9]LIUXH,KIRSCHENBAUM A,LU M,etal.ProstaglandinE2in duceshypoxia induciblefactor 1alphastabilizationandnuclearlocali zationinahumanprostatecancercelline[j].journalofbiological Chemistry, (51): [10]EIBLG,BRUEMMERD,OKADAY,etal.PGE(2)isgeneratedby specificcox 2activityandincreasesVEGFproductioninCOX 2 expresinghumanpancreaticcancercels[j].biochemicalandbio physicalresearchcommunications, (4): [11]ITOH,DUXBURYM,BENOITE,etal.ProstaglandinE2enhances pancreaticcancerinvasivenesthroughanets 1 dependentinduc tionofmatrixmetaloproteinase 2[J].CancerResearch, (20): [12]F RSTG,SCHULTEAMEJ,POLLLW,etal.Portalveinemboli zationandautologouscd133+bonemarowstemcelsforliverre generation:initialexperience[j].radiology, (1): [13]PANMR,HUNGW C.Nonsteroidalanti inflammatorydrugsinhibit matrixmetaloproteinase 2viasuppresionoftheERK/Sp1 media tedtranscription[j].journalofbiologicalchemistry, (36): [14]SHENGH,SHAOJ,DUBOISRN.K Ras mediatedincreaseincy clooxygenase2mrnastabilityinvolvesactivationoftheproteinki naseb1[j].cancerresearch, (6): [15]LIZR,LIYP,LINM L,etal.Activatedmacrophagesinduceneo vascularizationthroughupregulationofmmp 9andVEGFinratcor neas[j].cornea, (9): [16]AOKIY,CIOCADP,OIDAIRAH,etal.RNAinterferencemaybe morepotentthanantisensernainhumancancercellines[j]. ClinicalandExperimentalPharmacologyandPhysiology, (1 2): 第 673 页

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot