220 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 27 卷 presionofrsk2genepromotedtheproliferationofsmmc 7721cels(P<0.01).Flowcytometryre sultsshowedthatrsk2genesilencingblockedthec

Size: px

Start display at page:

Download "220 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 27 卷 presionofrsk2genepromotedtheproliferationofsmmc 7721cels(P<0.01).Flowcytometryre sultsshowedthatrsk2genesilencingblockedthec"

利廖
5 years ago
Views:

1 第 27 卷第 3 期 2017 年 5 月江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.27 No.3 May2017 RSK2 基因对肝癌 SMMC 7721 细胞增殖与凋亡的影响 FarmanAli 1,2, 何大伟 3, 何敖林 3, 李莎莎 3, 周明慧 3 2, 王炳芳 (1. 江苏大学医学院, 江苏镇江 ;2. 江苏大学附属昆山医院消化内科, 江苏昆山 ;3. 江苏大学附属昆山医院临床实验研究中心, 江苏昆山 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨 P90 核糖体 S6 激酶 2(ribosomalS6kinase2,RSK2) 基因对肝癌细胞 SMMC 7721 的增殖与凋亡的影响方法 : 将肝癌细胞随机分为 5 组, 即对照组 pcdna3.1(+) 空质粒组 pcdna3.1(+)/rsk2 组 sirna 阴性对照组 sirna RSK2 组对照组不转染, 其余 4 组分别转染 pcdna3.1(+) 空质粒 pcdna3.1(+)/rsk2 sirna 阴性对照 sirna RSK2 转染 48h 后, 荧光定量 PCR(RT PCR) 免疫印迹法检测 RSK2mRNA 和蛋白表达 ; CCK8 实验检测各组细胞增殖能力 ; 流式细胞术检测各组细胞凋亡和周期结果 :RT PCR 和免疫印迹结果显示, pcdna3.1(+)/rsk2 组 RSK2mRNA 和蛋白表达量明显高于其他 4 组 (P<0.01);siRNA RSK2 组表达量明显低于其他 4 组 (P<0.01) CCK8 检测结果表明,RSK2 基因过表达促进 SMMC 7721 细胞增殖 (P<0.01) 流式细胞术结果显示,RSK2 基因沉默阻断细胞周期在 G1 期 (P<0.01), 细胞总增殖能力下降 (P<0.01);siRNA RSK2 组细胞凋亡率明显高于其他 4 组 ( 均 P<0.01), 而 pcdna3.1(+)/rsk2 组细胞凋亡率与对照组比较无明显差别 (P> 0.05) 结论:RSK2 过表达可促进 SMMC 7721 细胞增殖, 但对凋亡无影响 ;RSK2 沉默抑制细胞增殖能力, 促进细胞凋亡 [ 关键词 ] RSK2; 肝癌细胞 ; 细胞增殖 ; 细胞凋亡 [ 中图分类号 ] R735.7 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2017) DOI: /j.isn y [ 引用格式 ]FarmanAli, 何大伟, 何敖林, 等.RSK2 基因对肝癌 SMMC 7721 细胞增殖与凋亡的影响 [J]. 江苏大学学报 ( 医学版 ),2017,27(3): ,228. InfluenceofRSK2geneonthecelproliferationandapoptosisof humanhepatocelularcarcinomacellinesmmc 7721 FarmanAli 1,2,HEDa wei 3,HEAo lin 3,LISha sha 3,ZHOUMing hui 3,WANGBing fang 2 (1.SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212013;2.DepartmentofGastroenterology,KunshanHospitalAfiliatedto JiangsuUniversity,KunshanJiangsu215300;3.ClinicalResearch&LabCenter,KunshanHospitalAfiliatedtoJiangsuUniversity,Kun shanjiangsu215300,china) [Abstract] Objective:ToinvestigatetheefectofP90ribosomalS6kinase2(RSK2)geneonthepro liferationandapoptosisofhumanhepatocelularcarcinomacellinesmmc 7721.Methods:SMMC 7721 celsweredividedinto5groups,includingcontrolgroup,pcdna3.1(+)vectorgroup,pcdna3.1 (+)/RSK2group,siRNA negativecontrolgroupandsirna RSK2group.Controlgroupwastransfected withnothing,theotherfourgroupsweretransfectedwithpcdna3.1(+)emptyplasmid,pcdna3.1 (+)/RSK2,siRNA negativecontrolandsirna RSK2,respectively.At48hposttransfection,the RT PCRandwesternblotingwererespectivelyusedtodetecttheexpresionofmRNA andproteinof RSK2.CCK8asaywasusedtomeasuretheproliferationability.Andflowcytometrywasusedtodetect apoptosisandcelcycle.results:theresultsofrt PCRandWesternblotingshowedthatthemRNA andproteinofrsk2ofpcdna3.1(+)/rsk2groupweresignificantlyhigherthanthoseoftheotherfour groups(p<0.01).incontrast,themrnaandproteinofrsk2ofsirna RSK2groupwereremarkably lowerthanthoseoftheotherfourgroups(p<0.01).theresultsofcck8asayindicatedthatoverex [ 作者简介 ]FarmanAli(1988 ), 男, 硕士研究生 ; 王炳芳 ( 通讯作者 ), 主任医师, 硕士生导师,E mail:shbingfang@163.com

2 220 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 27 卷 presionofrsk2genepromotedtheproliferationofsmmc 7721cels(P<0.01).Flowcytometryre sultsshowedthatrsk2genesilencingblockedthecelcycleing1phase(p<0.01),anddecreasedcel proliferationability(p<0.01).theapoptosisrateofsirna RSK2groupwassignificantlyhigherthan thatoftheotherfourgroups(p<0.01),buttheapoptosisrateofpcdna3.1(+)/rsk2groupwasnot evidentlydiferentfromthatofthecontrolgroup(p>0.05).conclusion:over expresionofrsk2gene promotedtheproliferationofsmmc 7721cels,withoutanyefectoncelapoptosis.TheRSK2genesi lencingcouldinhibitthecelproliferationandpromotetheapoptosis. [Keywords] RSK2;hepatocelularcarcinoma;celproliferation;apoptosis P90 核糖体 S6 激酶 2(ribosomalS6kinase2, RSK2) 基因位于人染色体 Xp22.2, 属于 Ras MAPK 信号通路下游的 RSK 家族成员, 最初由 Erison 等从非洲爪蟾卵中分离提取出 ; 该家族包含 4 个成员, 即 RSK1 RSK2 RSK3 RSK4 [1-2] 近来, 研究发现 RSK 与肿瘤的发生发展以及治疗关系密切其中, RSK2 在不同的肿瘤中扮演不同的角色, 如在乳腺癌骨肉瘤中参与细胞增殖, 而在头颈部鳞癌参与肿瘤转移侵袭 [3-5] 但是,RSK2 与肝癌的关系尚不清楚, 因此, 本研究主要探究 RSK2 基因表达变化对肝癌 SMMC 7721 细胞增殖与凋亡的影响 1 材料与方法 1.1 材料人肝癌 SMMC 7721 细胞株由本实验室保存, pcdna3.1(+)/rsk2 重组质粒由本实验室构建, sirna RSK2 sirna 阴性对照 ( 上海吉凯基因化学技术有限公司 ),RSK2 单克隆抗体 GAPDH 抗体 ( 美国 Abcam 公司 ), 反转录试剂盒 RT PCR 试剂盒 ( 美国 Thermo 公司 ),HRP 标记的二抗化学发光试剂盒 CCK8 试剂盒 BCA 蛋白浓度测定试剂盒 RI PA 裂解液 ( 上海碧云天生物技术有限公司 ),DMEM 高糖培养基 Opti MEM 胰蛋白酶胎牛血清双抗 PBS( 美国 Gibco 公司 ) 1.2 方法细胞培养分组与转染人肝癌 MMC 7721 细胞用含 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培养基, 置于 37 5%CO 2 平衡湿度培养箱中培养当细胞密度达 70% ~80% 时消化传代将细胞分为 5 组, 对照组 pcdna3.1(+) 空质粒组 pcdna3.1(+)/rsk2 组 sirna 阴性对照组 sirna RSK2 组, 对照组不转染, 其余 4 组分别转染 pcdna3.1(+) 空质粒 pcd NA3.1(+)/RSK2 sirna 阴性对照 sirna RSK2; 分别接种于 6 孔板 ( 个 / 孔,3 个复孔 ) 和 96 孔板 (4000 个 / 孔,6 个复孔 ), 至细胞密度达到 50% ~60% 时, 进行相应转染 ; 将质粒或 sirna 转染试剂分别用 Opti MEM 稀释, 按固定比例混合, 常温避光孵育 30min; 加入到相应的培养板中, 培养 6 h; 更换 DMEM 高糖培养基, 继续培养 48h, 行后续实验荧光定量 PCR(RT PCR) 检测 RSK2mRNA 表达收集孔板中细胞, 按 Trizol 试剂盒说明书提取细胞总 RNA, 微量核酸分析仪测定 RNA 浓度和纯度 ;DEPC 水将 RNA 浓度稀释成 1μg/μL, 取 2 μl 行反转录合成 cdna; 然后按试剂盒行 RT PCR, 反应条件 :95 30s,57 45s,72 30s, 40 个循环以 GAPDH 作为内参用 2 -ΔΔCt 法计算 RSK2 基因的相对表达量, 引物序列见表 1 表 1 引物序列及扩增产物长度基因引物序列 (5-3 ) 产物长度 (bp) RSK2 上游 CCGGTTACACTCCATTTGCA 245 下游 ACAAGAGCAGCAGTCAGTCT GAPDH 上游 ACCACCATGGAGAAGGCTGG 528 下游 CTCAGTGTAGCCCAGGATGC 免疫印迹法检测 RSK2 蛋白表达收集 6 孔板内的细胞, 提取细胞总蛋白 ; 经 BCA 试剂盒定量, 取 20 μg 蛋白进行 12%SDS PAGE; 电转移至 PVDF 膜 ;5% 脱脂奶粉常温封闭 2h;RSK2 一抗 (1 1000)4 封闭过夜 ;TBST 充分洗涤 3 次, 每次 10min;HRP 标记的二抗 (1 1000) 常温孵育 2 h;tbst 充分洗涤 3 次, 每次 10min; 化学发光显色, 最后用化学发光仪进行显影, 以 GAPDH 作为内参 CCK8 检测细胞活力取中接种于 96 孔板的 5 组细胞, 设置空白对照组, 每组 6 个复孔 ; 转染结束前 2h, 每孔加入 10μLCCK8 试剂, 孵育 1~3h; 然后用全自动酶标仪测 450nm 波长时各孔 D 值, 实验重复 3 次流式细胞仪检测细胞凋亡取转

3 第 3 期 FarmanAli, 等.RSK2 基因对肝癌 SMMC 7721 细胞增殖与凋亡的影响 221 染结束后的人肝癌 MMC 7721 细胞, 预冷 PBS 离心洗涤 2 次 ; 重悬于 400μL 凋亡试剂盒缓冲液中, 调整浓度为 (0.25~1.0) 10 7 /ml; 加入 5μLAnnex inv FITC, 室温避光孵育 5min; 加入 10μLPI,4 避光孵育 5min, 流式细胞仪检测流式细胞仪检测细胞周期细胞分组同 1.2.1, 各组细胞转染结束后, 收集细胞, 预冷 PBS 洗涤 2 次 ;70% 乙醇固定过夜 ; 离心后重悬于凋亡试剂盒缓冲液中 ; 加入 20μLRNA 酶于 37 恒温培养箱孵育 30min; 加入 400μL 碘化丙啶,4 避光孵育 30min; 流式细胞仪检测, 每组 3 个复孔 1.3 统计学分析数据以均数 ± 标准差 ( x±s) 珋表示, 采用 SPSS 17.0 和 GraphPadPrism5.0 软件进行统计学分析, 组间差异采用单因素方差分析, 进一步采用双尾 t 检验比较两组均数差异,P<0.05 表示差异具有统计学意义, 每组实验均独立重复 3 次 2 结果 2.1 SMMC 7721 转染效果评价转染 48h 后,RT PCR 和免疫印迹检测结果显示, 与对照组比较,pcDNA3.1(+) 空质粒组 sirna 阴性对照组 RSK2mRNA 表达差异无统计学意义 ( 均 P>0.05);pcDNA3.1(+)/RSK2 组 RSK2 mrna 和蛋白表达量明显高于其他 4 组 ( 均 P<0. 01);siRNA RSK2 组中 RSK2mRNA 和蛋白表达量明显低于其他 4 组 ( 均 P<0.01) 见图转染 RSK2 对细胞活性的影响转染结束后,5 组细胞活性比较差异具有统计学意义 (F=55.62,P<0.01) 其中,pcDNA3.1 (+)/RSK2 组细胞活性明显高于其他 4 组 (P 均 < 0.01), 而 sirna RSK2 组细胞活性明显低于其他 4 组 (P 均 <0.01), 如图 2 所示, 说明过表达 RSK2 可以促进细胞增殖, 沉默 RSK2 对细胞活性具有一定的抑制作用 2.3 RSK2 基因促进 SMMC 7721 细胞周期细胞周期分析结果显示, 转染 48h 后,pcD NA3.1(+)/RSK2 组细胞 G0/G1 期比例明显低于其他 4 组 ( 均 P<0.01),G2/M 比例明显高于其他 4 组 ( 均 P<0.01); 同时,RSK2 sirna 组细胞 G0/G1 期比例明显高于其他 4 组 ( 均 P<0.01),G2/M 比例明显低于其他 4 组 ( 均 P<0.01), 说明 RSK2 基因沉默后细胞增殖能力下降 ( 图 3) 1: 对照组 ;2:pcDNA3.1(+) 空质粒组 ;3:pcDNA3.1(+)/ RSK2 组 ;4:siRNA 阴性对照组 ;5:siRNA RSK2 组 ;a:p< 0.01, 与 pcdna3.1(+)/rsk2 组比较 ;b:p<0.01, 与 sirna RSK2 组比较图 1 转染 RSK2 后细胞 RSK2mRNA 和蛋白的表达 1: 对照组 ;2:pcDNA3.1(+) 空质粒组 ;3:pcDNA3.1(+)/ RSK2 组 ;4:siRNA 阴性对照组 ;5:siRNA RSK2 组 ;a:p< 0.01, 与 pcdna3.1(+)/rsk2 组比较 ;b:p<0.01, 与 sirna RSK2 组比较图 2 转染 RSK2 促进细胞的活性 2.4 转染 RSK2 对细胞凋亡影响 5 组细胞凋亡率比较差异具有统计学意义 (F= 62.64,P<0.01),pcDNA3.1(+)/RSK2 组细胞凋亡率与对照组 pcdna3.1(+) 空质粒组 sirna 阴性对照组比较, 无明显差异 ( 均 P>0.05), 而 sir NA RSK2 组凋亡率明显高于其他 4 组 (P<0.01) 见图 4 3 讨论 RSK2 蛋白作为一种高度保守的丝氨酸 / 苏氨酸激酶, 主要表达于人骨骼肌心肌和胰腺 [6] 有文献报道,RSK 通过 MAPK 信号通路调节肿瘤细胞

江苏大学学报医学版第卷Ｐ１与ｐｃ１Ｋ组比较ｂＰ１与Ｋ组比较图３细胞周期的流式细胞检测结果１对照组ｐｃ１空质粒组３ｐｃ１Ｋ组４阴性对照组５Ｋ组Ｐ１与Ｋ组比较图４转染Ｋ后细胞凋亡率变化的增殖后来研究发现Ｋ蛋白家族不仅仅在亡还需要ＴｕＨｏｃｈｔ等方法进一步验证此ＭＡＰＫ信号通路中发挥作用

4 江苏大学学报医学版第卷Ｐ１与ｐｃ１Ｋ组比较ｂＰ１与Ｋ组比较图３细胞周期的流式细胞检测结果１对照组ｐｃ１空质粒组３ｐｃ１Ｋ组４阴性对照组５Ｋ组Ｐ１与Ｋ组比较图４转染Ｋ后细胞凋亡率变化的增殖后来研究发现Ｋ蛋白家族不仅仅在亡还需要ＴｕＨｏｃｈｔ等方法进一步验证此ＭＡＰＫ信号通路中发挥作用Ｋ一旦被激活就会外本研究只从细胞增殖与凋亡方面进行检测与分磷酸化细胞内多种蛋白和转录因子从而调控细胞增析存在一定的局限性有文献报道特异性沉默肺８其腺癌细胞的Ｋ可诱导细胞凋亡抑制细胞侵袭中Ｋ定位于细胞质经促细胞分裂原血清等刺ｗ小转移１１因此后续研究中还需应用Ｔｒ激后首先易位至细胞膜被激活后一部分进入细胞室法检测细胞侵袭情况是否改变本研究只选择核一部分继续停留在胞质中根据细胞微环境的不Ｓ１一种肝癌细胞株还需要在其他细胞株殖细胞周期以及自噬等多种细胞生命活动同分别磷酸化不同的底物因而发挥不同的作用９中进行证实Ｋ家族每一个蛋白都有不同的功现已证实Ｋ蛋白表达水平在恶性肿瘤组织中较能还需要更加严密的细胞信号转导研究证实正常组织偏高１尤其在肺腺癌中表达最高ＫＫ家族与肝癌的相关性可能参与肿瘤的形成涉及肿瘤细胞的增殖迁移侵袭等而且在不同的肿瘤细胞中发挥的作用不同本研究利用Ｋ在肝癌细胞中的表达特点综上所述Ｋ基因过表达可促进肝癌细胞Ｓ１的增殖对细胞凋亡无影响特异性沉默Ｋ则抑制Ｓ１细胞增殖促进细胞凋分别通过构建Ｋ基因高表达质粒和ＫＲ亡本研究只是初步证明Ｋ与肝癌细胞的关系ＮＡ特异性沉默Ｋ基因双向证明Ｋ基因与其确切机制还需进一步的实验研究肝癌细胞增殖与凋亡的关系Ｋ低表达可抑制细胞增殖促进细胞凋亡与Ｋ为促癌基因相参考文献符Ｋ高表达后虽然促进细胞增殖但细胞凋１ＡｊｕｍＲＢＪＴｈＫｆｍｙｏｆｋｍｒ亡无明显变化分析认为肝癌细胞Ｋ的基础ｇｇｒｏｃｕｒｇｇＪＮｔｒｖｍｏＣ表达量高但还未达到抑制凋亡的效果另一方面Ｂｏ８９１４５８本实验只应用了流式细胞术一种方法检测细胞凋下转第８页

5 228 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 27 卷 tionofcancer:posibilitiesandchalenges[j].nano medicine,2016,12(2): [4] LammersT,KieslingF,HenninkWE,etal.Drugtar getingtotumors:principles,pitfalsand(pre )clinical progres[j].jcontrolrelease,2012,161(2): [5] KouchakzadehH,ShojaosadatiSA,TahmasebiF,etal. Optimizationofananti HER2monoclonalantibodytar geteddeliverysystemusingpegylatedhumanserumal buminnanoparticles[j].intjpharm,2013,447(1/ 2): [6] ShanXH,WangP,XiongF,etal.MRIofhigh glucose metabolismtumors:astudyincelsandmicewith2 DG modifiedsuperparamagneticironoxidenanoparticles [J].MolImagingBiol,2016,18(1): [7] ThomasdeMontprévileV,QuilhotP,ChalabreyseL, etal.glut 1intensityandpaternofexpresioninthy micepithelialtumorsarepredictiveofwho subtypes [J].PatholResPract,2015,211(12): [8] AdekolaK,RosenST,Shanmugam M,etal.Glucose transportersincancermetabolism[j].curopinon col,2012,24(6): [9] WilhelmC,BiloteyC,RogerJ,etal.Intracelularup takeofanionicsuperparamagneticnanoparticlesasa functionoftheirsurface coating[j]. Biomaterials, 2003,24(6): [10] 冯敏, 潘仕荣, 张静夏, 等. 两性霉素 B/ 聚乙二醇聚谷氨酸苄酯纳米粒的体外细胞摄取研究 [J]. 中国药科大学学报,2005,36(4): [11] 刘定斌, 谢燕, 邵华武, 等. 利用表面上的小分子控制细胞黏附 [J]. 化学进展,2007,19(12): [12] KaushikNK,KaushikN,YooKC,etal.Lowdosesof PEG coatedgoldnanoparticlessensitizesolidtumorsto coldplasmabyblockingthepi3k/akt drivensignaling axistosupprescelulartransformation byinhibiting growthandemt[j].biomaterials,2016,87: [13] 浦鸣, 计剑, 李晓林, 等. 反应性梳状聚乙二醇改性聚酯薄膜表面及其内皮细胞相容性的研究 [J]. 高等学校化学学报,2006,27(5): [14] YangSH,LinJ,LuF,etal.Contrast enhancedsus ceptibilityweightedimagingwithultrasmalsuperpara magneticironoxideimprovesthedetectionoftumorvas cularityinahepatocelularcarcinomanudemousemodel [J].JMagnResonImaging,2016,44(2): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 何承志 ( 上接第 222 页 ) [2] RomeoY,ZhangX,RouxPP.Regulationandfunction ofthersk familyofproteinkinases[j].biochem J, 2012,441(2): [3] QiuQ,JiangJ,LinL,etal.DownregulationofRSK2 influencesthebiologicalactivitiesofhumanosteosarcoma celsthroughinactivatingakt/mtorsignalingpathways [J].IntJOncol,2016,48(6): [4] ZhaoH,MartinTA,DaviesEL,etal.TheClinicalIm plicationsofrsk1 3inHumanBreastCancer[J].Anti cancerres,2016,36(3): [5] 岳萌, 刘雪娇, 丁妍, 等.Bufalin 通过细胞外信号调节激酶 /P90 核糖体 S6 激酶 2 通路对人食管癌细胞裸鼠移植瘤增殖及凋亡的影响 [J]. 中华肿瘤杂志, 2016,38(5): [6] ZeniouM,DingT,TrivierE,etal.Expresionanalysis ofrskgenefamilymembers:thersk2gene,mutated incofin Lowrysyndrome,isprominentlyexpresedin brainstructuresesentialforcognitivefunctionandlearn ing[j].hummolgenet,2002,11(23): [7] ChoYY.RSK2anditsbindingpartnersincelprolifera tion,transformationandcancerdevelopment[j].arch PharmRes,2017,40(3): [8] AnjumR,BlenisJ.TheRSKfamilyofkinases:emer gingrolesincelularsignaling[j].natrevmolcel Biol,2008,9(10): [9] RichardsSA,DreisbachVC,MurphyLO,etal.Char acterizationofregulatoryeventsasociatedwithmem branetargetingofp90ribosomals6kinase1[j].mol CelBiol,2001,21(21): [10] 陈康杏, 王籽又, 黄燕霞, 等.RSK2 与恶性肿瘤的关系及其抑制剂的研究进展 [J]. 中国病理生理杂志, 2015,31(10): [11] Dehan E, Basermann F, GuardavaccaroD, etal. βtrcp andrsk1/2 mediateddegradationofbimelin hibitsapoptosis[j]. MolCel,2009,33(1): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 刘星星

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot