4 第 4 卷 材料人结肠癌源性肿瘤相关成纤维细胞系 ( 江苏齐氏生物公司 ), 人结肠癌细胞系 ( 本实验室保存 ) 主要试剂 试剂盒 ( 日本同仁化学研究所 ), 吡非尼酮 ( 公司 ),!!# 及总 %& 提取试剂盒 ( 天根生物科技 ( 北京 ) 有限公司 ); 高容量 '%& 反转录试剂盒

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1 第 卷 期 年 月 7)%& ) %!+*%& ' 1; 吡非尼酮抑制肿瘤相关成纤维细胞促进结肠癌细胞系 上皮间质转化的作用及机制 ( 天津医科大学总医院普通外科, 天津 ) 34 5!# %&'()*+,-./! 0#1 / :; (#%& '# ' (&)' : %&' *%+, -' -<=>?@ABC%.&& D: %&# /01 : )F0GH#@A 781I K (LM1N O 3434 *%+, RSNITU #O34 VK 0WX>?Y%.&& D@ QN /01 Z[ \] ^_I`abc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近年来肿瘤微环境在肿瘤发生发展中的关键作用被越来越多的人认识, 肿瘤微环境由多种细胞成分构成, 包括肿瘤相关成纤维细胞 (*%*@%)*%'+ ()(&%',) 免疫细胞 内皮细胞及间充质细胞 在这种异质性环境中, 是最主要的细胞, D 在肿瘤进展 侵袭及迁移过程中起着重要的作用!# %&' ()*+,-./01% &1!#%&%'2 有些研究认为 0/@ 等从而起到促进肿瘤 D@ 发生发展的作用 吡非尼酮 (:) 是一个有效的抗纤维化药物, 很多研究已经证实, 吡非尼酮可以改 D@ 变成纤维细胞分泌的多种细胞因子及生长因子 本研究旨在探讨吡非尼酮在结肠癌 诱导的 结肠癌细胞系侵袭 增殖 间质转化 (!) 中的作用及机制, 为结肠癌的治疗提供新的思路

2 4 第 4 卷 材料人结肠癌源性肿瘤相关成纤维细胞系 ( 江苏齐氏生物公司 ), 人结肠癌细胞系 ( 本实验室保存 ) 主要试剂 试剂盒 ( 日本同仁化学研究所 ), 吡非尼酮 ( 公司 ),!!# 及总 %& 提取试剂盒 ( 天根生物科技 ( 北京 ) 有限公司 ); 高容量 '%& 反转录试剂盒和 '!!# (()#*+( 公司, 美国 );,'-#(.#(#( '#( 单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体 ( #+(#(+ '-(**+, 美国 );/( * 发光液 (!##0* 公司, 美国 ),1 细胞因子,& 试剂盒 ( 北京达科为生物技术有限公司 ) 筛选药物浓度结肠癌细胞系 以 个 2 孔接种于 孔板, 吡非尼酮以 +2 不同浓度分别培养 细胞, 每组 个复孔, 培养 3 -, 加入 溶液,3 孵育 -, 4 ( 处检测吸光度 细胞培养在以下几种条件下培养结肠癌细胞系 : 含 的!,! 标准培养基培养 ('*(*); 含 +2 吡非尼酮 (5) 培养基培养 (5!);& 上清条件培养 (&!); 加入吡非尼酮 (5) 处理 & 细胞后的条件培养 (5&!) 实验结肠癌细胞 以 4 个 2 孔接种于 4 孔板,(6 上室以 4 个 2 室接种 & 细胞 分为 个 : 标准培养基培养 ('*(*), & 与 (6 共培养 (&!); 含 +2 5 的培养基 & 与 (6 共培养 (5&!) 每组 4 个复孔, 培养 -, 弃培养液, 每孔加入 溶液,3 孵育 4 #(, 每个复孔吸出 置于 孔板,4 ( 处检测吸光度 4 (6 实验 4 (6 侵袭实验 :!#+ 胶 7 稀释后以 包被 (6 上室底部膜, 在 (6 下室内加入含 8 细胞培养基, 上室内加入各组细胞的无胎牛血清培养基悬浮液, 上室内加入各组处理后的 细胞, 细胞数为, 3 培养 4 - 后, 用棉签拭去!#+ 胶, 将 (6 上室置于 48 多聚甲醛固定,8 结晶紫染色 #(, 倒置显微镜下计数移至微孔膜下层每 视野的细胞数, 随机计数 个高倍视野, 求平均值 4 (6 迁移实验 : 在 (6 下室中加入含 8 的培养基, 在上室中加入各组处理后的 细胞, 细胞数目为 个 2 室, 细胞悬液体积,3 培养 -, 用棉签拭去小室上面细胞, 将 (6 上室置于 48 多聚甲醛固定, 8 结晶紫染色 #(, 倒置显微镜下计数移至微孔膜下层每视野的细胞数, 随机计数 个高倍视野, 求平均值,& 取生长状态良好的对数生长期细胞, 按每孔 4 个细胞种于 4 孔板, 置于 3, 待细胞贴壁后以 +2 吡非尼酮浓度加药, 每组 个复孔 提取细胞上清, 采用,& 法检测 1 的分泌量 5 及 /( * 检测 细胞.#(#(,'-#( 表达水平 #9* 法分别提取结肠癌细胞各组中总 %&, 需测定基因引物序列,, '-#(, 上游 : 111&&&&1&, 下游 : 11&&1&&&11&11( 扩增片段长度 0);.#(#( 上游 : 111&1&&& 1&11&11&1, 下游 : &1 : 扩增片段长度 3 0;;1&5 ( 内参基因 ), 上游 : 1&&111&&1111&1, 下游 : &11&&1&11&1&1&, 法计算 %& 的相对表达量, 采用蛋白印迹法 (/( *) 检测.#(#( 和,'-#( 基因蛋白表达水平 运用统计软件 53 进行数据处理, 多组间均数比较采用单因素方差分析, 组内两两比较采用 法, 所有统计结果以 为差异有统计学意义标准 每个实验均进行了 次独立实验! 结肠癌细胞 接种于 孔板, 吡非尼酮以 +2 不同浓度分别培养 细胞, 培养 3 -, 试剂检测吸光度 统计结果显示 +2 均对 细胞增殖无抑制作用 (), 选取 +2 作为 5&! 组药物浓度 ( 表 ) 吸光度 空白 空白组 组 组两两比较无显著差异 ()

3 马博昭, 等 吡非尼酮抑制肿瘤相关成纤维细胞促进结肠癌细胞系 ) 上皮间质转化的作用及机制 ' % &%! 组分别与 &%! 组比较增殖效率受抑制, 差异有统计学意义 (), 表明 可以抑制 &( 与 ) 协同增殖作用 ; 与 &%! 组比较无明显差异 ()( 图 ', 表 ) 吸光度 ' ' &%! % &%! &! 组分别与 &! 组比较, 差异有统计学意 义 (3'), 与 &%! 组比较无明显差异 () %%&' %%&'! #! %%&' %%&'! #! 吸光度 ' ' &! 组 ' ' # &! 组 ' ' * )+,-(./00 *' )+,-(.00 侵袭实验 & %! 组与 %! % &%! 组 相比, 侵袭细胞数目 明显增多, 差异有统计学意义 ('), 表明 & 使 ) 细胞侵袭性增强 ;%! 组与比 较差异无统计学意义 (), 表明 不影响 ) 细胞侵袭能力 ;% &%! 组与相比差异无统计学意义 (), 表明 可以抑制 & 对 ) 细胞侵袭能力的影响 ( 图, 表 *)! 侵袭细胞计数 ( 个 ) # 迁移细胞计数 ( 个 )! 组 # % &! 组 #' &! 组 # # * )+,-(./00 迁移实验 &%! 组与 % &%! 组 相比, 迁移细胞数目明显增多, 差异有统计学意义 ('), 表明 & 使 ) 细胞迁移能力增强 ;%! 组与比较差异无统计学意义 (), 表明 不影响 ) 细胞迁移能力 ;% &%! 组与相比差异无统计学意义 (), 表明 可以抑制 & 对 ) 细胞迁移能力的影响 ( 图 *, 表 *) 1& &( )%' % 经 ' ' 2 吡非尼酮药物干预后,&( 分泌 )' 显著减少, 且随 剂量增加 )' 浓度递减, 各组与比较差异显著 ('), 说明 抑制 &( 分泌 )' 且存在剂量依赖关系 ( 表, 图 ) 不同药物浓度组 含量无明显差异 %! ' % &%! &%! 侵袭细胞个数 ' %! % &%! &%! 3'! #

4 M% 第 %M 卷 +41/043 L 迁移细胞个数 +B?)+A M % 组 对照!!!# *? +A +B *??) +B +A!! #%&'() #! %&' (#)*+#,- )'./0+.,1 '*2& 2'00 0#-' #- '*2& ),/3 * , %:;!< %*= >'+'2+#,-,1 %:;!< 浓度F GHF9I 66D#%D D%& 9HF9I %KLDM%#%6LD& D& 9HF9I %DL#%KD 9HF9I 6L&D6#6D D& 9HF9I M&%D%L#MD& #! #-. A#('-+#-/5;2*>&')#- 0 (BC %&' 'D3)'..#,- 0''0.,1 (BC9,1 A#('-+#- *-> 5;2*>&')#DL D GHF9I % & #- '*2& ),/3 *?@)+A 组 D666 #D&& D% &#D%&& L *?@)+B?)+A 组 D% &#DML 6 D% &#D%L +B?)+A 组 D%L #DM L DKK #D% 6LD KD6& # %! & :);<=>-081 D 789-1/81 D B 789-1/81 9'CB 表达水平 (P?)! 浓度 显著性差异!D& 说明 *?@ 可以抑制 +B? 诱导 5(%6 上皮间质转化 表 & 图 & & D%& D& D& 9HF9I 分别与 D%& D& D D& 9HF9I 各组比较 差异显著!!! D D%& D& 9HF9I 两组比较 无显著性差异!D& 其余各组 两两比较有显著性差异!!D!? , %:;!< %#& '( )*+'!,-./ / # 5(%6 % 789-1/81&:);<=>-081 ' ( ) * 与 对 照 组 *?@ ) +A 组 和 *?@ )+B? )+A 组 比 较 +B? )+A 组 789-1/81 的 9'CB 和蛋白表达水平升高 差异有统 计学意义!!D& :);<=>-081 的 9'CB 和蛋白表 达水平降低 差异有统计学意义!!D& *?@)+A 组与比较差异无统计学意义!D& 表明 *?@ 不影响 5(%6 细胞 789-1/81 :);<=>-081 表达 和 *?@)+B?)+A 组比较 789-1/81 的 9'CB 和蛋白及 :);<=>-081 的 9'CB 和蛋白表达水平无 N 5;2*>&')#- 9'CB 表达水平 #? >'+'2+#,-,1 %:;!< 图 B N 示各组细胞 789-1/81 :);<=>-081 9'CB 表达量 #-. A#('-+#-/5;2*>&')#- 0 (BC %&' 'D3)'..#,- 0''0.,1 (BC9,1 A#('-+#- *-> 5;2*>&')##- '*2& ),/3

5 ( 马博昭, 等 4 吡非尼酮抑制肿瘤相关成纤维细胞促进结肠癌细胞系 + 上皮间质转化的作用及机制 %#&!'# & 表达水平 & 表达水平 示各组细胞 %#&!'#!# 蛋白表达量,4!! #% &'& % #% %# 近年来肿瘤微环境在肿瘤发生发展中的关键作用被越来越多的人认识, 其众多的细胞成分如内 皮细胞 淋巴细胞 成纤维细胞等也被逐渐认知 尽管目前针对肿瘤微环境的免疫治疗已经取得了相当的成效, 但是炎症细胞如淋巴细胞, 单核 巨噬细胞及中性粒细胞的可塑性和异质性严重阻碍了免疫治疗的效果 在这种情况下, 肿瘤微环境中另一种重要的细胞, 可能成为改变肿瘤微环境并治疗肿瘤的新靶点 有些研究认为 通过提供结构支架和通过分泌大量的生长因子从而起到促进肿瘤发生发展的作用, 有助于肿瘤组织内稳态 和组织重塑 临床上部分结肠癌患者就诊时已处于中晚期, 己经失去手术治疗机会 而且有些患者手术后很快发生复发与转移 恶性肿瘤最主要的特征之一是转移, 肿瘤的转移是一个复杂的多级的生物学过程, 而肿瘤细胞获得侵袭转移能力的关键一步便是 的主要特征是上皮细胞表型标记物的表达下调或缺失 ( 如!#), 而间质细胞表型 标记物 ( 如 %#&!'#!# 等 ) 表达上调 能介导 发生的现象首先在细胞培养中 发现 分子主要通过 整合素信号传导途径促进 &( 主要是 &) 分子依赖的细胞转录过程的发生, 也可通过非 & 分子依赖信号传导途径和调控转录因子发挥作用引起 吡非尼酮是一个有效的抗纤维化药物, 但作用机制尚不清楚 目前研究显示吡非尼酮可以减弱成纤维细胞受到细胞生长因子如 刺激后的细胞增殖 纤维 () 化相关蛋白和细胞因子产生 目前, 吡非尼酮对结肠癌相关 的作用还需要进一步研究 吡非尼酮作为一种细胞因子抑制剂可以改变 * 成纤维细胞分泌的多种细胞因子及生长因子 本实验中, 利用 诱导结肠癌细胞 + 后发现, + 增殖能力增加, 间质表型标志物 %#&!'# 表达水平显著升高, 上皮表型标志物!# 表达水平显著降低, 差异具有统计学意义 这表明 可能通过分泌细胞因子促进 + 细胞 的发生 条件培养基培养 + 细胞后发现, 与相比, 吡非尼酮处理后 条件培养基促进 + 细胞增殖能力明显减弱,- 检测细胞培养上清, 结果显示, 使用吡非尼酮干预 后 分泌量显著降低, 但是 -,) 的分泌量在各组之间并未发生明显的变化 同时,.!'! /01' 及 结果显示, 吡非尼酮处理后 条件培养基与 + 细胞共培养以后, 相对于, 间质表型 %#&!'# 表达水平明显受抑制!00 实验表明, 吡非尼酮干预 后, 与未干预组相比肿瘤细胞的侵袭性和迁移性明显减弱 吡非尼酮通过抑制结肠癌相关 分泌, 抑制 + 细胞发生 可能是吡非尼酮的作用机制之一 综上所述, 随着对肿瘤微环境研究的深入, 吡非尼酮抑制肿瘤相关成纤维细胞 () 诱导的结肠癌细胞上皮 间质转化 () 可能作为结肠癌治疗及预后新思路 #,#1 2,.'/! 34! 1#'! 5#/1/0'67 # '&1 &#1!8#1&!'24 1' 9#1#,,(:)) ;!,,,!,.1 3 3,!' 04 &10'! 18#! #8#1 /!0'#!#8! 8!# # '! '&1 &#1!8#1&!'24!!,,*()):().,,1,,. +,!' 04! 1#'! 5#/1/0'!! &!'''# 1'!'#0 15 0!!00 ' 1 -,) #0# ' 24 1'!',*,():*))

6 :,; 第 +: 卷 和 *64 组血浆和脑组织中的促炎因子 36-/ 浓度均显著高于正常饮食组 *6?, 血浆和脑组织中的抑炎因子 36-8 水平均低于 *6?;- 周时, 经叶酸联合维生素治疗后 *64 组血浆和脑组织中的促炎因子 36-/ 降低, 抑炎因子 36-8 水平升高, 并且免疫组化也得到类似结果 因此, 我们推测 通过调节炎性反应进而影响高血压患者的脑组织病变 即 可促进炎症反应从而导致脑组织病变的发生, 下调免疫反应后可起到保护作用 - 5 & * # # # '' (2 #' ( +8--:0 + 5? # 2 * #'# B# # # # ' #' ' '' # B # # '#(2 #' # +8-/;,0-,+=,. D ( # 2 4 # #B & # #' &'' '# &## B# #'# '#(2?? 7# +,-/://0.+ : ' 72 7 B ' ' # # '#(2 7 ( & * 3# '?& & +,-/.-.0 */, C'# 5' *% '# '' ' #' # '# (% # *?' +,-;--0.. 张宇 王林 % 同型半胱氨酸与 型高血压研究进展 (% 中华老年病研究电子杂志 +,-.-0., / F # % &'' 4-/G4' ## B# #''# '' '#(% 3# (? <& &# +,-.0 -,- ; * > >B # >-+6>6# #'## ' 6' ''' # ## B# '# # '#(%!# 5'#'?!' +,,.-.0 -: = '' %? '# #(% '#'! 4'# +,-,0 -= -, B 4 # % 3' 4# # &'# # * 3#!# 3#?'' * #'(% ( '! +,-:=+0,. -- ' # % & ' ' #' #' ## # #''# '# '#'# '' '#' &'' '#' (% +,- :/=0 -;; -+ ( D # % *# #B ' 6 ' < # '# H# B# '#(%? < '# +,-.;/ 徐志红 陆国平 吴春芳 % 高同型半胱氨酸血症对内皮细胞炎症反应的促发作用及其干预性研究 (% 上海医学 +,,/ : 孔炜 王宪 % 免疫炎症反应与动脉粥样硬化 高同型半胱氨酸血症促进动脉粥样硬化早期发病的免疫炎症机制 (% 中国动脉硬化杂志 +,,/-/0 + -?' 5 * #' # %?'' ' #' 4 '#' ' G' 6# #' ' 36-,(% ' ( 3 +,-:-0 -;, - # & # % #6#' # <6-0 ## 36-, ' # #' < #(% 3# 3' +,,..-,G / C' ' & # % 3 6-/ ' #0 ' ' # #' # (% 4' +, , -; HB! B & 5 # % 5 #' -/ '# #??+??- ' ' ' # (% 3# ( +,-/-;0 &0 -,,, -=?#!! * ' ( # % 4 ' # &'# # '(% C # C # +,-- -;-++0+ (+,-;6,-6+= 收稿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收稿 )

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