中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2014, 36(7): DOI: /cjcb USP9X 低表达通过下调 Mcl-1 促进肝癌细胞凋亡 胡惠雯 1 汤成泳 2 蒋清虎 1 罗伟 1 刘济铭

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1 Chinese Journal of Cell Biology 204, 36(7): DOI: 44/cjcb 低表达通过下调 Mcl- 促进肝癌细胞凋亡 胡惠雯 汤成泳 2 蒋清虎 罗伟 刘济铭 魏续福 刘锐 吴忠均 * ( 重庆医科大学附属第一医院肝胆外科, 重庆 40006; 2 重庆医科大学附属第一医院药剂科, 重庆 40006) 摘要 研究抑制泛素特异性蛋白酶 9X(ubiquitin-specific protease 9X, ) 对人肝癌 (primary hepatocellular carcinoma, HCC) 细胞 SMMC772 和 HepG2 中髓细胞白血病 -(myeloid cell leukemia-, Mcl-) 蛋白的表达调控及对细胞凋亡和生长活力的影响 实验分为 -sirna 组和阴性 对照 组两组进行分析 通过 Western blot 技术分别检测 在肝癌细胞 SMMC772 HepG2 和正常人肝细胞株 L02 中的蛋白表达情况 ; 应用化学合成 -sirna 转染肝癌细胞 SMMC772 和 HepG2, 通过 Western blot 流式细胞仪和 MTT 检测转染前后 Mcl- 的蛋白表达差异以及细胞凋 亡和生长活力变化 结果表明, 在肝癌细胞 SMMC772 和 HepG2 中的蛋白表达水平均高于 正常肝细胞 L02(t=5.55, P=00; t=9.7, P=0); SMMC772 和 HepG2 细胞中抑制 能 明显下调 Mcl- 的蛋白表达, 并导致细胞凋亡增加和生长活力降低 提示, 肝癌细胞 SMMC772 和 HepG2 中 表达上调 ; 表达降低可能通过下调 Mcl- 的蛋白表达进而诱导人肝癌细胞 SMMC772 和 HepG2 的凋亡 基因 - 关键词 泛素特异性蛋白酶 9X; 原发性肝细胞肝癌 ; 细胞凋亡 ; 细胞生长活力 ; 髓细胞白血病 Low Expression of Promoted Apoptosis of Hepatoma Cells Through Mcl- Down-regulation Hu Huiwen, Tang Chengyong 2, Jiang Qinghu, Luo Wei, Liu Jiming, Wei Xufu, Liu Rui, Wu Zhongjun * ( Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 40006, China; 2 Department of Clinical Pharmacology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 40006, China) Abstract In this paper, we investigated the regulation of inhibiting ubiquitin-specific protease 9X () on myeloid cell leukemia- (Mcl-) protein expression and its effect on apoptosis and viability of human hepatocellular carcinoma (HCC) cells SMMC772 and HepG2. There were two groups in the study, -sirna group and group. The protein expression of was detected in SMMC772, HepG2 and normal human liver cell line L02. SMMC772 and HepG2 cells were infected with -sirna, and cell apoptosis and cell growth viability were analyzed by flow cytometry and MTT. Mcl-, a potential target of, was detected by Western blot. We found that the protein expressions of in SMMC772 and HepG2 were both higher than that in L02 (t=5.55, P=00; t=9.7, P=0). Inhibiting expression of in SMMC772 and HepG2 cells obviously 收稿日期 : 接受日期 : 国家自然科学基金 ( 批准号 : 87562) 重庆市科委基金项目( 批准号 : cstc203yykfa000) 和重庆市渝中区科技计划项目 ( 批准号 : 20308) 资助的课题 * 通讯作者 Tel: , wzjtcy@26.com Received: February 5, 204 Accepted: March 26, 204 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No.87562), the Natural Science Foundation of Chongqing (Grant No.cstc203yykfA000) and the Science Foundation of Yuzhong District of Chongqing (Grant No.20308) *Corresponding author. Tel: , wzjtcy@26.com 网络出版时间 : :8 URL:

2 94 研究论文 suppressed Mcl- protein expression as well as increased cell apoptosis and decreased cell viability. These results suggested that expression of was upregulated in hepatoma cells SMMC772 and HepG2, and inhibiting might induce cell apoptosis in hepatocellular carcinoma cells SMMC772 and HepG2 by down-regulating Mcl- protein expression. Key words ubiquitin-specific protease 9X; hepatocellular carcinoma; cell apoptosis; cell viability; myeloid cell leukemia- 原发性肝细胞肝癌 (hepatocellular carcinoma, HCC) 是我国常见的恶性肿瘤之一, 发病率和死亡率极高, 而其发生发展是一个复杂的多因素 多 [] 步骤过程 因此, 深入研究原发性肝细胞肝癌发生发展的分子机制显得尤为重要 研究发现, 泛素特异性蛋白酶 9X(ubiquitin-specific protease 9X, ) 能通过去泛素化底物蛋白来影响肿瘤细胞增殖 黏附和信号转导, 是肿瘤演进的重要因素之一, 在调节蛋白酶体的活性 器官的发生 肿瘤的 [2-6] 形成以及转录调控等方面都具有重要的作用 目前研究发现, 在淋巴瘤 结肠癌 肺癌和乳腺癌中表达上调, 抑制 可通过调控髓细胞白血病 -(myeloid cell leukemia-, Mcl-) 蛋白诱 [7-0] 导细胞凋亡和抑制增殖 Mcl- 是凋亡抑制蛋白, 由于其在肿瘤中高表达而备受关注 Mcl- 在肝癌中也高表达, 其高表达与抑制肿瘤细胞凋亡有 [-2] 关 目前, 与肝癌发生发展的关系尚不清楚, 本实验通过检测 在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达情况, 并在肝癌细胞中抑制 表达从而研究其功能, 初步探讨 在肝癌发生发展中的作用 材料与方法. 材料 RPMI640 培养基 ( 美国 Gibco 公司 ); 胎牛血清 ( 杭州四季清公司 ); MTT( 美国 Sigma 公司 ); RNA 提取试剂盒 逆转录试剂盒和 Taq DNA 聚合酶 (TaKaRa 公司 ); 兔源抗 抗体 ( 多抗, 武汉三鹰生物技术有限公司 ); 鼠源抗 Mcl- 抗体 ( 单抗, 天津三箭生物技术有限公司 ); 鼠源抗 抗体 ( 单抗, 天津三箭生物技术有限公司 ); ECL 化学发光液 ( 碧云天生物有限公司 ); 二抗均购于碧云天生物有限公司 ; 化学合成 sirna( 上海吉玛制药技术有限公司 ); 转染试剂 Lipofectamine2000( 天津三箭生物技术有限公司 ).2 方法.2. 细胞培养人肝癌细胞株 SMMC772 HepG2 和正常肝细胞株 L02 购自重庆医科大学生命科学院感染科实验室, 以含 0% 灭活胎牛血清的 RM640 培养基在 37 C 5% CO 2 条件下常规培养 5% 胰酶消化 传代, 取对数生长期细胞进行实验 细胞用 sirna 处理细胞 48 h 后, 用于建立下调 的细胞模型.2.2 sirna 干扰取对数生长期 SMMC772 和 HepG2 细胞接种于 6 孔板, 待长至 40%~50% 时加入 20 μmol/l 的 sirna(-sirna 序列, 正义链 : 5 - UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3, 反义链 : 5 -ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3 ; sirna 序列, 正义链 : 5 -AGA AAU CGC UGG UAU AAA UUU TT-3, 反义链 : 5 -AAA UUU AUA CCA GCG AUU UCU TT-3 ) 48 h 后收集细胞, 提取总 RNA 和总蛋白质, 进行 RT-PCR 和 Western blot 分析 ; 或将相同处理的细胞消化 重悬进行凋亡实验.2.3 RT-PCR 检测采用 Trizol 法提取总 RNA, 分光光度法检测 RNA 浓度 参照文献 [3] 设计引物, 以 GAPDH 为内参基因 取 300 ng 总 RNA 按逆转录试剂盒说明书合成 cdna 序列, 然后进行 PCR 反应, 条件如下 : 94 C 预变性 3 min; 94 C 变性 30 s, 52 C 退火 35 s, 72 C 延伸 50 s, 共 30 个循环 ; 最后 72 C 延伸 0 min GAPDH 以相同条件反应 30 个循环 PCR 产物在 2% 琼脂糖凝胶中电泳 30 min 后显影 显影结果经 Quantity One 软件进行图片分析, 计算净光密度值 并以 Bio-Image Analysis System 进行半定量分析, 结果以相对光密度值 (relative optical density, ROD) 面积 (mm 2 ) 表示 mrna 的相对含量 =( 目的条带 ROD 面积 )/(GAPDH 条带 ROD 面积 ) 序列 ( 上游引物 : 5 -AGA TGA CCA AGA TGC CCC AGA TGA G-3, 下游引物 : 5 -TTC ACC GCC TTC ATA ATT TTC TTG TGC-3 ); GAPDH 序列 ( 上游引物 : 5 -GAG CCA AAA GGG TCA TCA

3 胡惠雯等 : 低表达通过下调 Mcl- 促进肝癌细胞凋亡 95 TCT C-3, 下游引物 : 5 -AAA GGT GGA GGA GTG GGT G-3 ).2.4 Western blot 分析收集 SMMC772 和 HepG2 细胞, 加入裂解液裂解细胞提取总蛋白 BCA 法 测定蛋白浓度后, 加入 5 蛋白上样缓冲液, 沸水 煮 0 min 经 8% SDS-PAGE 电泳分离后, 电转至 5 μm PVDF 膜, 5% 脱脂牛奶封闭 h, 4 C 分别 与抗 (: 500) 抗 Mcl-(: 000) 和内参 (:5 000) 抗体过夜, PBST 漂洗 3 次后用辣 根过氧化物酶偶联的二抗 (:3 000) 孵育 h, 漂洗后, 用 ECL 化学发光试剂显色, 在 ChemGel Doc 成像仪 (Bio-Rad, 美国 ) 分析结果 显影结果经 Quantity One 软件进行图片分析, 计算净光密度值 并以 Bio-Image Analysis System 进行半定量分析, 结果以 ROD 面积 (mm 2 ) 表示 蛋白的相对含量 =( 目的蛋白条带 ROD 面积 )/( 条带 ROD 面积 ).2.5 流式细胞术检测细胞凋亡情况 6 孔板中的 SMMC772 和 HepG2 细胞转染后 48 h, 收集细胞, 用 预冷的 PBS 洗涤细胞 3 次, r/min, 离心 5 min, 收 集细胞 加入 500 μl 的缓冲液悬浮细胞并加入 5 μl 双染凋亡试剂混匀后, 再加入 5 μl 碘化丙啶, 混匀 ; 室温 避光 反应 5 min 后, 用流式细胞仪检测细 胞凋亡情况.2.6 MTT 法检测细胞活力按照每孔 个细胞的密度铺 96 孔板, 每个浓度设 5 个平行孔, 待细胞生长至对数期转染, 分别在转染后 24, 48, 72 h 加入 MTT(5 mg/ml) 试剂, 每孔 20 μl, 继续培养 4 h, 弃去细胞培养液, 每孔加入 50 ml DMSO, 摇床避光摇 0 min, 然后用酶标仪在 490 nm 处比色, 绘制生长曲线 kda The ratio of / protein 0..3 统计学处理所有的统计学分析均在统计学软件 SPSS 7.0 上进行, 所有的实验至少重复 3 次, 实验数据用均数 ± 标准差表示, 两组间比较采用 t 检验, P<5 为差异显著, P< 为差异极显著 2 结果 2. 在肝癌细胞 SMMC772 HepG2 中蛋白表达上调 Western blot 检测 SMMC772 HepG2 和 L02 中 的蛋白表达, 发现 在肝癌细胞 SMMC772 和 HepG2 中的蛋白表达水平均较正常肝细胞 L02 中高 (P<), 证明 在 SMMC772 和 HepG2 中蛋白表达上调 ( 图 ) 2.2 转染后肝癌细胞 SMMC772 和 HepG2 中 的 mrna 和蛋白表达被抑制 RT-PCR 和 Western blot 分别检测转染后 SMMC772 和 HepG2 细胞中不同处理组 的 mrna 和蛋白表达, 发现两种细胞中 -sirna 组 的 mrna 和蛋白表达水平较各自 组均下降, 差异有统计学意义 (P<5), 证明转染 sirna 后 SMMC772 和 HepG2 中 的 mrna 和蛋白表达被抑制 ( 图 2 和图 3) 2.3 抑制 表达诱导肝癌细胞 SMMC772 和 HepG2 的凋亡流式细胞术检测转染 SMMC772 和 HepG2 细胞 48 h 后各组细胞的凋亡水平, 结果显示, sirna 组的肝癌细胞凋亡率均高于各自 组, 差异有统计学意义 (P<), 证明抑制 表达可促 2 3 A: Western blot 检测 在各组细胞中的蛋白表达水平 ; B: 在各组细胞中的蛋白相对表达量统计图 : SMMC772 细胞 ; 2: HepG2 细 胞 ; 3: L02 细胞 P<, 与 L02 组比较 A: the protein expression of in three cell groups by Western blot; B: quantification of protein levels relative to that of in three cell groups. : SMMC772; 2: HepG2; 3: L02. P< vs L02 group. 图 在肝癌细胞 SMMC772 和 HepG2 中蛋白表达上调 Fig. protein levels were up-regulated in SMMC772 and HepG2 cells

4 96 研究论文 GAPDH (C) -sirna -sirna A: sirna 干扰后 的 mrna 水平变化 ; B: sirna 干扰后 的 mrna 相对表达量的统计图 ; C: sirna 干扰后 的蛋白水平变化 ; D: sirna 干扰后 的蛋白相对表达量的统计图 *P<5, P<, 与 组比较 95 bp 542 bp A: RT-PCR analysis of mrna; B: quantification of mrna levels relative to that of GAPDH; C: Western blot analysis of protein; D: quantification of protein levels relative to that of. *P<5, P< vs group. 图 2 转染后肝癌细胞 SMMC772 中 的 mrna 和蛋白表达被抑制 (D) 290 kda The ratio of /GAPDH mrna The ratio of / protein sirna -sirna Fig.2 mrna and protein levels of were inhibited in SMMC772 cells after sirna interference (C) GAPDH -sirna -sirna 95 bp 542 bp 290 kda A: sirna 干扰后 的 mrna 水平变化 ; B: sirna 干扰后 的 mrna 相对表达量的统计图 ; C: sirna 干扰后 的蛋白水平变化 ; D: sirna 干扰后 的蛋白相对表达量的统计图 *P<5, P<, 与 组比较 A: RT-PCR analysis of mrna; B: quantification of mrna levels relative to that of GAPDH; C: Western blot analysis of protein; D: quantification of protein levels relative to that of. *P<5, P< vs group. 图 3 转染后肝癌细胞 HepG2 中 的 mrna 和蛋白表达被抑制 (D) The ratio of /GAPDH mrna The ratio of / protein Fig.3 mrna and protein levels of were inhibited in HepG2 cells after sirna interference * * -sirna -sirna

5 97 胡惠雯等: 低表达通过下调Mcl-促进肝癌细胞凋亡 sirna 学学 sirna The percentage of cell apoptosis (%) 0 报 中国 细胞 生物 A: 流式细胞术检测不同处理组细胞的凋亡图; B: sirna干扰后不同处理组细胞的凋亡统计图 P<, 与组比较 A: the cell apoptosis of different treated groups by FCM; B: quantification of cell apoptosis in different treated groups. P< vs group sirna 图4 流式细胞术检测在SMMC772中不同处理组细胞的凋亡 Fig.4 The apoptosis of different treated groups in SMMC772 by FCM The percentage of cell apoptosis (%) sirna A: 流式细胞术检测不同处理组细胞的凋亡图; B: sirna干扰后不同处理组细胞的凋亡统计图 P<, 与组比较 A: the cell apoptosis of different treated groups by FCM; B: quantification of cell apoptosis in different treated groups. P< vs group. 图5 流式细胞术检测在HepG2中不同处理组细胞的凋亡 Fig.5 The apoptosis of different treated groups in HepG2 by FCM 使SMMC772和HepG2细胞凋亡(图4和图5) 各组细胞在490 nm处的吸光度值, 并绘制生长曲线 2.4 抑制表达降低肝癌细胞SMMC772 和HepG2的生长活力 MTT检测转染SMMC772和HepG2细胞48 h后 结果显示, -sirna组的肝癌细胞吸光度值均 低于各自组, 差异有统计学意义(P<), 证明抑 制表达降低SMMC772和HepG2的生长活力

6 98 研究论文 D P<, 与 组比较 P< vs group. 图 6 抑制 表达降低 SMMC772 肝癌细胞的生长活力 Fig.6 Suppression of SMMC772 cell growth viability by ( 图 6 和图 7) 2.5 抑制 表达使肝癌细胞 SMMC772 和 HepG2 中 Mcl- 的蛋白表达下调 Western blot 检测转染 SMMC772 和 HepG2 细 胞 48 h 后下游蛋白 Mcl- 的蛋白表达 结果显示, 与 各自 组比较, -sirna 组中 Mcl- 的蛋白表 达量下降, 差异有统计学意义 (P<), 证明在 SM- MC772 和 HepG2 中, 抑制 表达可下调 Mcl- 的蛋白表达 ( 图 8) Time (h) inhibiting expression of (C) Mcl- Mcl- -sirna -sirna -sirna 40 kda 40 kda (D) The ratio of Mcl-/ protein The ratio of Mcl-/ protein D P<, 与 组比较 P< vs group Time (h) 图 7 抑制 表达降低 HepG2 肝癌细胞的生长活力 Fig.7 Suppression of HepG2 cell growth viability by inhibiting expression of -sirna -sirna -sirna A: Western blot 检测转染后 SMMC772 细胞中 Mcl- 的蛋白水平 ; B: 转染后 SMMC772 细胞中 Mcl- 的蛋白相对表达量的统计图 ; C: Western blot 检测转染后 HepG2 细胞中 Mcl- 的蛋白水平 ; D: 转染后 HepG2 细胞中 Mcl- 的蛋白相对表达量的统计图 P<, 与 组比较 A: Western blot analysis of Mcl- protein in SMMC772; B: quantification of Mcl- protein levels relative to that of in SMMC772; C: Western blot analysis of Mcl- protein in HepG2; D: quantification of Mcl- protein levels relative to that of in HepG2. P< vs group. 图 8 抑制 表达使 SMMC772 和 HepG2 中 Mcl- 蛋白表达下调 Fig.8 Down-regulation of Mcl- protein expression in SMMC772 and HepG2 cells by inhibiting expression of 3 讨论肝细胞性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一, 全 球每年大约 60 万人死于肝癌 [4], 其发病率和死亡率 分别占所有肿瘤的第 6 位和第 3 位 [5], 鉴于如此严峻 的形势, 如何控制和治疗 HCC 成为亟待解决的问题 研究表明, 泛素蛋白酶体系统可以通过泛素化过程 降解靶蛋白, 进而调节细胞周期 基因转录和抗原 提呈等过程 [6-7] 是一种泛素特异性蛋白酶, 可作用泛素与底物蛋白之间的连接键将两者分离,

7 胡惠雯等 : 低表达通过下调 Mcl- 促进肝癌细胞凋亡 99 从而破坏泛素化过程, 抑制靶蛋白降解, 达到稳定靶 蛋白的目的, 此过程可使某些癌蛋白异常积聚, 促进 肿瘤的发生发展 [8,8] 近年研究表明, 参与多 种肿瘤的发生发展过程, 与促进肿瘤的发生发展及 预后密切相关 [9] 目前研究发现, 在淋巴瘤 结肠癌 肺癌和乳腺癌中都表达上调, 抑制肿瘤细 胞的凋亡, 发挥促进肿瘤发生发展的作用 [7-0] 本 研究发现, 在肝癌细胞 SMMC772 和 HepG2 中的表达高于正常肝细胞, 为了探讨 在肝癌 中的功能, 本研究在肝癌细胞 SMMC772 和 HepG2 中抑制, 流式细胞仪和 MTT 检测发现抑制 表达能促进细胞凋亡和抑制增殖 研究发现, Mcl- 是凋亡抑制基因, 在肝细胞 肝癌中, Mcl- 表达上调且可通过抑制肝癌细胞的 凋亡过程从而促进肝细胞肝癌的发展 [-2] 因此, 研究下调 Mcl- 能为抑制肝癌的发展提供有力的帮 助 Mcl- 是 的靶点之一, 在淋巴瘤中抑制 表达可以通过作用于 Mcl- 的多聚泛素链下调 其蛋白表达抑制癌症的发生 ; 在结肠癌和肺癌中, 抑 制 的活性可以通过促进 Mcl- 的泛素化降解 使 Mcl- 蛋白表达降低而产生凋亡 本研究应用 US- P9X-siRNA 转染人肝癌细胞 SMMC772 和 HepG2, 发 现 Mcl- 的蛋白表达明显下调, 提示在肝癌中 低表达也可以下调 Mcl- 的蛋白表达, 这在肝癌中首 次证明了 可以通过调控 Mcl- 影响肝癌的发生 发展过程 综上所述, 本研究推测抑制 表达可能通 过下调 Mcl- 蛋白表达从而诱导肝癌细胞凋亡, 但是 肝癌发生发展的过程比较复杂, 的下游靶点 可能不止一个, 因此在肝癌中 的功能及调控 机制仍需进一步的研究 参考文献 (References) Llovet JM, Burroughs A, Bruix J. Hepatocellular carcinoma. Lancet 2003; 362(9399): DiAntonio A, Hicke L. Ubiquitin-dependent regulation of the synapse. Annu Rev Neurosci 2004; 27: 杨波, 谢丛华. 泛素特异性蛋白酶 9X 与肿瘤. 国际肿瘤学杂 志 (Yang Bo, Xie Conghua. Ubiquitin specific peptidase 9x and tumor. International Journal of Oncology) 20; 38(2): Kitagawa K, Kotake Y, Kitagawa M. Ubiquitin-mediated control of oncogene and tumor suppressor gene products. Cancer Sci 2009; 00(8): Becuwe M, Herrador A, Haguenauer-Tsapis R, Vincent O, Léon S. Ubiquitin-mediated regulation of endocytosis by proteins of the arrestin family. Biochem Res Int 202; 202: Kapuria V, Peterson LF, Fang D, Bornmann WG, Talpaz M, Donato NJ. Deubiquitinase inhibition by small-molecule WP30 triggers aggresome formation and tumor cell apoptosis. Cancer Res 200; 70(22): Peddaboina C, Jupiter D, Fletcher S, Yap JL, Rai A, Tobin RP, et al. The downregulation of Mcl- via inhibition sensitizes solid tumors to Bcl-xl inhibition. BMC Cancer 202; 2: Sun H, Kapuria V, Peterson LF, Fang D, Bornmann WG, Bartholomeusz G, et al. Bcr-Abl ubiquitination and Usp9x inhibition block kinase signaling and promote CML cell apoptosis. Blood 20; 7(): Deng S, Zhou H, Xiong R, Lu Y, Yan D, Xing T, et al. Overexpression of genes and proteins of ubiquitin specific peptidases (USPs) and proteasome subunits (PSs) in breast cancer tissue observed by the methods of RFDD-PCR and proteomics. Breast Cancer Res Tr 2007; 04(): Schwickart M, Huang X, Lill JR, Liu J, Ferrando R, French DM, et al. Deubiquitinase stabilizes MCL and promotes tumour cell survival. Nature 200; 463(7277): Fleischer B, Schulze-Bergkamen H, Schuchmann M, Weber A, Biesterfeld S, Müller M, et al. Mcl- is an anti-apoptotic factor for human hepatocellular carcinoma. Int J Oncol 2006; 28(): Schulze-Bergkamen H, Fleischer B, Schuchmann M,Weber A, Weinmann A, Krammer PH, et al. Suppression of Mcl- via RNA interference sensitizes human hepatocellular carcinoma cells towards apoptosis induction. BMC Cancer 2006; 6: Jolly L A, Taylor V, Wood SA. enhances the polarity and self-renewal of embryonic stem cell-derived neural progenitors. Mol Biol Cell 2009; 20(7): Aravalli RN, Steer CJ, Cressman EN. Molecular mechanisms of hepatocellular carcinoma. Hepatology 2008; 48(6): Forner A, Llovet JM, Bruix J. Hepatocellular carcinoma. Lancet 202; 379(9822): Cardozo T, Pagano M. The SCF ubiquitin ligase: Insights into a molecular machine. Nat Rev Mol Cell Biol 2004; 5(9): Cheng Y, Li G. Role of the ubiquitin ligase Fbw7 in cancer progression. Cancer Metast Rev 202; 3(/2): Hogarty MD. Mcl becomes ubiquitin-ous: new opportunities to antagonize a pro-survival protein. Cell Res 200; 20(4): 39-3.