482 马大昌, 等. mir-199a-3p 在乳腺癌中的表达及其作用诊断和治疗乳腺癌提供了新的研究方向 [2] 微小 RNA(microRNA,miRNA) 是一类真核细胞中由 21~23 个核苷酸组成的非编码 RNA [3] mirna 通过抑癌或促癌作用参与癌细胞的增殖分化和凋亡 [

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卢严
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1 中国癌症杂志 2016 年第 26 卷第 6 期 CHINA ONCOLOGY 2016 Vol.26 No mir-199a-3p 在乳腺癌中的表达及其作用马大昌, 陈诚, 吴多明, 王红磊, 武力兰州大学第一医院乳腺病科, 甘肃兰州 [ 摘要 ] 背景与目的 : 多种微小 RNA(microRNA,miRNA) 在乳腺癌中异常表达, 在乳腺癌的发生发展中起重要作用 mirna 可能是治疗乳腺癌的新靶点该研究旨在探讨 mir-199a-3p 在乳腺癌中的表达水平, 及其对乳腺癌癌细胞增殖和凋亡的影响方法 : 运用实时定量聚合酶链式反应 (quantitative real-time polymerase chain reaction,qrt-pcr) 检测乳腺癌患者癌组织癌旁正常组织人乳腺癌细胞和人乳腺细胞中 mirna-199a- 3p 的表达水平,miR-199a-3p mimic( 或 inhibitor) 转染乳腺癌细胞 MDA-MB-231 过表达 ( 或沉默 )mir-199a-3p 的表达后, 通过 MTT 法检测细胞增殖能力,Hoechst 染色法和 caspase-3 活力测试检测细胞凋亡情况结果 : 相对癌旁正常组织和人正常乳腺细胞,miR-199a-3p 在乳腺癌患者癌组织和人乳腺癌细胞中表达下调在 MDA- MB-231 中转染 mir-199a-3p mimic 过表达 mir-199a-3p 可抑制细胞增殖, 促进其凋亡 ; 在 MDA-MB-231 中转染 mir-199a-3p inhibitor 沉默 mir-199a-3p 可促进细胞增殖, 抑制其凋亡结论 :mir-199a-3p 在乳腺癌中表达下调, 并通过调节乳腺癌细胞增殖和凋亡发挥抑癌作用 [ 关键词 ] 乳腺癌 ;mir-199a-3p;mda-mb-231; 增殖 ; 凋亡 DOI: /j.cnki 中图分类号 :R737.9 文献标志码 :A 文章编号 : (2016) The expression of mir-199a-3p in breast cancer and its effect MA Dachang, CHEN Cheng, WU Duoming, WANG Honglei, WU Li (Department of Breast Diseases, the First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou , Gansu Province, China) Correspondence to: Wu Li lzuwuli2015@sina.com [Abstract] Background and purpose: Multiple micrornas (mirnas) are abnormally expressed in breast cancer and play an important role in the regulation of breast cancer. mirnas may be a new target for the treatment of breast cancer. This study aimed to investigate the expression of mir-199a-3p in breast cancer and the effect of mir- 199a-3p on proliferation and apoptosis of breast cancer. Methods: Real-time PCR was used to test the expression of mir-199a-3p in breast cancer tissues, normal breast tissues, breast cancer cells and normal breast cells. Overexpression (or silencing the expression) of mir-199a-3p was conducted by transfecting MDA-MB-231 with mir-199a-3p mimics (or inhibitors). The proliferation of MDA-MB-231 was detected by MTT method. The apoptosis of MDA-MB-231 was investigated by Hoechst staining and caspase-3 activity assay kit. Results: Compared to corresponding non-tumor breast tissues (or normal breast cell HBL-100), lower levels of mir-199a-3p were expressed in breast cancer tissues or breast cancer cells. Overexpression of mir-199a-3p induced by mir-199a-3p mimic inhibited the proliferation and promoted the apoptosis of MDA-MB-231, while silencing the expression of mir-199a-3p induced by mir-199a-3p inhibitor increased the proliferation and suppressed the apoptosis of MDA-MB-231. Conclusion: The expression of mir- 199a-3p is lower in breast cancer, which shows its tumor suppression effect by regulating the proliferation and apoptosis of breast cancer cells. [Key words] Breast cancer; mir-199a-3p; MDA-MB-231; Proliferation; Apoptosis 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤我国的乳腺癌发病率居女性恶性肿瘤的首位, 占全身其他恶性肿瘤的 7%~10%, 是严重威胁我国女性通信作者 : 武力 lzuwuli2015@sina.com 身体健康的主要疾病随着治疗手段的发展, 乳腺癌的治疗效果有了长足的提高 [1] 近年来, 肿瘤的基因治疗也逐渐成为研究的热点, 探寻与乳腺癌相关的原癌基因和抑癌基因也为

2 482 马大昌, 等. mir-199a-3p 在乳腺癌中的表达及其作用诊断和治疗乳腺癌提供了新的研究方向 [2] 微小 RNA(microRNA,miRNA) 是一类真核细胞中由 21~23 个核苷酸组成的非编码 RNA [3] mirna 通过抑癌或促癌作用参与癌细胞的增殖分化和凋亡 [4] 最近研究发现, 乳腺癌中多种 mirna 表达异常并参与调节乳腺癌功能, 如 mir-21 mir-210 和 mir-200 等 [5] 因此, mirna 可能是治疗乳腺癌的新靶点 mir-199a- 3p 是重要的抑癌基因, 参与调节多种癌症的发生发展, 包括胃癌 [6] 肝癌 [7] 子宫内膜癌 [8] [9] [10] 睾丸癌和骨肉瘤等, 但 mir- 199a-3p 是否也参与调节乳腺癌的发生发展未见报道本研究旨在研究 mir-199a-3p 在乳腺癌发生发展中的作用, 将通过以下两个方面进行研究 :1 乳腺癌患者癌组织与癌旁正常组织 mir-199a-3p 的表达是否有差异 ;2 mir-199a- 3p 是否参与调控乳腺癌细胞的增殖和凋亡已有研究发现, 与 mir-199a-3p 同家族的 mir- 199a-5p 参与调节乳腺癌细胞功能 [11], 并在乳腺癌患者的血浆中循环 mir-199a-3p 表达明显下降 [12], 因此我们推测 mir-199a-3p 可能参与调节乳腺癌的发生发展 1 材料和方法 1.1 材料与主要试剂人乳腺癌细胞株 (MDA-MB-231 MDA- MB-468 MCF-7 和 SK-BR-3) 和正常的人乳腺细胞 HBL-100 均购自美国模式培养物保藏所培养基和胎牛血清购自美国 Hyclone 公司 Trizol 购自上海碧云天生物技术有限公司 RNA 提取试剂盒和反转录试剂购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 mirna 引物购自生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司 mir-199a-3p mimic mir- 199a-3p inhibitor NC mimic NC inhibitor 和 Lipofectamine TM 2000 购自广州锐博生物科技有限公司 MTT Hoechst 和 Caspase-3 活性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司 1.2 方法样本收集收集 2013 年在兰州大学第一医院进行乳腺癌切除手术的 26 例乳腺癌患者, 所有患者均已经过病理学确诊经患者同意, 于术后摘取微量乳腺癌组织及癌旁正常乳腺组织用于本研究所取组织均冻于 -80 用于实时定量聚合酶链式反应 (quantitative real-time polymerase chain reaction,qrt-pcr) 细胞培养 MCF-7 细胞用含 10% 胎牛血清的 RPML1640 培养基培养,MDA-MB-231 MDA-MB-468 和 SK-BR-3 乳腺癌细胞系及正常乳腺细胞 HBL-100 均用含 10% 胎牛血清的高糖细胞培养基培养, 于 37 CO 2 体积分数为 5% 的饱和湿度细胞培养箱中培养细胞转染将细胞接种于 12 孔或 96 孔培养板上, 待细胞汇合密度达到 60%~70% 时, 利用 Lipofectamine TM 2000 运载 mirna mimic 或 mirna inhibitor 转染至细胞内 QRT-PCR 检测其转染效率细胞增殖和凋亡实验细胞转染后, 采用 MTT 法检测和 72 h 时的细胞增殖, 采用 Hoechst 和 Caspase-3 活性检测试剂盒检测 24 h 时的细胞凋亡具体操作参照试剂说明书进行 mirna 的提取逆转和 QRT-PCR Trizol 法提取总 RNA, 取 2 μg 总 RNA 反转录得到 cdna 在 cdna 中加入 PCR 荧光试剂和引物于 ABI-7300 PCR 仪进行扩增和检测 ABI 系统分析得到 mirna 表达量具体操作参照试剂说明书进行 1.3 统计学处理采用 SPSS 18.0 对数据进行分析人组织和细胞数据表示采用 x±s 采用单因素方差分析 (one-way ANOVA) 比较组间差异 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 mir-199a-3p 在乳腺癌患者癌组织中表达下调 QRT-PCR 检测乳腺癌患者癌组织和癌旁正常组织发现, 相对癌旁正常组织, 乳腺癌组织中 mir-199a-3p 表达显著下调 ( 图 1)

3 483 中国癌症杂志 2016年第26卷第6期图1 Fig. 1 mir-199a-3p在乳腺癌患者癌组织中的表达 Expression of mir-199a-3p in cancer tissues of breast cancer patients A: Expression of mir-199a-3p was down-regulated in breast cancer tissues as compared with normal breast tissues. B: Statistical result of figure A; n=26; *P<0.05, as compared with normal breast tissues 2.2 mir-199a-3p在乳腺癌细胞株中表达下调 2.3 mir-199a-3p mimic抑制mda-mb-231 QRT-PCR检测4种人乳腺癌细胞株(MDA- 增殖促进其凋亡 MB-231 MDA-MB-468 MCF-7和SK-BR-3)和转染miR-199a-3p mimic 24 h后 QRT-PCR 人乳腺细胞株HBL-100发现相对人乳腺细胞检测miR-199a-3p表达发现 mir-199a-3p表达显株HBL-100 4种人乳腺癌细胞株中miR-199a-3p 著上调过表达成功(图3A) 转染miR-199a-3p 表达均显著下调(图2) mimic 分别于和72 h运用mtt法检测细胞活力发现过表达miR-199a-3p明显抑制 MDA-MB-231的增殖 48和72 h的差异均有统计学意义(P<0.05 图3B) 转染miR-199a-3p mimic 24 h后 Hoechst染色法检测细胞凋亡情况发现过表达miR-199a3p引起Hoechst阳性细胞数增多即凋亡数增多 (图4A B) Caspase-3活力是细胞凋亡的重要指标与细胞凋亡正相关检测caspase-3活力发图2 Fig. 2 mir-199a-3p在乳腺癌细胞株中的表达 Expression of mir-199a-3p in breast cancer cell lines Expression of mir-199a-3p was down-regulated in 4 breast cancer cell lines as compared with normal breast cell line HBL-100. n=3; *: P<0.05, as compared with HBL-100 图3 Fig. 3 现过表达miR-199a-3p显著增加caspase-3活力 (图4C) mir-199a-3p mimic对mda-mb-231细胞增殖的影响 Effect of mir-199a-3p mimic on the proliferation of MDA-MB-231 A: Transfection with mir-199a-3p mimic significantly up-regulated the expression of mir-199a-3p; B: Transfection with mir-199a-3p mimic inhibited the proliferation of MDA-MB-231. NC: Negative control sequence; n=3; *: P<0.05, as compared with control

4 马大昌等. mir-199a-3p inhibitor促进mda- mir-199a-3p在乳腺癌中的表达及其作用显促进MDA-MB-231的增殖(图5B) 转染miR-199a-3p inhibitor 24 h后 Hoechst MB-231增殖抑制其凋亡转染miR-199a-3p inhibitor 24 h后 QRT- 染色法和caspase-3活力测试检测细胞凋亡发 PCR检测miR-199a-3p表达量发现 mir-199a- 现沉默miR-199a-3p引起Hoechst阳性细胞数减 3p表达显著下调沉默成功(图5A) 转染miR- 少即凋亡数减少(图6A B) caspase-3活力降 199a-3p inhibitor 分别于和72 h运用低(图6C) MTT法检测细胞活力发现沉默miR-199a-3p明图4 Fig. 4 mir-199a-3p mimic对mda-mb-231细胞凋亡的影响 Effect of mir-199a-3p mimic on the apoptosis of MDA-MB-231 A: Transfection with mir-199a-3p mimic increased the Hoechst positive cells; B: Statistical result of figure A; C: Transfection with mir-199a-3p mimic increased the activity of caspase-3. n=3; *: P<0.05, as compared with control 图5 Fig. 5 mirna-199a inhibitor对mda-mb-231细胞增殖的影响 Effect of mir-199a-3p inhibitor on the proliferation of MDA-MB-231 A: Transfection with mir-199a-3p inhibitor significantly down-regulated the expression of mir-199a-3p; B: Transfection with mir-199a-3p inhibitor promoted the proliferation of MDA-MB-231. n=3; *P<0.05, as compared with control

5 485 中国癌症杂志 2016年第26卷第6期图6 Fig. 6 mirna-199a inhibitor对mda-mb-231细胞凋亡的影响 Effect of mir-199a-3p inhibitor on the apoptosis of MDA-MB-231 A: Transfection with mir-199a-3p inhibitor decreased the Hoechst positive cells; B: Statistical result of figure A; C: Transfection with mir-199a3p inhibitor decreased the activity of caspase-3. n=3; *: P<0.05, as compared with control 腺癌患者癌组织miR-199a-3p表达下调乳腺 3 讨论 mirna调控人类30%的基因表达与人类疾病密切相关 mirna通过与靶基因mrna 的3 -非翻译区(3 -UTR)互补配对调节靶基因 mrna降解和蛋白合成从而调控转录后靶基因的表达水平最终影响细胞增殖分化和凋亡等功能研究发现癌组织的miRNA表达异常并参与调控肿瘤的发生发展在肿瘤组织中高表达表现出癌基因的特性促进癌细胞增殖转化和迁移的miRNA称为促癌 mirna 在肿瘤组织中低表达负性调控癌基因的表达的miRNA称为抑癌miRNA 4 mir-199a-3p在胃癌肝癌子宫内膜癌睾丸癌和骨肉瘤的癌组织中表达下调并通过抑制相应癌细胞增殖促进其凋亡发挥抑癌作用 6-10 mirna-199a-5p和mir-199a-3p在乳腺癌患者血浆中表达下调 12 mirna-199a- 癌细胞miR-199a-3p表达水平较正常乳腺细胞也下调其中MDA-MB-231下调最明显故用于下一步功能实验本研究利用化学合成的miR199a-3p mimic和mir-199a-3p inhibitor转染mdamb-231细胞成功过表达和沉默miR-199a-3p MDA-MB-231中过表达miR-199a-3p促进其凋亡抑制增殖而沉默miR-199a-3p促进其增殖综上所述本研究首次发现miR-199a-3p在乳腺癌组织和多种乳腺癌细胞中表达下调进一步研究发现 mir-199a-3p抑制乳腺癌细胞的增殖促进其凋亡 mir-199a-3p可能是治疗乳腺癌的重要靶点 mir-199a-3p调控乳腺癌功能的靶标蛋白未知这将是我们下一步工作的重点参考 1 GREENE L R, WILKINSON D. The role of general nuclear 能本研究显示相对癌旁正常组织乳献 medicine in breast cancer J. J Med Radiat Sci, 2015, 5p通过调节辐射引起的自噬影响乳腺癌细胞功 11 文 62(1): GAGAN J, VAN ALLEN E M. Next-generation sequencing to

6 486 马大昌, 等. mir-199a-3p 在乳腺癌中的表达及其作用 guide cancer therapy [J]. Genome Med, 2015, 7(1): 80. [3] HUDSON W H, ORTLUND E A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2014, 15(11): [4] MONROIG PDEL C, CHEN L, ZHANG S, et al. Small molecule compounds targeting mirnas for cancer therapy [J]. Adv Drug Deliv Rev, 2015, 81: [5] BERTOLI G, CAVA C, CASTIGLIONI I. MicroRNAs: new biomarkers for diagnosis, prognosis, therapy prediction and therapeutic tools for breast cancer [J]. Theranostics, 2015, 5(10): [6] PENG W, CHEN Z Y, WANG L, et al. MicroRNA-199a- 3p is downregulated in gastric carcinomas and modulates cell proliferation [J]. Genet Mol Res, 2013, 12(3): [7] FORNARI F, MILAZZO M, CHIECO P, et al. MiR-199a- 3p regulates mtor and c-met to influence the doxorubicin sensitivity of human hepatocarcinoma cells [J]. Cancer Res, 2010, 70(12): [8] WU D, HUANG H J, HE C N, et al. MicroRNA-199a-3p regulates endometrial cancer cell proliferation by targeting mammalian target of rapamycin (mtor) [J]. Int J Gynecol Cancer, 2013, 23(7): [9] CHEN B F, GU S, SUEN Y K, et al. MicroRNA-199a-3p, DNMT3A, and aberrant DNA methylation in testicular cancer [J]. Epigenetics, 2014, 9(1): [10] TIAN Y, ZHANG Y Z, CHEN W. MicroRNA-199a-3p and microrna-34a regulate apoptosis in human osteosarcoma cells [J]. Biosci Rep, 2014, 34(4): e [11] YI H, LIANG B, JIA J, LIANG N, et al. Differential roles of mir-199a-5p in radiation-induced autophagy in breast cancer cells [J]. FEBS Lett, 2013, 587(5): [12] SHIN V Y, SIU J M, CHEUK I, et al. Circulating cell-free mirnas as biomarker for triple-negative breast cancer [J]. Br J Cancer, 2015, 112(11): ( 收稿日期 : 修回日期 : ) 肿瘤影像学杂志 2016 年征订启事肿瘤影像学杂志自 1992 年创刊以来深受医学界赞颂,1998 年经原国家科委中央新闻出版总署批准为国内外公开正式发行的期刊, 刊号 :ISSN X,CN /R 杂志由优质铜版纸印制, 大 16 开,80 页, 为季刊被中国学术期刊综合评价数据库中国核心期刊 ( 遴选 ) 数据库中国期刊全文数据库等收录主要报道医学影像领域中科研成果临床应用综述病例报告讲座及与理工结合的有关论文等肿瘤影像学坚持学术性与科学性, 信息量大, 具有临床实用价值是医院图书馆影像科室及高等医药院校收存和使用的学术刊物, 是临床医学影像医务人员晋升中高级职称的重要论文发表园地欢迎各医学院校医学图书馆影像科室及个人向当地邮局订阅本刊季末出版, 邮发代号 4-653, 定价每期 15 元, 每年共 60 元整单位全称 : 肿瘤影像学杂志编辑部通讯地址 : 上海市东安路 270 号复旦大学附属肿瘤医院邮编 : 电话 :(021) (021) 传真 :(021) E - m a i l : imaging109@163.com 肿瘤影像学杂志编辑部

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环球中医药 2016 年 5 月第 9 卷第 5 期摇 Global Traditional Chinese Medicine, May 2016,Vol 郾 9, No 郾 5 摇 557 两种电针对脊髓损伤 14 天后大鼠运动功能神经元及 MEK2 p 鄄 ERK1 表达的影响论著宋良玉摇吕威摇景泉凯摇莫雨