中华细胞与干细胞杂志 ( 电子版 ) 2015 年 8 月第 5 卷第 3 期 Chin J Cell Stem Cell (Electronic Edition), Aug 2015,Vol. 5, No 微小 RNA let-7a 对 CD133 + 肝癌干细胞增殖和转移的影响 论

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1 中华细胞与干细胞杂志 ( 电子版 ) 2015 年 8 月第 5 卷第 3 期 Chin J Cell Stem Cell (Electronic Edition), Aug 2015,Vol. 5, No 微小 RNA let-7a 对 CD133 + 肝癌干细胞增殖和转移的影响 论著 采用 let-7a 模拟物对 CD133 + Huh7 肝癌干细胞进行基因治疗, 观察其 对 let-7a 含量和对增殖转移能力的影响, 并对其分子生物学机制进行初步探讨 流 式分选获得 CD133 + Huh7 肝癌干细胞, 分为 let-7a 组 阴性对照 (NC-miRNA) 组 空白对 照组 (control) 组 采用 RT-PCR 法比较各组细胞 let-7a 的含量, 平板克隆形成实验检测 3 组细胞的增殖能力, 采用 Transwell 法检测 3 组细胞转移能力, 荧光素酶报告基因检测 3 组细胞 Wnt/β-catenin 信号通路的活性 实验数据 3 组比较采用单因素方差分析, 两两比 较采用 t 检验 流式分选前后 Huh7 细胞 CDl33 阳性率分别为 (1.03 ± 0.16) %和 (95.73 ± 1.03) %, 差异具有统计学意义 (t = 22.90,P < 0.05) let-7a 组细胞中 let-7a 的表 达量为对照组的 (2 212 ± 29) 倍, 差异具有统计学意义 (t = 29.50,P < 0.05) let-7a 组细胞 有效细胞克隆形成数量为 (4.6 ± 1.8) 个 / 孔, 明显低于对照组的 (45.1 ± 7.0) 个 / 孔, 差异 具有统计学意义 (t = ,P < 0.05) let-7a 组 transwell 过膜细胞数量 ± 8.69 明显 少于对照组的 ± 10.24, 差异具有统计学意义 (t = ,P < 0.05) let-7a 组 Wnt/ β-catenin 信号通路的转录活性较对照组相比明显降低, 差异具有统计学意义 (P < 0.05) microrna let-7a 模拟物可以通过下调 CD133 + Huh7 肝癌干细胞内 Wnt/β-catenin 信号 通路的转录活性实现对肝癌干细胞增殖和转移功能的靶向抑制 微 RNA; 肝肿瘤 ; 干细胞 ; 细胞增殖 ; 细胞转移 Effect of microrna let-7a on the proliferation and metastasis of CD133 + liver cancer stem cells Chen Bin, Shen Shunli, Peng Baogang. Department of Hepatic Surgery,the First Affilited Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou , China. Corresponding author: Peng Baogang, pengbaogang@medmail.com.cn Abstract Objective To evaluate the proliferation and metastasis of CD133+Huh7 liver cancer stem cells transfected with let-7a mimcs and the underlying molecular mechanisms. Methods CD133 + Huh7 hepatoma stem cells were isolated by FACS and divided into let-7a group, negative control group(nc-mirna)and blank control group(control)group. RT-PCR was used to compare let-7a levels in each group. The proliferation ability of cells was detected by plate clone formation assay. Transwell method was used to detect metastasis ability of the cells. Luciferase reporter gene assay was used to evaluate Wnt/beta -catenin signaling pathway. The comparison of three groups was conducted using one way analysis and pairwise comparison using LSD-t test. Results The positive rates of CDl33 cells before and after flow sorting were (1.03 ± 0.16) % and(95.73 ± 1.03) % respectively(t = 22.90, P < 0.05). The expression of let-7a in let-7a group was significantly lower than that in the control group(t = 29.50, P < 0.05).The number of cells in let-7a group(4.6 ± 1.8)was significantly lower than that in the DOI: /cma.j.issn 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ) 作者单位 : 广州, 中山大学附属第一医院肝脏外科通讯作者 : 彭宝岗, pengbaogang@medmail.com.cn

2 192 中华细胞与干细胞杂志 ( 电子版 ) 2015 年 8 月第 5 卷第 3 期 Chin J Cell Stem Cell (Electronic Edition), Aug 2015,Vol. 5, No. 3 control group(45.1 ± 7.0,t = , P < 0.05). There was significantly fewer cells in the upper chamber of Transwell cells in the let-7a group(37.41 ± 8.69)than in the control group ( ± 10.24,t = , P < 0.05). The transcriptional activity of Wnt/β-catenin in the let- 7a group was significantly lower than that in the control group(p < 0.05). Conclusion Let- 7a microrna mimcs can inhibit proliferation and metastasis of CD133+Huh7 hepatocellular carcinoma stem cells by down regulating the transcriptional activity of the β-catenin signaling pathway. K e y w o r d s M i c r o R N A ; l i v e r n e o p l a s m s ; s t e m c e l l s ; c e l l proliferation; cell metastasis 肝癌是消化系统最常见恶性肿瘤之一, 严重 威胁人类健康, 目前尚无对肝癌确切有效的基因 治疗方法 [1] 目前认为, 肝癌等恶性肿瘤组织中 存在的一小群具有干细胞特性的细胞亚群, 是使 肿瘤实现无限增殖 转移的重要细胞 [2] 直接对 肿瘤干细胞进行基因治疗, 有望实现良好的抗肿 瘤效果 [3-4] let-7a 是一种直接或间接参与哺乳 动物细胞增殖, 并与肺癌在内的多种肿瘤的发 生 发展密切相关的 microrna [5-6] 近年的研 究表明,let-7a 在多种肿瘤中表达水平异常, 调 控 let-7a 的表达水平可以产生对恶性肿瘤的抑 制效果 [7-8] 但目前尚缺乏 let-7a 与肝癌干细胞 发生发展之间关系的相关研究 [9] 本研究采用 let-7a 模拟物对 CD133 + Huh7 肝癌干细胞进行基 因治疗, 观察其对 let-7a 含量和对增殖转移能力 的影响, 并对其分子生物学机制进行初步探讨 一 材料 1. 细胞系 : 肝癌细胞株 Huh7 购自美国典型 微生物菌种保藏中心, 由中山大学附属第一医院 普通外科实验室保存 2. 主要试剂 :let-7a 模拟物 let-7a mimic 及 其阴性对照 (negative control,nc)-mirna 质粒 由广州爱科生物技术有限公司参考文献报道的 方法合成 [5] 细胞培养基 胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS) PBS 液 ( 美国 HyClone 公司 ) 逆转 录 (RT) 试剂盒及荧光定量 RT-PCR 检测试剂盒 ( 日本 TaKaRa 公司 ) RT-PCR 引物采用 Primer 3 软件设计由 Invitrogen 公司合成 荧光素酶报告 基因检测试剂盒 Top-luc-luciferase TM Report( 广 州爱科生物技术有限公司 ) 二 方法 1.CDl33 + Huh7 细胞的分选 培养 转染及 分组 : 复苏培养 Huh7 肝癌细胞株, 用含 10 %胎 牛血清的 DMEM 培养基培养 取对数生长期 Huh7 细胞, 胰酶消化 Buffer 清洗后重悬细胞成 l 10 7 /ml 加入 CDl33-FITC 荧光抗体避光孵 育 0.5 h 后, 送流式分选后进行培养 于分选前 后流式细胞术检测 CDl33 阳性细胞率 细胞融 合度达 60 %时, 采用脂质体 Lipofectamine 2000 和 let-7a mimic NC-miRNA, 按照试剂说明书进 行转染, 设立 let-7a 组和 NC-miR 组, 同时设立 CDl33 + Huh7 细胞空白对照组 2. 荧光定量 PCR(RT-PCR) 技术检测 3 组 细胞中 let-7a 的表达 : 采用 Trizol 试剂提取各组细 胞总 RNA, 逆转录合成 cdna 以 RNU6B 作为 内参照, 进行 RT-PCR 反应 PCR 引物序列 : 上游 引物 5'-GGACAGGACGCAGACGAGG-3', 下游 引物 5'-CCTCCGTGGTCACAGTCA-3' RNU6B 上游引物 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3', 下游 引物 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3' PCR 反应的参数设定为 91,27 s;91,6 s;55, 36 s; 循环 82 次后检测 采用 2 -ΔΔCt 分析法进行 RT-PCR 结果计算 每组实验重复 3 次 3. 平板克隆形成实验检测 CDl33 + Huh7 细胞 的增殖能力 : 转染 48 h 后, 分别取 500 个各组对 数生长期 CDl33 + Huh7 细胞接种于 6 孔板继续培 养 14 d 后, 多聚甲醛固定细胞, 结晶紫染色, 光镜 下记录每孔形成的有效细胞克隆数 设定细胞数 大于 50 个的克隆为有效细胞克隆 每组实验重 复 3 次 4.Transwell 法检测 CDl33 + Huh7 细胞的转 移能力 : 将分组转染培养 48 h 后的各组 CDl33 +

3 中华细胞与干细胞杂志 ( 电子版 ) 2015 年 8 月第 5 卷第 3 期 Chin J Cell Stem Cell (Electronic Edition), Aug 2015,Vol. 5, No Huh7 细胞重悬于无血清培养基中, 接种入 Transwell 小室上室 在 Transwell 小室下室中加 入含 15 %胎牛血清的完全培养基 常规培养条 件下培养 48 h, 取出小室 擦去上室中未穿过膜 的细胞, 甲醛固定,Giesma 染色后与光镜下观察 并计数已穿过上室膜的已发生转移的细胞数量 每组实验重复 3 次 5. 荧光素酶报告基因实验检测 CDl33 + Huh7 细胞 Wnt/β-catenin 信号通路活性 : 各组细胞严 格按照试剂盒说明书, 采用 Top-luc-luciferaseTM Report 试剂盒处理后, 于酶标仪中测定荧光强度 (A) 值代表 Wnt/β-catenin 信号通路荧光素酶活 性 每组实验重复 3 次 三 统计学分析方法 应用 SPSS13.0 软件对实验数据进行分析 CD133 阳性率 细胞 let-7a 含量 有效细胞克隆数 量 过膜细胞数量 信号通路 A 值数据以 x ± s 表 示,3 组比较采用单因素方差分析, 两两比较采用 t 检验 以 P < 0.05 为差异具有统计学意义 的比较 一 流式分选 Huh7 细胞前后 CDl33 阳性率 如图 1 所示, 采用流式细胞术分选 CD133 阳性细胞前后进行检测, 发现分选前后 Huh7 细胞 CD133 阳性率分别为 (1.03 ± 0.16) % 和 (95.73 ± 1.03) %, 差异具有统计学意义 (t = 22.90,P < 0.05) 显示流式分选肝癌干细胞 成功 二 CD133 + Huh7 细胞 let-7a 含量的比较 RT-PCR 检测结果显示,let-7a 组细胞中 let- 7a 的表达量为对照组的 (2 212 ± 29) 倍, 差异具 有统计学意义 (t = 29.50,P < 0.05) 而 NC-miR 组 let-7a 表达水平与对照组比较差异无统计学意 义 (t = 1.06,P > 0.05, 图 2) 三 CD133 + Huh7 细胞增殖能力的比较 RT-PCR 检测 let-7a mimic 对 CD133+Huh7 细胞 let- 7a 含量的影响 let-7a 组细胞每孔的有效细胞克隆形成数量为 (4.6 ± 1.8) 个 / 孔, 明显低于对照组的 (45.1 ± 7.0) 个 / 孔 (t = ,P < 0.05), 而 NC-miR 组的平板 克隆形成数量 (48.4 ± 8.3) 个 / 孔与对照组比较 差异无统计学意义 (t = 1.18,P > 0.05, 图 3,4) 四 CD133 + Huh7 细胞转移能力的比较 : Transwell 实验结果显示,let-7a 组 CD133 + Huh7 细胞转移能力明显受到抑制, 表现为 过膜细胞数量 ± 8.69 明显少于对照 组的 ± 10.24, 差异具有统计学意义 (t = ,P < 0.05) NC-miR 组的过膜细胞 数量 ± 与对照组差异无统计学意义 (t = 0.77,P > 0.05, 图 5,6) 流式细胞术分选前后 Huh7 细胞 CD133 表达率检测

4 194 中华细胞与干细胞杂志 ( 电子版 ) 2015 年 8 月第 5 卷第 3 期 Chin J Cell Stem Cell (Electronic Edition), Aug 2015,Vol. 5, No. 3 平板克隆形成实验检测 let-7a mimic 对 CD133 + Huh7 细胞增殖能力的影响 五 CD133 + Huh7 细胞 Wnt/β-catenin 信号通 路活性的比较 荧光素酶报告基因实验结果显示,let-7a 组 Wnt/β-catenin 信号通路的 A 值较低, 说明其转录 图 5 Transwell 实验检测 let-7a mimic 对 CD133 + Huh7 细胞转移能力的影响 活性明显降低 (P < 0.05) NC-miRNA 与对照组 Wnt/β-catenin 信号通路的 A 值差异无统计学意 义 (P > 0.05, 图 7) 注 :a 图为 let-7a 组细胞每孔的有效细胞克隆形成数量较少 ;b 图 NC-miR 组细胞每孔的有效细胞克隆形成数量较多 ;c 图为对照组细胞每孔的有效细胞克隆形成数量较多 光学显微镜下观察 CD133 + Huh7 细胞克隆形成能力 ( 结晶紫染色 4) 注 :a 图为 let-7a 组 CD133+Huh7 细胞过膜细胞数量较少 ;b 图为 NC-miR 组 CD133+Huh7 细胞过膜细胞数量较多 ;c 图为 control 组 CD133+Huh7 细胞过膜细胞数量较多 光学显微镜下观察 let-7a 组 CD133 + Huh7 细胞形态 (Giesma 染色 100)

5 中华细胞与干细胞杂志 ( 电子版 ) 2015 年 8 月第 5 卷第 3 期 Chin J Cell Stem Cell (Electronic Edition), Aug 2015,Vol. 5, No let-7a 对 Wnt/β-catenin 信号通路活性的影响 与一般肝癌细胞相比, 肝癌干细胞具有更强 的增殖 转移潜能, 是肝癌发生 发展 增殖和转 移的源动力 [10] 而目前临床上肝癌的治疗方式 以手术切除等手段为主, 疗效不能令人满意 通 过基因治疗手段, 靶向化影响肝癌干细胞特定基 因的表达, 抑制肝癌干细胞的增殖和转移可能实 现对肝癌的有效抑制 因此, 开发针对肝癌干细 胞的基因治疗手段可能是一种较好的肝癌治疗 策略, 可能有效提高肝癌患者的总体生存率 [11] CD133 蛋白是一种广泛存在于包括肝癌 肺癌 和前列腺癌干细胞表面的特异性表面分子标志, 在维持肿瘤干细胞功能中具有重要作用 [12] 所 以, 本实验采用以 CD133 为靶点的流式分选技 术从肝癌 Huh7 细胞中成功分选出肝癌干细胞, 分选后获得的肝癌干细胞 CD133 阳性率达到 (95.73 ± 1.03) % microrna 属于内源性的小分子单链非编码 RNA, 参与调控人类基因组中 1/3 基因的表达 microrna 参与几乎所有肿瘤的发生发展, 在肿 瘤的生物学表现中发挥 癌基因 或 抑癌基因 的功能, 自发现之后就成为介导基因沉默的常用 分子生物学工具 [13] let-7 家族是目前受到广泛 关注的 microrna 家族之一 [14-15] 成熟的 let-7 可以通过结合到结合靶蛋白 mrna 的非翻译区, 使目标 mrna 发生降解, 进而抑制其翻译过程 let-7 家族在不同的肿瘤中发挥抑制肿瘤的作用, 上调肿瘤细胞的 let-7a 表达可使肿瘤细胞的细胞 周期停滞, 进而抑制细胞增殖和转移, 并促进凋 亡 let-7a 有望成为对肝癌干细胞进行基因治疗 的良好靶点 [9] 本研究通过导入外源性 let-7a 模 拟物, 提高肝癌干细胞内的 let-7a 水平, 实现对肝 癌 CD133 + 肝癌干细胞增殖和转移的抑制, 并初 步明确了其起效机制 本研究选取肝癌 CD133 + Huh7 干细胞, 分别 采用 let-7a 模拟物和其阴性对照 NC-miRNA 进 行转染 发现 let-7a 模拟物能有效提高细胞内 let-7a 含量 本研究进一步通过平板克隆形成 实验和 Transwell 实验考察提高 let-7a 表达水平 对 CD133 + Huh7 肝癌干细胞的增殖能力和转移 能力的影响 发现 let-7a 组肝癌干细胞的克隆 形成能力发生明显的抑制 同时,Transwell 实 验表明 let-7a 组细胞转移能力也发生了明显的 抑制, 表现为穿膜数量减少, 证明了 let-7a 含量与 肝癌干细胞转移能力之间存在负相关 进一步 对 let-7a 调节肝癌干细胞发生发展所依赖的细胞 信号通路进行考察, 发现 let-7a 的细胞内含量与 Wnt/β-catenin 信号通路的活性呈负相关 在肝癌 等恶性肿瘤中,Wnt/ β-catenin 信号通路可以通过 调节一系列功能蛋白的表达, 实现对增殖 转移活 动的调控 所以 let-7a 对肝癌干细胞中增殖和转 移功能的抑制可能是通过降低 Wnt/ β-catenin 信 号通路的转录活性实现的 [2] 这是 let-7a 影响 CD133 + Huh7 肝癌干细胞增殖 转移的重要分子 机制 [16] 综上所述,microRNA let-7a 模拟物可以通 过下调肝癌 CD133 + Huh7 肝癌干细胞内 Wnt/ β-catenin 信号通路的转录活性实现对肝癌干细胞 增殖和转移功能的靶向抑制 参考文献 1 汤钊猷. 提高肝癌疗效的我见 [J]. 中华肝胆外科杂志, 2010, 16(8): Cai WY, Wei TZ, Luo QC, et al. The Wnt-beta-catenin pathway represses let-7 microrna expression through transactivation of Lin28 to augment breast cancer stem cell expansion[j]. J Cell Sci, 2013, 126(Pt 13): 王英, 李文涛. 肝癌干细胞与肝癌的研究进展 [J]. 中国癌症杂志, 2011, 21(9): 吕阳, 许戈良. 肝癌干细胞研究进展 [J]. 安徽医科大学学报, 2012, 47(8): 瞿岱彪, 邵斌, 袁志峰, 等. Let-7a 靶向抑制 Ewing

6 196 中华细胞与干细胞杂志 ( 电子版 ) 2015 年 8 月第 5 卷第 3 期 Chin J Cell Stem Cell (Electronic Edition), Aug 2015,Vol. 5, No. 3 肉瘤中 CDK6 的表达 [J]. 基础医学与临床, 2014, 34(11): 何晓燕, 陈俊霞, 欧阳溪, 等. Let-7a 表达质粒的构建及其对肺癌 A549 细胞 k-ras 蛋白表达的抑制作用 [J]. 南方医科大学学报, 2010, 30(11): 刘乃国, 张卫群, 胡凤爱, 等. 口腔鳞癌中 let-7a mir-21 和 mir-27a 的表达及其作用 [J]. 解剖学报, 2015, 46(2): 沈洁, 冯常炜, 郝炳章, 等. 血清中 mir-21 和 let-7a 在胃癌无创性诊断及手术效果评定中的作用 [J]. 郑州大学学报 ( 医学版 ), 2012, 47(5): Di Fazio P, Montalbano R, Neureiter D, et al. Downregulation of HMGA2 by the pan-deacetylase inhibitor panobinostat is dependent on hsa-let-7b expression in liver cancer cell lines[j]. Exp Cell Res, 2012, 318(15): 张珍妮, 匡志鹏, 吴继宁. 肝癌干细胞标志物及其信号通路研究进展 [J]. 广东医学, 2012, 33(11): 孙力超, 赵璇, 孙立新, 等. 肝癌干细胞抗体靶向治疗的实验 [J]. 肿瘤防治研究, 2011, 38(6): 孙建聪, 牛道立, 夏建川. 肝癌干细胞的分离鉴定及耐 药性研究 [J]. 实用医学杂志, 2014, 30(19): 焦良波, 陈涛, 胡卫. 肝癌干细胞中 micrornas 的功能 研究进展 [J]. 广东医学, 2014, 35(18): 姚冬明, 林江, 吴得红, 等. let-7a-3 基因表达与急 性髓系白血病的相关性 [J]. 实用医学杂志, 2014, 30(14): 陈德玉, 金丽艳, 朱龙萍, 等. let-7a 和 IL-6 在食管鳞状 细胞癌组织中的表达及两者的相关性 [J]. 细胞与分子免 疫学杂志, 2013, 29(11): Egea V, Zahler S, Rieth N, et al. Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) regulates mesenchymal stem cells through let-7f microrna and Wnt/beta-catenin signaling[j]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(6): E309-E316. ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 李少婷 )

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