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1 第 27 卷第 3 期中国现代医学杂志 Vol. 27 No 年 12 月 China Journal of Modern Medicine Dec. 217 DOI: /j.issn 文章编号 : (217) 临床研究论著胃饥饿素对结肠癌细胞增殖和侵袭的影响及机制探讨岳朝驰 1, 杨向东 2, 李俊 1, 陈小朝 2, 屈景辉 2 (1. 西南医科大学附属医院中医科, 四川泸州 646;2. 成都肛肠专科医院结直肠外科, 四川成都 6115) 摘要 : 目的探讨胃饥饿素 () 对结肠癌细胞增殖侵袭的影响及作用机制方法收集 9 例行手术切除的结肠癌 (CRC) 组织及癌旁组织, 免疫组织化学染色检测组织表达, 分析表达与结肠癌患者临床资料生存预后的关系按照转染类型将细胞分为 3 组 : 空白对照组 (WT) 阴性对照组 (NC) 和 sh- 转染组采用短发夹 RNA(shRNA) 技术抑制结肠癌 HT29 SW48 细胞表达,CCK-8 法检测细胞增殖能力, 流式细胞术检测细胞周期及早期凋亡的情况, 划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell 实验检测细胞侵袭能力,Western blot 检测磷脂酰肌醇 3- 激酶 (PI3K) 蛋白激酶 B(Akt) 磷酸化蛋白激酶 B(p-Akt) 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mtor) 磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR) 表达水平结果结肠癌组织高表达率为 64.4%(58/9), 癌旁组织高表达率为 27.8%(25/9), 两者差异有统计学意义 (χ 2 =24.347, =. 肿瘤直径 5 cm 组高表达率高于肿瘤直径 <5 cm 组,Ⅲ Ⅳ 期组高表达率高于 Ⅰ Ⅱ 组, 淋巴结转移组高表达率高于无淋巴结转移组, 组间比较差异有统计学意义 ( <.5); 表达与性别年龄及肿瘤分级无关 ( >.5) 生存曲线分析显示, 高表达组总生存期和无病生存率均低于低表达组 ( <.5) 在结肠癌 HT29 和 SW48 细胞中,sh- 组细胞增殖能力低于 NC 组和 WT 组, 处于 S 期比例早期凋亡比例高于 NC 组和 WT 组 ( <.5) 处于 G /G 1 期比例低于 NC 组和 WT 组, 差异有统计学意义 ( <.5) sh- 组细胞迁移距离侵袭细胞数少于 NC 组和 WT 组 ( <.5) Western blot 检测结果显示, 在 HT29 SW48 细胞中,sh- 组 PI3K p-akt 及 p-mtor 蛋白相对表达量低于 NC 组和 WT 组 ( <.5),NC 组 WT 组间 PI3K Akt p-akt mtor 及 p-mtor 蛋白相对表达量比较差异无统计学意义 ( >.5) 结论结肠癌组织表达上调, 并与结肠癌患者生存预后有关干扰表达能够抑制结肠癌细胞增殖侵袭, 其作用机制可能与抑制 PI3K-Akt-mTOR 信号通路有关关键词 : 胃饥饿素 ; 结肠癌 ; 增殖 ; 细胞周期 ; 侵袭 ; 信号通路中图分类号 :R 文献标识码 :A Regulation of in proliferation and invasion of colon carcinoma Chao-chi Yue 1, Xiang-dong Yang 2,Jun Li 1, Xiao-zhao Chen 2, Jun-hui Qu 2 (1.Department of Traditional Chinese Medicine, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan 646, China; 2.Department of Colorectal Surgery, the Anorectal Specialist Hospital of Chengdu, Chengdu, Sichuan 6115, China) Abstract: Objective To investigate the effect of on cellular proliferation and invasion of colon carcinoma and potential mechanisms. Methods A total of 9 patients diagnosed with colon carcinoma were included in this study, and cancer as well as paracancerous normal tissue was collected. Expression of was measured by Immunohistochemical staining assay; Co -relationship analysis between ghrelin expression and clinical manifestation of patients including survival rate was performed. Expression of 收稿日期 :

2 第 3 期岳朝驰, 等 : 胃饥饿素对结肠癌细胞增殖和侵袭的影响及机制探讨 in colon carcinoma cell line HT29 and SW48 was genetically inhibited by short hairpin RNA (shrna). Cellular proliferation, cell cycle as well as apoptosis, migration, and cell invasion were determined by CCK-8 assay, Flow cytometry, Wound heal assay, and Transwell assay, respectively. Expression levels of PI3K, Akt, p-akt, mtor, p-mtor protein were measured by Western blot. Results Expression of in cancer tissue, group with tumor diameter 逸 5cm, and group with tumor under 芋耀郁 phase was upregulated when compared with that in paracancerous tissue, group with tumor diameter <5cm group, group with tumor under metastasis-free phase, respectively ( <.5). No correlation between expression and gender, age and tumor grade respectively was observed ( >.5). Overall survival and disease-free survival in group with highly expressed was significantly lower than that in group with lowly expressed ( <.5). Proliferation, migration and invasion capacity of HT29 and SW48 cells decreased while ratio of cells in S phase and early apoptosis increased significantly in sh- group when compared with those in NC group and WT group ( <.5). In HT29 and SW48 cells expression levels of PI3K, p-akt, p-mtor protein were dramatically down-regulated in sh- group when compared with those in NC group and WT group ( <.5). No statistical difference in the expression of PI3K, Akt, p-akt, mtor, p-mtor protein in NC group and WT group was observed ( >.5). Conclusions The expression of is up-regulated in colon carcinoma tissue, which is closely associated with disease prognosis. Beneficial effect of is potentially mediated through inhibition of PI3K-Akt-mTOR signaling pathway. Keywords: 结肠癌 (colorectal cancer,crc) 是世界范围内常见的恶性肿瘤, 居癌症相关死亡的第 4 位 [1] 尽管结肠镜等腔镜技术的发展和普及有利于结肠癌早期发现, 然而据世界卫生组织调查显示 [2], 全球每年结肠癌发病人口依然 >1 万, 其中,6% 的 CRC 患者确诊时已是中晚期即使给予手术放化疗等, 结肠癌患者远期生存依然不容乐观因此了解结肠癌的发病机制具有重要的临床意义胃饥饿素 () [3-4] 是由胃合成和分泌的一种生长激素, 在调控人体食欲食物摄取及机体能量平衡方面发挥重要作用近年来有研究报道 [5-6], 胃饥饿素对不同细胞的增殖和迁移有不同的影响, 如胃饥饿素能够促进胰腺癌细胞的增殖, 但对肺癌细胞则有抑制作用也有报道称 [7], 饥饿素能促进肠道恶性肿瘤的发生和进展, 结肠癌患者血清胃饥饿素水平高于正常人群, 并且胃饥饿素水平与患者预后密切相关但是关于胃饥饿素与结肠癌发病的关系及作用机制尚未见报道鉴于此, 本研究分别检测结肠癌组织和细胞胃饥饿素表达水平, 并探讨不同胃饥饿素表达水平对结肠癌细胞增殖侵袭的影响及作用机制, 旨在为结肠癌的预防治疗和诊断提供潜在的作用靶点 1 资料与方法 ; colon carcinoma; proliferation; cell cycle; invasion; signaling pathway 理学确诊排除标准 : 合并其他恶性肿瘤严重自身免疫性疾病及不宜或拒绝手术者所有患者术中切除结肠癌组织及配对的癌旁组织 ( 距癌组织切缘 > 5cm), 组织样本取出后分成两部分, 一部分立即置于液氮中保存, 另外一部分用 1% 甲醛固定用于免疫组织化学 ( 免疫组化 ) 染色术后对患者进行电话随访或门诊复查, 定义无病生存期 (disease-free survival,dfs): 从术后第 2 天开始至疾病复发远处转移或因结肠癌死亡的时间 ; 总生存期 (overall survival,os): 从术后第 2 天开始至因任何原因引起死亡的时间本研究随访截止时间 216 年 12 月 31 日本研究样本的采集患者的治疗均得到医院伦理委员会的批准 1.2 细胞来源人结肠上皮细胞 HIEC 人结肠癌细胞 HT29 及 SW48 均购自美国菌种保藏中心 ( 美国弗吉尼亚州 ), 所有细胞均接种于 DMEM 培养基 ( 美国 Thermo Fisher Scientific 公司 ) 培养基含 1% 胎牛血清 1u/ml 青霉素及 1u/ml 链霉素, 在培养箱中 37 5% 二氧化碳 CO 2 培养每隔 2 天更换 1 次培养基, 细胞融合达 8%~9% 时传代, 选择传 >3 代细胞用于后续实验 1.1 样本收集选取 21 年 4 月 -211 年 4 月本院收治的实验试剂 pgpu6/gfp/neo-sh- 表达载体 ( 购自上海例结肠癌患者纳入标准 :1 入组前未接受任何抗癌治疗 ;2 入院后拟行手术治疗 ;3 术前签署知情同意书, 并自愿捐献组织样本供本研究使用 ;4 术后经病吉玛制药技术有限公司 ), 短发夹 RNA(shRNA) 序列, 正向引物 :5'-GUAAUGAGGAGGGCUAUUA-3', 反向引物 :5'-CGUAUGCGCGUACUCUAAUTT-3' 27

3 中国现代医学杂志第 27 卷 Lipofectamine 2 TM 购自 ( 美国 Invitrogen 公司 ), Trizol 试剂 RIPA 裂解液 ( 购自广州碧云天生物技术研究所 ), 逆转录试剂盒蛋白浓度检测试剂盒 ( 购自美国 Fermentas 公司 ),CCK-8 增殖活性测定试剂盒 ( 购自长沙贝博生物科技有限公司 ), 细胞周期检测试剂盒 ( 购自北京雷根生物技术有限公司 ),Transwell 小室 Matrigel 人工基底膜 ( 购自美国 Sigma 公司 ) 抗 (1 1, 武汉博士德生物公司 ) 抗磷脂酰肌醇 3- 激酶 (phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,pi3k)( 1 5, 上海生工生物工程有限公司 ) 抗哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin,mtor)( 1 5, 海门碧云天生物技术研究所 ) 抗磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (phosphorylation mtor,p-mtor)(phosphorylation Akt, p-akt)( 1 2, 海门碧云天生物技术研究所 ) 抗蛋白激酶 B(protein kinase B,Akt)( 1 1, 上海生工生物工程有限公司 ) 抗磷酸化蛋白激酶 B(phosphorylation Akt,p-Akt)( 1 1, 上海生工生物工程有限公司 ) 抗 β -actin(1 2, 武汉博士德生物公司 ), 流式细胞仪 ( 购自美国 BD 公司 ),PVDF 膜 ECL 化学发光试剂盒 ( 购自美国 Millipore 公司 ) 1.4 方法免疫组化染色检测结肠癌组织表达将甲醛固定的结肠组织和癌旁组织常规石蜡包埋, 制成 5 μm 的切片, 脱蜡至水, 加热修复抗原, 加入 H 2 O 2 消除内源性过氧化物酶滴加 2 3 滴抗体,4 孵育过夜 PBS 冲洗 3 次, 滴加 1 2 滴二抗,37 孵育 15 min,dab 显色液显色 1 min, 显微镜下观察图像染色强度参考以下标准, 分 : 无染色,1 分 : 弱阳性染色,2 分 : 阳性染色,3 分 : 强阳性染色阳性细胞比例参考以下标准,1 分 :~25%,2 分 :26%~75%,3 分 :76%~1% 每张切片随机选择 5 个视野, 由 2 位病理科医师采用双盲法进行评价, 若判定结果不一致, 则由第 3 位医师做出最后判定免疫染色评分 (immunoreactive score,irs) 以染色强度和阳性细胞比例综合判定, 两者相乘,IRS 评分 ~9 分, 其中分为阴性,1~2 分为低表达, 3~9 分为高表达细胞转染转染前 24 h, 将 HT29 和 SW48 铺于 6 孔板, 细胞密度为个 / 孔, 加入培养基培养, 待细胞达 8% 融合度, 利用 Lipofectamine 2 TM 转染质粒按照转染类型将细胞分为 3 组 : 空白对照组 (WT) 阴性对照组 (NC) 和 sh- 28 转染组, 空白对照组加入等量 Lipofectamine 2 TM 试剂, 阴性对照组加入阴性对照的质粒和 Lipofectamine 2 TM 试剂,sh- 转染组加入 sh- 质粒和 Lipofectamine 2 TM 试剂质粒和 Lipofectamine 2 TM 试剂按照 1 3 比例进行配置, 转染 6h 后, 再向每孔中加入 3μl FBS, 转染 24h 后更换为 DMEM 培养基, 转染 72h 后采用实时荧光定量聚合酶链反应 (quantitative real-time polymerase chain reaction,qrt-pcr) 检测 mr- NA 表达以评价转染效率 qrt-pcr 检测 mrna 表达取生长旺盛期细胞, 弃去培养基,PBS 冲洗 3 次, 加入 Trizol 试剂, 按照试剂说明书依次氯仿抽提异丙醇沉淀乙醇洗涤 ; 将 1 μg 总 RNA 逆转录为 cdna, 参考 SYBR GREEN 定量 PCR 说明书进行 PCR 反应, 总反应体系 3 μl 反应条件 :95 预变性 5min, 95 变性 5s,6 退火 3 s,72 延伸 2min, 总计 4 个循环正向引物 :5'-GTTGGGTGTGATG GAGGGAAG-3', 反向引物 :5'-CCTTCTCAGTGGTGC AACTGTG-3';β-actin 正向引物 :5'-CACCATTGGC AATGAGGGGTTC-3', 反向引物 :5'-AGGTCTTTGCG GATGTCCACGT-3' 定量分析结果以 Ct 值表示, 以 β-actin 作为内参,2 - Ct 作为目的基因相对表达量 CCK-8 法检测细胞增殖活性将细胞铺于 96 孔板中 (2 1 3 个 / 孔 ), 同时设置试剂空白对照孔和细胞空白对照空, 孵育 24 h 后于每孔中加入预先配置好的 CCK-8 试剂 (1 μl/ 孔 ),37 继续孵育, 于 45 nm 处检测吸光度值, 并以标准曲线读出样品的光密度值 (OD) 流式细胞术检测细胞生长周期细胞铺于 6 孔板中 (1 1 6 个 / 孔 ), 继续培养 24 h, 收集贴壁细胞, 加入 75% 乙醇固定,4 过夜 ; 第 2 天弃去固定液, 加入 RNA 酶以消除 RNA 的干扰 ; 再加入 PI 染液 (1 μl), 上机检测, 每次实验操作 3 次, 取平均值流式细胞术检测细胞凋亡将细胞铺于 6 孔板中 (1 1 6 个 / 孔 ), 继续培养 24h, 收集贴壁细胞, 依次加入 Annexin V(4μl) 和 Annexin V-FITC (5 μl) 染液, 避光孵育 15 min, 再加入 PI 染液 (1 μl), 上机检测, 每次实验操作 3 次, 取平均值 Transwell 小室法检测细胞侵袭能力用不含血清的培养基将转染后细胞浓度调整为个 /ml,transwell 上室每孔接种 15 μl 细胞, 下室加入 6 μl 含有 2% 胎牛血清的 RPMI 164 培养

第 3 期岳朝驰, 等 : 胃饥饿素对结肠癌细胞增殖和侵袭的影响及机制探讨基作为趋化剂,37 培养 48 h, 轻轻拭去表面非侵袭性细胞,4% 多聚甲醛固定, 结晶紫染色 1 min, 显微镜下统计穿透滤膜的细胞数 1.4.8 划痕实验检测细胞迁移能力将细胞接种于 6 孔板,Marker 笔在培养板后均匀划间距为.

4 第 3 期岳朝驰, 等 : 胃饥饿素对结肠癌细胞增殖和侵袭的影响及机制探讨基作为趋化剂,37 培养 48 h, 轻轻拭去表面非侵袭性细胞,4% 多聚甲醛固定, 结晶紫染色 1 min, 显微镜下统计穿透滤膜的细胞数划痕实验检测细胞迁移能力将细胞接种于 6 孔板,Marker 笔在培养板后均匀划间距为.5 cm 的横线, 每孔中铺个细胞, 细胞融合度 8% 时用无菌用移液枪枪头在单层细胞沿底部划出一字划痕,PBS 冲洗 3 次后, 培养 24 h 后在显微镜下测量划痕愈合的宽度 Western blot 检测 PI3K Akt p-akt mtor 及 p-mtor 蛋白表达取对数生长期细胞, 弃去培养液,PBS 冲洗, 加入离心管中, 再加入 1ml RIPA 裂解液置于冰浴上裂解 3min,4 条件下离心 15min, BCA 蛋白浓度试剂盒检测蛋白纯度将 2 μg 蛋白提取液置于 1% SDS-PAGE 电泳分离, 常规湿法转膜, 加入 5% 脱脂牛奶孵育封闭 2h 分别加入 PI3K Akt p-akt mtor 及 p-mtor 抗体,4 孵育 24 h 再滴加二抗 37 孵育 2h PBS 冲洗 3 次, 按照 ECL 化学发光显影试剂盒显影, 以 β-actin 作为内参照, 分析目的条带相对表达量统计学方法数据分析采用 SPSS 19. 统计软件, 计量资料以均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 组间比较采用方差分析, 两两比较用 SNK- 检验, 计数资料以构成比 (%) 表示, 分析用 χ 2 检验,Kaplan-Meier 法绘制 ROC 曲线, 比较用 Log-rank χ 2 检验, <.5 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 在肺癌组织中表达免疫组化染色结果显示, 蛋白主要位于细胞浆和细胞质, 出现棕色颗粒为阳性细胞 ( 见图结肠癌组织高表达率为 64.4%(58/9), 癌旁组织高表达率为 27.8%(25/9), 结肠癌组织高表达率高于癌旁组织 (χ 2 =24.347, =. 2.2 表达与结肠癌患者临床资料及生存预后的关系表达与肿瘤大小 TNM 分期及淋巴结转移有关, 肿瘤直径 5cm 组高表达率高于肿瘤直径 <5 cm 组,Ⅲ Ⅳ 期组高表达率高于 Ⅰ Ⅱ 组, 淋巴结转移组高表达率高于无淋巴结转移组, 组间比较差异有统计学意义 ( <.5); 表达与性别年龄及肿瘤分级无关 ( >.5) ( 见附表 ) 9 例结肠癌患者共计有 82 例获得完整随访, 其中, 低表达随访 3 例, 高表达随访 52 例生存曲线分析显示, 高表达总生存期和无病生存率均低于低表达 (χ 2 =4.983 和 4.1, =.34 和.43) 见图靶向 shrna 抑制目的基因 mrna 的表达 HIEC HT29 及 SW48 细胞 mrna 相对表达量比较差异有统计学意义 ( =7.21, =.) 结肠癌组织癌旁组织图 1 结肠癌和癌旁组织表达 ( 免疫组化 ) 附表表达与结肠癌患者临床资料的关系病理特征例数高表达低表达 χ 2 值值性别男性女性年龄 <6 岁岁肿瘤大小 <5 cm cm TNM 分期 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 肿瘤分级 G 1 ~G G 3~G 淋巴结转移有无

中国现代医学杂志第 27 卷 HT29 SW48 细胞 mrna 相对表达量高于 HIEC 细胞 ( <.5),HT29 SW48 细胞间 mrna 相对表达量比较差异无统计学意义 ( >.5) ( 见图 3A) NC WT 及 sh- 组 HT29 细胞和 SW48 细胞的 mrna 相对表达量比较差异有统计学意义 ( =5.431 和 6.193, =.14 和.

25), sh- 组 HT29 和 SW48 细胞的蛋白相对表达量低于 WT 组和 NC 组 ( 1 8 6 4 2 术后时间 / 月 <.5)( 见图低表达高表达 3D E), 证实 sh-rna 转染成功 2.

5 中国现代医学杂志第 27 卷 HT29 SW48 细胞 mrna 相对表达量高于 HIEC 细胞 ( <.5),HT29 SW48 细胞间 mrna 相对表达量比较差异无统计学意义 ( >.5) ( 见图 3A) NC WT 及 sh- 组 HT29 细胞和 SW48 细胞的 mrna 相对表达量比较差异有统计学意义 ( =5.431 和 6.193, =.14 和.),sh- 组 HT29 和 SW48 细胞的 mrna 相对表达量低于 WT 组和 NC 组 ( <.5) ( 见图 3B C) NC WT 及 sh- 组 HT29 细胞和 SW48 细胞的蛋白相对表达量比较差异有统计学意义 ( =4.37 和 5.172, =.31 和.25), sh- 组 HT29 和 SW48 细胞的蛋白相对表达量低于 WT 组和 NC 组 ( 术后时间 / 月 <.5)( 见图低表达高表达 3D E), 证实 sh-rna 转染成功 2.4 靶向 shrna 抑制结肠癌细胞的增殖对 HT29 和 SW48 细胞的 CCK-8 检测结果显示, 从培养的 24~12 h,nc 组和 WT 组细胞增殖能力比较差异无统计学意义 ( >.5); 从 48~12 h, sh- 组细胞增殖能力低于 NC 组和 WT 组 ( <.5)( 见图 4A B) 细胞周期检测结果显示, 在 HT29 和 SW48 细胞中,sh- 组细胞处于 S 期的比例高于 NC 组和 WT 组 ( HT29 =18.43, HT29 =.; SW48=19.247, SW48 =.), 而 NC 组 WT 组间比较差异无统计学意义 ( >.5) 见图 4C D 2.5 靶向 shrna 促进结肠癌细胞凋亡利用流式细胞仪检测细胞早期凋亡情况, 结果术后时间 / 月低表达高表达 A B β-actin A: 不同表达水平结肠癌患者无病生存率 ;B: 不同表达水平结肠癌患者总生存率图 2 表达与结肠癌患者生存预后的关系 1..5 HIEC HT29 SW48 HT29-NC HT29-WT HT29-sh- SW48- SW48- NC WT A B C 1..5 β-actin ) 3) ) SW48-sh- 3) HT29-NC HT29-WT HT29-sh- SW48- SW48- NC WT SW48-sh- D E A:HIEC HT29 SW48 细胞 mrna 相对表达量 ;B: 转染空质粒未转染质粒及转染 sh- 干扰质粒的 HT29 细胞 mrna 相对表达量 ;C: 转染空质粒未转染质粒及转染 sh- 干扰质粒的 SW48 细胞 mrna 相对表达量 ;D: 转染空质粒未转染质粒及转染 sh- 干扰质粒的 HT29 细胞蛋白相对表达量 ;E: 转染空质粒未转染质粒及转染 sh- 干扰质粒的 SW48 细胞蛋白相对表达量与 HIEC 细胞比较, <.1; 与 HT29-sh- 组比较, <.1;3) 与 SW48-sh- 比较, <.1 图 3 各组细胞 mrna 表达水平 3

第 3 期岳朝驰, 等 : 胃饥饿素对结肠癌细胞增殖和侵袭的影响及机制探讨显示 NC WT 及 sh- 组 HT29 和 SW48 细胞早期凋亡比例比较, 差异有统计学意义 ( =14.91 和 12.943, 均 =.), 在 HT29 和 SW48 细胞中, sh- 组细胞早期凋亡比例高于 NC 组和 WT 组 ( <.

5),NC 组 WT 组间细胞迁移距离比较差异无统计学意义 ( >.5)( 见图 6A B) Transwell 小室实验结果显示,NC WT 及 sh- 组 HT29 SW48 细胞的侵袭细胞数比较差异有统计学意义 ( =25.41 和 2.745, 均 =.),HT29 SW48 细胞中,sh- 组侵袭细胞数少于 NC 组和 WT 组 ( <.

6 第 3 期岳朝驰, 等 : 胃饥饿素对结肠癌细胞增殖和侵袭的影响及机制探讨显示 NC WT 及 sh- 组 HT29 和 SW48 细胞早期凋亡比例比较, 差异有统计学意义 ( =14.91 和 , 均 =.), 在 HT29 和 SW48 细胞中, sh- 组细胞早期凋亡比例高于 NC 组和 WT 组 ( <.5),NC 组 WT 组间细胞早期凋亡比例比较差异无统计学意义 ( >.5) 见图靶向 shrna 抑制结肠癌细胞侵袭和迁移划痕实验显示,NC WT 及 sh- 组 HT29 SW48 细胞的迁移距离比较差异有统计学意义 ( = 和 72.94, 均 =.),HT29 SW48 细胞中,sh- 组细胞迁移距离少于 NC 组和 WT 组 ( <.5),NC 组 WT 组间细胞迁移距离比较差异无统计学意义 ( >.5)( 见图 6A B) Transwell 小室实验结果显示,NC WT 及 sh- 组 HT29 SW48 细胞的侵袭细胞数比较差异有统计学意义 ( =25.41 和 2.745, 均 =.),HT29 SW48 细胞中,sh- 组侵袭细胞数少于 NC 组和 WT 组 ( <.5),NC 组 WT 组间侵袭细胞数比较差异无统计学意义 ( >.5) 见图靶向 shrna 抑制 PI3K-Akt-mTOR 信号通路 Western 组 HT29 细胞中 PI3K p-akt 以及 p-mtor 蛋白相对表达量比较差异有统计学意义 ( PI3K =7.641, PI3K=.1; p-akt =6.218, p-akt =.; p-mtor =4.732, p-mtor=.,nc WT 及 sh- 组 SW48 细胞中 PI3K p-akt 及 p-mtor 蛋白相对表达量比较差 HT29-NC HT29-WT HT29-sh- 覮覮覮覮 1. 覮覮覮.5 覮时间 /h 2. SW48-NC SW48-WT SW48-sh- 时间 /h A HT29-NC HT29-WT HT29-sh- G /G % G /G % G /G % 1 S 34.18% 1 S 34.92% 8 S 34.2% 8 G 2/M 11.47% 8 G 2/M 11.7% G 2/M 13% SW48-NC SW48-WT SW48-sh- G /G 1 44% 1 S 42.82% G 2 /M15.64% G /G % S 42.92% G 2/M 13.48% C D G /G % S 53.74% G 2/M 9.96% B G /G 1 期 S 期 G 2/M 期 HT29-NC G /G 1 期 S 期 G 2/M 期 blot 检测结果显示,NC WT 及 sh- HT29-WT HT29-sh- SW48-NC SW48-WT SW48-sh- A: 干扰表达对 HT29 细胞增殖的影响 ;B: 干扰表达对 SW48 细胞增殖的影响 ;C: 干扰表达对 HT29 细胞周期的影响 ;D: 干扰表达对 SW48 细胞周期的影响与 HT29-NC 组或与 HT29-WT 组比较, <.1; 与 SW48-NC 组或与 SW48-WT 组比较, <.1 图 4 各组细胞周期和增殖 31

中国现代医学杂志 HT29-NC 第 27 卷 HT29-sh- HT29-WT 15 2.88%.

53% 1 1 2 3 HT29-NC HT29-WT HT29-sh 1 4 A SW48-NC.

91% 2 15 1 5 5.1% 85.68% 1 8.2% 11 12 13 14 69.14% 6.

6% SW48-NC SW48-WT SW48-sh 1 11 12 13 14 B A 干扰表达对

HT29-WT 组比较 <.1 2 与 SW48-NC 组或与 SW48-WT 组比较 <.

7 中国现代医学杂志 HT29-NC 第 27 卷 HT29-sh- HT29-WT %.57%.2% 2.16%.21% 4.9% % % 3.27% % % % HT29-NC HT29-WT HT29-sh 1 4 A SW48-NC.33% SW48-WT 2.33% 5.77% SW48-sh- 7.52%.87% % % 85.68% 1 8.2% % 6.49% % SW48-NC SW48-WT SW48-sh B A 干扰表达对 HT29 细胞凋亡的影响 B 干扰表达对 SW48 细胞凋亡的影响 1 与 HT29-NC 组或与 HT29-WT 组比较 <.1 2 与 SW48-NC 组或与 SW48-WT 组比较 <.1 图 5 各组细胞凋亡的影响 =6.59 PI3K=. p-akt=7.321 在 HT29 p-akt=. p-mtor=5.47 p-mtor=.11 组 WT 组间 PI3K Akt p-akt mtor 及 p-mtor 蛋白相对表达量比较差异无统计学意义 >.5 见 SW48 细胞中 sh- 组 PI3K p-akt p-mtor 图 7 异有统计学意义 PI3K 蛋白相对表达量低于 NC 组和 WT 组 <.5 NC h 24 h h HT29NC SW48NC 15 1 HT29WT 15 1 SW48WT 覮 5 HT29-sh 24 h 覮 5 SW48-sh A B 覮 HT29-NC HT29-WT HT29-sh- C 32 HT29-NC HT29-WT HT29-sh

第 3 期岳朝驰, 等 : 胃饥饿素对结肠癌细胞增殖和侵袭的影响及机制探讨 15 1 5 覮 SW48-NC SW48-WT SW48-sh- D A: 划痕实验检测 HT29

覮与 NC 组或与 WT 组比较, <.1 图 6 各组细胞迁移侵袭能力 PI3K HT29-NC HT29-WT HT29-sh- Akt p-akt 1. mtor p-mtor.

Akt p-akt 1. mtor p-mtor β-actin SW48- NC SW48- SW48-sh- WT.

p-akt mtor 及 p-mtor 蛋白表达与 HT29-NC 组或与 HT29-WT 组比较, <.1; 与 SW48-NC 组或与 SW48-WT 组比较, <.

有研究发现 [8], 胃饥饿素能够维持葡萄糖稳态, 在糖尿病及其并发症的治疗中展现 B 干扰表达对 PI3K-Akt-mTOR 信号通路相关蛋白的影响 33 潜在的价值

8 第 3 期岳朝驰, 等 : 胃饥饿素对结肠癌细胞增殖和侵袭的影响及机制探讨覮 SW48-NC SW48-WT SW48-sh- D A: 划痕实验检测 HT29 细胞迁移能力 ;B: 划痕实验检测 SW48 细胞迁移能力 ;C:Transwell 小室实验检测 HT29 细胞侵袭能力 ;D:Transwell 小室实验检测 SW48 细胞侵袭能力覮与 NC 组或与 WT 组比较, <.1 图 6 各组细胞迁移侵袭能力 PI3K HT29-NC HT29-WT HT29-sh- Akt p-akt 1. mtor p-mtor.5 β-actin HT29-NC HT29-WT HT29-sh- PI3K Akt p-akt mtor p-mtor A PI3K SW48-NC SW48-WT SW48-sh- Akt p-akt 1. mtor p-mtor β-actin SW48- NC SW48- SW48-sh- WT.5 PI3K Akt p-akt mtor p-mtor A:HT29 细胞 PI3K Akt p-akt mtor 及 p-mtor 蛋白表达,B:SW48 细胞 PI3K Akt p-akt mtor 及 p-mtor 蛋白表达与 HT29-NC 组或与 HT29-WT 组比较, <.1; 与 SW48-NC 组或与 SW48-WT 组比较, <.1 3 讨论图 7 胃饥饿素是由胃黏膜细胞分泌的一种活性多肽, 已被证实与迷走神经的兴奋性有关胃饥饿素与内源性受体结合, 刺激下丘脑摄食中枢, 使食欲增加和减少脂肪分解有研究发现 [8], 胃饥饿素能够维持葡萄糖稳态, 在糖尿病及其并发症的治疗中展现 B 干扰表达对 PI3K-Akt-mTOR 信号通路相关蛋白的影响 33 潜在的价值近年来大量研究指出, 胃饥饿素在肿瘤的发生进展方面发挥一定作用杜成雄 [9] 报道, 终末期分化程度低的直肠癌患者血清胃饥饿素升高 TAKIGUCHI 等 [1] 也证实, 组织胃饥饿素表达水平与胃癌的浸润深度分化类型及 TNM 分期密切相关本研究显示, 结肠癌组织高表达率高于

9 中国现代医学杂志第 27 卷癌旁组织, 表达水平与结肠癌瘤体大小 TNM 分期及淋巴结转移有关, 提示胃饥饿素在结肠癌中可能起到类似癌基因的作用 TAKIGUCHI 等 [11] 对行根治性远端胃切除术的胃癌患者进行随访观察, 结果发现胃饥饿素可以使患者胃排空延迟, 并导致术后化疗相关恶心呕吐 ; 血浆胃饥饿素水平越高, 患者 3 年生存率越低本研究对结肠癌患者术后进行规律随访, 结果发现高表达组总生存期和无病生存率均低于低表达组, 提示胃饥饿素亦可以作为评价结肠癌预后生存的指标之一为进一步探讨对结肠癌生物学行为的影响及作用机制, 本研究采用 shrna 技术干扰人结肠癌细胞 HT29 和 SW48 中的表达, 结果显示 HT29 SW48 细胞 mrna 相对表达量高于 HIEC 细胞, 说明结肠癌细胞高表达, 可能是结肠细胞恶性病变的标志物干扰 HT29 SW48 细胞表达,sh- 组细胞增殖能力低于阴性对照组 (NC 组 ) 和野生组 (WT 组 ), 说明敲除基因能够抑制结肠癌细胞的增殖能力李振远等 [12] 报道, 参与维持核糖体的正常功能, 并促进 DNA 的复制和相关蛋白的合成, 这也是肿瘤发生发展的重要过程抑制的表达, 肿瘤细胞正常功能蛋白合成受阻, 增殖功能也受到影响细胞的增殖与分裂周期密切相关, 本研究进一步发现抑制表达能够引起细胞分裂阻滞 S 期, 从而抑制结肠癌细胞的生长有研究显示 [13], 能够促进细胞周期相关基因的表达和 Cyclins-CDKs 复合物功能, 使 DNA 合成加速并诱导瘤体生长也有学者认为 [14], 特异性沉默基因, 能够序贯性降低下游 1 基因的表达, 导致调控细胞 S 周期转变检查点功能失调, 细胞被特异性阻滞 S 周期限本研究的设计方案, 尚未深入探讨对细胞周期阻滞的具体机制细胞凋亡是真核生物最重要的生长调控机制, 也是影响细胞增殖速度的主要因素细胞凋亡由一系列凋亡途径所介导, 细胞的凋亡增加, 必然引起细胞增殖能力减弱国外研究显示 [15], 抑制能够下调凋亡抑制基因 Bcl-2 和 p53, 并激活凋亡因子 Caspase 家族成员 (Caspase-3 Caspase-9), 导致细胞凋亡加速本研究利用流式细胞术检测结肠癌细胞凋亡情况, 结果显示, 抑制可以提高结肠癌细胞早期凋亡比例但需要注意的是, 对绝大多数结肠癌细胞,p53 在早期已经发生突变, 理论上无法参 34 与后续的凋亡信号途径, 因此所介导的促凋亡效应可能与其他机制有关有研究报道称 [16], 胃癌细胞发生 EMT 时,TGF-β 能够促进表达, 而过表达又能反过来刺激 TGF-β 表达增加, 使细胞获得侵袭迁移的能力本研究也发现, HT29 SW48 细胞中,sh- 组侵袭细胞数细胞迁移距离低于 NC 组和 WT 组, 说明抑制可以阻断结肠癌细胞侵袭迁移等生物学行为但是本研究尚无法证实侵袭迁移的抑制是否与阻断 EMT 有关 PI3K-Akt-mTOR 信号通路是调控肿瘤发生发展的重要生物学信号转导通路 [17-18], 包括细胞周期调控血管新生基因的转录及翻译等激活磷脂肌醇 3- 激酶可以诱导蛋白激酶 B(Akt) 磷酸化, 活化的 Akt 又将信号传递至下游底物雷帕霉素靶体蛋白, 并控制诸如凋亡转录及翻译等生物学效应研究显示 [19], 丝苏氨酸激酶抑制剂能够抑制 PI3K-AktmTOR 通路, 阻断结肠癌细胞增殖和侵袭等行为 PARK 等 [2] 也证实,PI3K-Akt-mTOR 信号通路激活程度可以作为结肠癌患者预后的重要指标本研究显示, 结肠癌 HT29 SW48 细胞中,sh- 组 PI3K p-akt 及 p-mtor 蛋白相对表达量低于 NC 组和 WT 组, 说明抑制表达能够阻断 PI3K- Akt-mTOR 信号通路, 并抑制细胞的增殖和侵袭上述研究结果也说明可能是通过 PI3K-AktmTOR 信号通路调控结肠癌细胞增殖和侵袭等生物学行为综上所述, 结肠癌组织表达上调, 并与结肠癌患者生存预后有关干扰表达能够抑制结肠癌细胞增殖侵袭, 其作用机制可能与抑制 PI3K-Akt-mTOR 信号通路有关参考文献 : [1] DAMANIA D, SUBRAMANIAN H, BACKMAN V, et al. Network signatures of nuclear and cytoplasmic density alterations in a model of pre and postmetastatic colorectal cancer[j]. J Biomed Opt, 214, 19(: [2] POTTER MB. Strategies and resources to address colorectal cancer screening rates and disparities in the United States and globally[j]. Annu Rev Public Health, 213, 34(: [3] KASACKA I, ARCISZEWSKI M, 覵 EBKOWSKI W. Extraordinary level of hormone and number of ghrelin cells in the stomach and duodenum of an obese woman[j]. Acta Histochem, 214, 116(:

10 第 3 期岳朝驰, 等 : 胃饥饿素对结肠癌细胞增殖和侵袭的影响及机制探讨 [4] 高寅生, 侯亚勃, 杨晓军, 等. 胃饥饿素 / 肽 YY/ 刺鼠相关蛋白信号在胃旁路手术治疗 2 型糖尿病中的作用 [J]. 中华实验外科杂志, 216,33(5): [5] EOM J, HONG M, CONE RD, et al. Zebrafish ghrelin is expressed in pancreatic endocrine cells and regulated by metabolic state[j]. Biochem Biophys Res Commun, 213, 439(: [6] NORTHRUP R, KURODA K, DUUS EM, et al. Effect of ghrelin and anamorelin (ONO-7643), a selective ghrelin receptor agonist, on tumor growth in a lung cancer mouse xenograft model[j]. Support Care Cancer, 213, 21(9): [7] 毕建成, 田伟, 王国文, 等. 结肠癌患者血清脂联素和胃饥饿素水平的临床分析 [J]. 标记免疫分析与临床,215, 22(4): [8] LIU BW, LU Q, MA CM, et al. The study of soluble intercellular adhesion molecule-1 and ghrelin in adolescents with family history of type 2 diabetes[j]. Endocrine, 212, 42(3): [9] 杜成雄. 两种手术方式直肠癌术后应激反应期胃饥饿素的动态变化及其临床意义 [J]. 中国普通外科杂志,214, 23(: [1] TAKIGUCHI S, TAKATA A, MURAKAMI K, et al. Clinical application of ghrelin administration for gastric cancer patients undergoing gastrectomy[j]. Gastric Cancer, 214, 17(: [11] TAKIGUCHI S, HIURA Y, TAKAHASHI T, et al. Effect of rikkunshito, a Japanese herbal medicine, on gastrointestinal symptoms and ghrelin levels in gastric cancer patients after gastrectomy[j]. Gastric Cancer, 213, 16(: [12] 李振远, 李方方, 张勇, 等. 胃饥饿素 : 生物学特征及对动物采食量的调控 [J]. 动物营养学报,216, 28(: [13] WASEEM T, DUXBURY M, ASHLEY SW, et al. promotes intestinal epithelial cell proliferation through PI3K/Akt pathway and EGFR trans-activation both converging to ERK 1/2 phosphorylation[j]. Peptides, 214, 52(5): [14] LEE JH, PATEL K, TAE HJ, et al. augments murine T-cell proliferation by activation of the phosphatidylinositol-3- kinase, extracellular signal-regulated kinase and protein kinase C signaling pathways[j]. FEBS Lett, 214, 588(24): [15] ZHU J, ZHENG C, CHEN J, et al. protects human umbilical vein endothelial cells against high glucose-induced apoptosis via mtor/p7s6k signaling pathway[j]. Peptides, 214, 52(: [16] RODR 魱 GUEZ A, G 魷 MEZ-AMBROSI J, CATAL 觃 N V, et al. The ghrelin O-Acyltransferase- system reduces TNF-α- Induced apoptosis and autophagy in human visceral adipocytes [J]. Diabetologia, 212, 55(1: [17] 郭琳, 王强.PI3K/Akt/mTOR 信号传导通路与恶性肿瘤浸润和转移的研究进展 [J]. 现代肿瘤医学,29, 17(8): [18] 周笑, 杨鹏, 于雁, 等.PI3K/Akt/mTOR 信号转导通路与肿瘤 [J]. 国际免疫学杂志,216,39(3): [19] ZHANG X, SHI H, TANG H, et al. MiR-218 inhibits the invasion and migration of colon cancer cells by targeting the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway[j]. Int JMol Med, 215, 35(5): [2] PARK JH, KIM JJ, BAE YS. Involvement of PI3K-Akt-mTOR pathway in protein kinase CKII inhibition-mediated senescence in human colon cancer cells[j]. Biochem Biophys Res Commun, 213, 433(4): ( 王荣兵编辑 ) 35

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot