960 第三军医大学学报,2018,40(11) htp://aammt.tmmu.edu.cn techniquewasusedtotreattheu 87MGcels(withhighexpresionofTRIM29),andthenthecelswere dividedinto3groups

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破錞王
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1 959 DOI: /j TRIM29 基因在胶质瘤中的表达及其对胶质母细胞瘤细胞 U 87MG 增殖与迁移的影响王雨涛 1, 周济 2, 杨冬 1 1,3, 张云东重庆, 陆军军医大学 ( 第三军医大学 ) 第三附属医院 ( 野战外科研究所 ) 神经外科 1 ; 北京, 解放军火箭军总医院神经外科 2 3 ; 重庆, 重庆医科大学第三附属医院神经疾病中心 [ 摘要 ] 目的观察 TRIM29 基因在胶质瘤组织中的表达及其与临床病理特征的关系, 探讨其对胶质母细胞瘤细胞 U 87MG 增殖与迁移的影响以及可能的作用机制方法采用免疫组织化学法检测 56 例胶质瘤组织和正常脑组织中 TRIM29 蛋白的表达, 分析胶质瘤组织中 TRIM29 蛋白表达与临床病理特征的关系 Westernblot 检测胶质母细胞瘤组织癌旁组织及正常组织中 TRIM29 蛋白的表达, 同时检测其在不同胶质瘤细胞株 (A172 LN 229 U 87MG U 118MG) 中的表达利用 RNA 干扰技术处理高表达 TRIM29 的胶质母细胞瘤细胞 U 87MG, 并分为空白对照组 shscramble 组 ( 阴性对照组 ) 及 shtrim29 组 ( 实验组 ) 采用 MTT 实验克隆形成实验和 Transwel 实验分别检测敲低 TRIM29 对胶质母细胞瘤细胞 U 87MG 增殖和迁移能力的影响进一步通过裸鼠成瘤实验检测敲低 TRIM29 在体内对胶质母细胞瘤细胞 U 87MG 增殖的影响采用 Westernblot 检测 TRIM29 敲低后 AKT 通路蛋白的变化结果 TRIM29 在胶质瘤组织中较正常脑组织表达增加, 且与患者 WHO 分级呈正相关 (r=0.535, P<0.05) Westernblot 检测结果显示, 与正常脑组织和癌旁组织相比, 胶质母细胞瘤组织中 TRIM29 蛋白的表达明显上调 (P<0.05) TRIM29 在胶质瘤细胞 A172 LN 229 U 87MG U 118MG 中蛋白的表达分别为 (0.27±0.02) (0.69±0.04) (1.24±0.08) (0.82±0.06) RNA 干扰处理后,shTRIM29 组 U 87MG 细胞 TRIM29 蛋白的表达量为 (0.27±0.04), 明显低于空白对照组和 shscramble 组 [(1.64± 0.05) (1.51±0.05),P<0.05] 同时, 与空白对照组和 shscramble 组相比,shTRIM29 组 U 87MG 细胞的增殖迁移能力明显下降 (P<0.05) 在胶质母细胞瘤细胞 U 87MG 中敲低 TRIM29 后,p AKT 蛋白表达明显降低 (P<0.05) 结论 TRIM29 在胶质瘤中高表达, 与肿瘤的恶性程度呈正相关, 可能通过 AKT 信号通路促进细胞的增殖及迁移 [ 关键词 ] TRIM29; 胶质母细胞瘤 ; 增殖 ; 迁移 [ 中图法分类号 ] R394.2;R730.23;R [ 文献标志码 ] A ExpresionofTRIM29ingliomasanditsefectonproliferationandmigrationof glioblastomau 87MG cels WANGYutao 1,ZHOUJi 2,YANGDong 1,ZHANGYundong 1,3 1 DepartmentofNeurosurgery,InstituteofSurgery Research,Third Afiliated Hospital, ArmyMedicalUniversity(Third MilitaryMedicalUniversity), Chongqing, ; 2 DepartmentofNeurosurgery,GeneralHospitalofPLA RocketForce,Beijing,100088; 3 Departmentof Neurosurgery,theThirdAfiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing,401120,China [Abstract] Objective ToobservetheexpresionofTRIM29ingliomatisuesanditsrelationship withclinicopathologicalfeatures,andtodetermineitsefectontheproliferationandmigrationofglioblastoma U 87MGcelsandinvestigateitsposiblemechanism.Methods Immunohistochemicalasaywasusedto detecttheexpresionoftrim29proteinin56samplesofgliomatisuesandnormalbraintisues,andthe relationshipbetweentrim29proteinlevelandclinicopathologicalfeatureswasanalyzed.westernblotingwas usedtodetecttheexpresionoftrim29proteinintheglioblastomatisues,paracanceroustisuesandnormal tisues,andindiferentgliomacellines(a172,ln 229,U 87MGandU 118MG).RNAinterference [ 通信作者 ] 张云东,E mail:zhangyundong6688@163.com [ 优先出版 ] htp://kns.cnki.net/kcms/detail/ r html

2 960 第三军医大学学报,2018,40(11) htp://aammt.tmmu.edu.cn techniquewasusedtotreattheu 87MGcels(withhighexpresionofTRIM29),andthenthecelswere dividedinto3groups:blankcontrolgroup,shscramblegroupandshtrim29group.subsequently,mtt asay,colonyformationasayandtranswelchambertestwereusedrespectivelyfortheefectsoftrim29 knockdownontheproliferationandmigrationoftheu 87MGcels.Theefectwasfurtherstudiedthrough nudemousetumorigenesisasay.finaly,westernblotingwasusedtodetectthechangesofaktpathway proteinsaftertheknockdownoftrim29.results TheexpresionofTRIM29ingliomatisuewashigher thanthatinnormalbraintisue,andpositivelycorelatedwiththewho grade(r=0.535,p<0.05). WesternblotingshowedthattheexpresionofTRIM29proteinwassignificantlyup regulatedinglioblastoma tisueswhencomparedwithnormalbraintisuesandadjacentnormaltisues(p<0.05).theproteinlevelof TRIM29was0.27±0.02,0.69±0.04,1.24±0.08and0.82±0.06,respectivelyingliomaA172,LN 229,U 87MGandU 118MGcels.IntheU 87MGcelsafterRNAinterference,theproteinexpresionof TRIM29was0.27±0.04,significantlylowerthanthatoftheblankcontrolgroup(1.64±0.05,P<0.05) andthatofshscramblegroup(1.51±0.05,p<0.05).theproliferationandmigrationweresignificantly decreasedofinthetrim29knockdownu 87MGcelsthantheblankcontrolandnegativecontrolgroups (P<0.05).Inaddition,theknockdownofTRIM29alsodecreasedthep AKTproteinlevel(P<0.05). Conclusion TRIM29ishighlyexpresedingliomasandpositivelycorelatedwithtumormalignancy,andit maypromotetheproliferationandmigrationofthecelsthroughtheaktsignalingpathway. [Keywords] TRIM29;glioblastoma;proliferation;migration Corespondingauthor:ZHANGYundong,E 胶质母细胞瘤为常见的原发性颅脑肿瘤, 以疗效差预后不良为主要特点, 其平均中位生存期仅为 14 个月 [1-3] 目前已知遗传细菌感染环境影响以及其他多种因素均会参与胶质母细胞瘤的发生进程, 然而其内在的分子机制仍然所知甚少 [4] 因此, 进一步探索胶质母细胞瘤的发病机制进而发展新的治疗手段就显得尤为重要 TRIM29 基因又被称作 ATDC 基因, 属于 TRIM 家族的一员 ( 该家族成员超过 70 多种 ) [5] 研究表明, TRIM 家族在参与调控诸多细胞进程 ( 如细胞生长分化发生发育凋亡及炎症等 ) 中发挥重要作用 [6-9] 近年来,TRIM 家族对肿瘤的调控越发受到关注作为 TRIM 家族的一员,TRIM29 在诸多肿瘤中发挥着促癌作用通过对 TRIM29 表达的检测, 发现在膀胱癌胃癌肺癌以及胰腺癌中,TRIM29 的高表达与肿瘤的恶性程度及肿瘤患者的不良预后呈正相关 [10-11] 目前 TRIM29 在颅内肿瘤中的表达尚不明确, 其对胶质母细胞瘤生物学行为的调控及相关作用机制更不清楚因此, 本实验将对 TRIM29 在胶质瘤中的表达进行检测, 并分析其与临床特征的相关性, 同时探究 TRIM29 对胶质母细胞瘤细胞增殖及迁移的影响, 并探索可能的分子作用机制 1 材料与方法 1.1 主要试剂人胶质瘤细胞系 (U 118MG U 87MG LN 229 A 172) 购自美国 ATCC 细胞库 (AmericanTypeCulture Colection),DAB 检测试剂盒购自万类生物胎牛血清 DMEM 细胞培养基胰蛋白酶 Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen), 总蛋白提取试剂盒 ( 碧云天 ),MTT 试剂盒 (Sigma),Transwel 小室 (Milipore), 鼠抗人 TRIM29 α tubulin p AKT 及 AKT 一抗 (CelSignaling Technology), 鼠抗人 Ki67 一抗 (BDBiosciences), 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗 (Life), 对照组 (shscramble) 病毒及 TRIM29 干扰病毒 (shtrim29) 由上海吉玛基因公司构建, 见表 1 表 1 shtrim29 与 shscramble 序列名称 shscramble shtrim29 序列 (5 3 ) 正义链 :CCGGGAACTCGAGTTCACATGGTTCCTCGAGGAACCATGTGAACTCGAGTTCTTTTTG 反义链 :AATTCAAAAAGAACTCGAGTTCACATGGTTCCTCGAGGAACCATGTGAACTCGAGTTC 正义链 :CCGGACCTGAGCCGTAACTTCATTGCTCGAGCAATGAAGTTACGGCTCAGGTTTTTTG 反义链 :AATTCAAAAAACCTGAGCCGTAACTTCATTGCTCGAGCAATGAAGTTACGGCTCAGGT

3 临床资料选取 2007 年 1 月至 2012 年 9 月陆军军医大学第三附属医院神经外科手术切除的胶质瘤组织标本 56 例所选病例术前均未行放化疗, 术后病理组织学检查证实为胶质瘤包括男性 34 例, 女性 20 例 ; 年龄 31~67(45.3±9.3) 岁, 其中 40 岁 20 例,>40 岁 36 例据 WHO 分级,Ⅰ ~Ⅱ 期 26 例,Ⅲ 期 17 例,Ⅳ 期 13 例, 见表 2 同时另取由高血压所导致的脑出血行正常脑组织切除减压患者标本 16 例为对照组并于术中收集脑胶质母细胞瘤组织癌旁组织及正常脑组织 ( 对照 ) 各 4 例用以 TRIM29 蛋白表达检测 1.3 方法免疫组化采用 DAB 检测试剂盒检测 TRIM29 和 Ki67 的表达情况结果判定标准 : 根据阳性细胞所占视野面积百分比评分为 1(<10%), 2(10% ~50%),3(>50% ~75%) 和 4(>75%) 染色强度分为无显色为 0 分, 淡黄色为 1 分, 黄色为 2 分, 棕黄色为 3 分染色指数为两者计分相乘,0~ 1 分 : - ;2~3 分 : + ;4~6 分 : ++ ;>6 分 : +++ >4 判定为高表达, 4 判定为低表达细胞培养胶质瘤细胞株 U 118MG U 87 MG LN 229 A 172 培养于恒定 37,5%CO 2 浓度的细胞培养箱细胞每 2 天更换 1 次培养基, 对数生长期传代慢病毒感染 U 87MG 细胞取对数期生长良好的 U 87MG 细胞, 以每孔细胞数接种于 12 孔板并将其分为空白对照组 shscramble 组 ( 阴性对照组 ) 及 shtrim29 组 ( 实验组 ) 于 37 5% CO 2 的培养箱中培养 24h, 待细胞密度达到约 40% 时, 将 shscramble 及 shtrim29 慢病毒以感染复数值 3 分别感染对照组与实验组细胞 24h 后, 更换培养液并加入 3μg/mL 嘌呤霉素筛选获得感染成功的阳性细胞, 待细胞生长状态稳定后, 改用含低浓度嘌呤霉素的培养基维持培养, 经扩大培养后即可获得稳定敲低的各组细胞株蛋白质提取以及 Westernblot 检测应用总蛋白提取试剂盒提取各细胞及组织总蛋白, 利用 BCA 法检测蛋白质浓度通过 10% 的 SDS PAGE 凝胶电泳各组蛋白质, 并转膜至 PVDF 膜, 以 5% 脱脂牛奶室温封闭 2h 再加入鼠抗人 TRIM29 抗体及鼠抗人 α tubulin 抗体,4 中孵育过夜次日 TBST 洗膜 3 次, 每次 5min, 室温下以辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗孵育 2h,TBST 洗涤 3 次, 每次 5min, 利用 ECL 化学发光液显影 MTT 细胞增殖实验利用 MTT 实验检测 TRIM29 对 U 87MG 细胞增殖的影响细胞分为空白对照组 shscramble 组 ( 阴性对照组 ) 及 shtrim29 组 ( 实验组 ), 将各组 U 87MG 细胞接种于 96 孔板内, 分别于 d 每孔中加入 5mg/mL 的 MTT 试剂 10μL, 避光于 37 孵育 4h, 吸去上清, 加入 200μL DMSO, 室温震荡 10min 后, 于波长 560nm 处测定光密度值 [D(560)] 肿瘤细胞克隆形成实验 1.2% Softagar 配制 : 称取 1.2g 软琼脂, 定容至 100mL, 经高压处理后置于 60 留存底层胶 : 将 500μL2 DMEM 培养和等体积的 1 DMEM 培养基混匀后平铺于 6 孔板, 等待冷却待用上层胶 : 取 5mL 离心管, 加入 2mL1 DMEM 培养基, 然后将各组细胞消化计数, 按空白对照组 shscramble 组 ( 阴性对照组 ) 及 shtrim29 组 ( 实验组 ) 每组 1000 个细胞加入离心管中进行悬浮 ; 再准备另外一只离心管, 向其中分别加入 1.5mL2 DMEM 和等体积的 1.2% Softagar, 充分混匀后吸取 2mL 于以上培养基充分混匀最后向孔中加入 1.5mL 混合液作为上层胶, 每组重复 3 次, 待胶充分凝固后放于 37 培养箱中进行培养 14~21d 后, 用 MTT 染色 30min 进行拍照检测 Transwel 实验检测细胞的迁移能力分别取对数生长期的空白对照组 shscramble 组 ( 阴性对照组 ) 及 shtrim29 组 ( 实验组 )U 87MG 细胞经消化离心后, 用新鲜培养基重悬并进行细胞计数, 以 / 孔接种于小室的上室, 改用 1% 的培养基进行饥饿培养, 下室加入含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基, 孵箱培养后, 取出小室进行用多聚甲醛固定 15min, PBS 洗涤 3 次 5min, 结晶紫染色 20min,PBS 洗涤 3 次 5min, 干燥后置于显微镜下观察并计数裸鼠体内成瘤实验选取 3~4 周龄, 由西南大学家蚕基因生物学国家重点实验室提供的雌性裸鼠进行实验取对数生长期的空白对照组 shscramble 组 ( 阴性对照组 ) 及 shtrim29 组 ( 实验组 )U87 MG 细胞, 以 PBS 调整细胞数为个 /ml, 取 0.1mL 细胞悬液注射于小鼠前肢背部皮下, 共 18 只, 每组 6 只之后每隔 5d 观测裸鼠皮下肿瘤生长情况, 并以游标卡尺测量肿瘤体积在第 30 天时, 通过颈椎脱臼法处死各组小鼠, 并拍照测量肿瘤体积 ( 长径短径 2 0.5)

962 第三军医大学学报,2018,40(11) htp://aammt.tmmu.edu.cn 1.4 统计学分析采用 SPSS19.0 统计软件进行数据分析, 每项实验至少重复 3 次, 计量资料以 x±s 珋表示, 两组间比较采用 t 检验 ; 相关性分析采用 Spearman 相关分析检验水准 :α=0.05 2 结果 2.

05), 与年龄性别无明显相关性 ( 表 2) 2.2 TRIM29 在胶质母细胞瘤组织及细胞中高表达因 TRIM29 的表达与 WHO 分级呈显著正相关, 故选取胶质母细胞瘤 (Ⅳ 级 ) 组织及其细胞株作为研究对象 Westernblot 检测结果显示, 相较于癌旁组织及正常组织,TRIM29 在胶质母细胞瘤组织中的蛋白表达量显著增高 (P<0.

TRIM29 的蛋白表达 A:TRIM29 在正常脑组织中阴性表达 ;B:TRIM29 在胶质瘤细胞中阳性表达图 1 TRIM29 在正常脑组织和胶质瘤组织中的表达 (S P 200) 表 2 TRIM29 在 56 例胶质瘤标本中的表达及临床病理参数 TRIM29 表达量临床病理特征例数 P 值低表达高表达年龄 0.063 >40 岁 36 14 22 40 岁 20 13 7 性别 0.

4 962 第三军医大学学报,2018,40(11) htp://aammt.tmmu.edu.cn 1.4 统计学分析采用 SPSS19.0 统计软件进行数据分析, 每项实验至少重复 3 次, 计量资料以 x±s 珋表示, 两组间比较采用 t 检验 ; 相关性分析采用 Spearman 相关分析检验水准 :α= 结果 2.1 胶质瘤组织中 TRIM29 蛋白表达与临床特征的关系 TRIM29 蛋白阳性表达主要定位于胶质瘤及正常脑组织的细胞质中 TRIM29 在胶质瘤组织中多以强阳性表达, 而在正常脑组织中阳性表达较少, 多以阴性或弱阳性为主 ( 图 1) Spearman 相关分析结果显示, 胶质瘤组织中 TRIM29 的表达与胶质瘤 WHO 分级呈正相关 (r=0.535,p<0.05), 与年龄性别无明显相关性 ( 表 2) 2.2 TRIM29 在胶质母细胞瘤组织及细胞中高表达因 TRIM29 的表达与 WHO 分级呈显著正相关, 故选取胶质母细胞瘤 (Ⅳ 级 ) 组织及其细胞株作为研究对象 Westernblot 检测结果显示, 相较于癌旁组织及正常组织,TRIM29 在胶质母细胞瘤组织中的蛋白表达量显著增高 (P<0.05, 图 2), 同时,TRIM29 在胶质母细胞瘤细胞株 U 87MG 中的蛋白表达明显高于其他细胞株, 故选择 U 87MG 细胞用作后续研究 A:TRIM29 在胶质母细胞瘤组织 (1) 癌旁组织 (2) 及正常组织 (3) 中的表达 ;B:TRIM29 在胶质瘤细胞株中的表达 1:A172;2:LN 229;3:U 87MG;4:U 118MG 图 2 胶质瘤细胞组织及正常组织中 TRIM29 的蛋白表达 A:TRIM29 在正常脑组织中阴性表达 ;B:TRIM29 在胶质瘤细胞中阳性表达图 1 TRIM29 在正常脑组织和胶质瘤组织中的表达 (S P 200) 表 2 TRIM29 在 56 例胶质瘤标本中的表达及临床病理参数 TRIM29 表达量临床病理特征例数 P 值低表达高表达年龄 >40 岁岁性别女性男性 WHO 分级 <0.001 Ⅰ ~Ⅱ Ⅲ Ⅳ 在高表达 TRIM29 的胶质母细胞瘤细胞 U 87 MG 中敲低 TRIM29 U 87MG 细胞具有恶性程度高, 低分化, 生长稳定高的特点通过对各组 U 87MG 细胞进行 Western blot 检测, 发现 shtrim29 组细胞中 TRIM29 的蛋白表达明显低于空白对照组以及 shscramble 组 (P<0.05, 图 3) 这说明癌细胞 TRIM29 基因已被成功敲低 1: 空白对照组 ;2:shScramble 组 ;3:shTRIM29 组 A:Westernblot 检测结果 ;B:TRIM29 蛋白相对表达量 a:p<0.05, 与空白对照组 shscramble 组比较图 3 Westernblot 检测各组胶质母细胞瘤细胞 U 87MG 中 TRIM29 蛋白的表达!

963 2.4 敲低 TRIM29 对 U 87MG 细胞增殖的影响通过绘制 MTT 生长曲线, 发现敲低 TRIM29 后, 明显抑制了 U 87MG 细胞的增殖能力 (P<0.

5 TRIM29 促进 U 87MG 细胞的迁移能力采用 Transwel 迁移实验检测敲低 TRIM29 对 U 87MG 的迁移能力的影响 ( 图 5),shTRIM29 组细胞穿膜数为 (91±8), 明显低于 shscramble 组 (295±12) 及空白对照组细胞 (298±14)(P<0.

5 敲低 TRIM29 对 U 87MG 细胞增殖的影响通过绘制 MTT 生长曲线, 发现敲低 TRIM29 后, 明显抑制了 U 87MG 细胞的增殖能力 (P<0.05, 图 4A) 同时, 肿瘤克隆形成实验也发现,shTRIM29 组细胞形成的克隆数为 (106±5),shScramble 组及空白对照组细胞的克隆数分别为 (259±6) (266±5), 实验组的克隆数明显低于 shscramble 组及空白对照组 (P<0.05, 图 4B) 这表明 TRIM29 对 U 87MG 细胞的增殖起促进作用 2.5 TRIM29 促进 U 87MG 细胞的迁移能力采用 Transwel 迁移实验检测敲低 TRIM29 对 U 87MG 的迁移能力的影响 ( 图 5),shTRIM29 组细胞穿膜数为 (91±8), 明显低于 shscramble 组 (295±12) 及空白对照组细胞 (298±14)(P<0.05) 这提示 TRIM29 可促进 U 87MG 的迁移, 敲低 TRIM29 后, 肿瘤细胞的迁移能力明显减弱 2.6 TRIM29 敲低可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长裸鼠皮下成瘤实验结果显示, 接种空白对照组及 shscramble 组细胞的裸鼠, 约 10d 形成明显可见的肿瘤结节, 而接种 shtrim29 组细胞的裸鼠在 15d 左右才形成较为明显的肿瘤结节通过绘制皮下瘤体体积的生长曲线, 发现 shtrim29 组皮下瘤体的体积显著小于空白对照组及 shscramble 组 (P<0.05); 且 shscramble 组及空白对照组之间差异无统计学意义 ( 图 6A B) 为进一步验证敲低 TRIM29 对胶质母细胞瘤增殖的影响, 对取出的皮下瘤体组织进行免疫组化检测 Ki67 的表达水平, 发现 shtrim29 组皮下瘤体组织中 Ki67 表达明显降低 ( 图 6C) 这提示 shtrim29 组的增殖水平低于空白对照组与 shscramble 组 2.7 敲低 TRIM29 对 AKT 通路蛋白表达的影响 Westernblot 检测结果显示,shTRIM29 组细胞 AKT 通路中 p AKT 蛋白表达相较空白对照组与 shscramble 组细胞蛋白表达明显下调 ( 图 7) 这说明抑制 TRIM29 后胶质母细胞瘤细胞 U 87MG 生物学行为的改变, 可能通过 AKT 信号通路 )' $%& $%'!" # ' $ ( A:MTT 检测各组细胞增殖能力 ;B: 克隆形成实验结果图 4 MTT 及克隆形成实验检测 TRIM29 对 U 87MG 细胞增殖的影响 A: 空白对照组 ;B:shScramble 组 ;C:shTRIM29 组图 5 Transwel 实验检测 TRIM29 对 U 87MG 细胞迁移的影响 ( 结晶紫 100)

964 第三军医大学学报,2018,40(11) htp://aammt.tmmu.edu.cn % ' $%% &$% &%% '$% '%% $% %% $% %% $% %!" # $ % $ % $ '%!

AKT 蛋白相对表达量图 7 Westernblot 检测各组 p AKT AKT 蛋白的表达 3 讨论肿瘤的发生发展与肿瘤细胞的快速增殖以及迁移密不可分通常来说, 肿瘤细胞的增殖迁移能力越强, 其恶性程度越高发展越快然而, 细胞增殖迁移是一个十分复杂的过程, 其中涉及多种基因转录因子因此,

在乳腺癌中,TRIM29 则表现出抑癌特性, 其表达与乳腺癌的增殖恶性程度呈明显负相关 [15] 上述研究表明 TRIM29 在不同的肿瘤中, 发挥着不同的调控作用但目前在神经系统肿瘤中,TRIM29 发挥着何种作用尚不清楚本研究首先通过免疫组化检测胶质瘤患者组织以及正常脑组织中 TRIM29 的表达量, 发现

6 964 第三军医大学学报,2018,40(11) htp://aammt.tmmu.edu.cn % ' $%% &$% &%% '$% '%% $% %% $% %% $% %!" # $ % $ % $ '%! # A: 各组裸鼠皮下瘤体大体观 ;B: 各组皮下瘤体体积变化曲线 ;C: 免疫组化检测各组移植瘤体中 Ki67 的表达 (S P 200) 图 6 TRIM29 对裸鼠皮下移植瘤生长的影响 1: 空白对照组 ;2:shScramble 组 ;3:shTRIM29 组 A:Westernblot 检测结果 ;B: 各组 p AKT 蛋白相对表达量图 7 Westernblot 检测各组 p AKT AKT 蛋白的表达 3 讨论肿瘤的发生发展与肿瘤细胞的快速增殖以及迁移密不可分通常来说, 肿瘤细胞的增殖迁移能力越强, 其恶性程度越高发展越快然而, 细胞增殖迁移是一个十分复杂的过程, 其中涉及多种基因转录因子因此, 寻找调控细胞增殖及迁移的关键环节, 对于肿瘤的研究便显得十分的重要在近年的研究中, 许多 TRIM 家族中的成员逐渐以抑癌或促癌因子而被大家熟知作为该家族一员,TRIM29 同样参与了多种肿瘤的生物过程 TRIM29 目前已被发现在多种肿瘤中高表达, 成为不少进展期恶性肿瘤的标志之一 [10,12-14] 值得注意的是, 在乳腺癌中,TRIM29 则表现出抑癌特性, 其表达与乳腺癌的增殖恶性程度呈明显负相关 [15] 上述研究表明 TRIM29 在不同的肿瘤中, 发挥着不同的调控作用但目前在神经系统肿瘤中,TRIM29 发挥着何种作用尚不清楚本研究首先通过免疫组化检测胶质瘤患者组织以及正常脑组织中 TRIM29 的表达量, 发现 TRIM29 在胶质瘤组织中的表达明显高于正常脑组织此外, 通过对 56 例胶质瘤患者 TRIM29 的表达进行相关性分析, 发现 TRIM29 的高表达与胶质瘤 WHO 分级呈正相关 (P<0.05), 说明 TRIM29 与胶质瘤的发生发展有密切的关系随后, 选择高表达 TRIM29 的胶质母细胞瘤 (Ⅳ 级 ) 作为主要实验对象, 通过 Westernblot 检测发现 TRIM29 在胶质母细胞瘤组织中的表达量同样明显高于癌旁组织与正常组织, 进一步在胶质瘤细胞株中

7 965 检测发现在低分化细胞系胶质母细胞瘤细胞 U 87MG 中 TRIM29 的蛋白表达最高, 故选取 U 87MG 进行后续实验接下来利用慢病毒载体感染 U 87MG 胶质母细胞瘤细胞, 成功构建了 TRIM29 敲低的 (shtrim29) U 87MG 细胞株通过 MTT 实验软琼脂克隆形成实验以及裸鼠皮下成瘤实验, 结果表明与 shscramble 组 ( 阴性对照组 ) 及空白对照组相比,shTRIM29 组的细胞增殖能力明显受到抑制, 表明下调 TRIM29 可抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖能力同时通过 Transwel 实验证明下调 TRIM29 可明显降低胶质母细胞瘤细胞的迁移能力 Akt 是一种丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶, 与细胞生长增殖有关研究表明 Akt 是 P13K/AKT 信号通路的关键调控因子, 在特定情况下, 可以被细胞因子生长因子等多种因素激活, 参与细胞的增殖恶变迁移等多种生物学反应, 与肿瘤的发生密切相关 [16] 目前已知胶质母细胞瘤常伴有 AKT 表达的升高, 本实验通过 Westernblot 检测结果显示, 在胶质母细胞瘤细胞 U 87MG 中敲低 TRIM29 可抑制 AKT 活化形式 p AKT 的表达, 为解释敲低 TRIM29 可抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖和迁移提供了一定的理论依据, 提示 TRIM29 可能通过调控 AKT 通路在胶质母细胞瘤中发挥促癌作用, 但 TRIM29 在胶质母细胞瘤中具体如何调控 AKT 仍有待进一步探索本研究探讨了 TRIM29 表达水平的高低与胶质瘤恶性程度的关系, 结果表明 TRIM29 的高表达与胶质瘤级别呈正相关此外,TRIM29 在胶质母细胞瘤中表达增高, 敲低 TRIM29 可明显抑制 U 87MG 细胞的增殖迁移能力, 且可抑制 p AKT 蛋白的表达, 提示 TRIM29 在胶质母细胞瘤中发挥促癌基因的作用, 为临床治疗胶质母细胞瘤提供了新的靶标参考文献 : [1]RIDDICKG,FINEHA.Integrationandanalysisofgenome scaledatafrom gliomas[j].natrevneurol,2011,7(8): DOI: /nrneurol [2] MEYER M A.Malignantgliomasinadults[J].N EnglJ Med,2008,359(17):1850;authorreply1850.DOI: /NEJMc [3] KIM E,KIM M,WOODH,etal.PhosphorylationofEZH2 activatesstat3signalingviastat3methylationandpro motestumorigenicity ofglioblastoma stem like cels[j]. CancerCel,2013,23(6): DOI: /j. ccr [4] DAGOGO JACK I,SHAW A T.Tumourheterogeneityand resistancetocancertherapies[j]. NatRevClin Oncol, 2018,15(2):81-94.DOI: /nrclinonc [5] KIMURA T,JIA J,KUMAR S,etal.DedicatedSNAREs andspecializedtrim cargoreceptorsmediatesecretoryauto phagy[j].embo J,2017,36(1):42-60.DOI: /embj [6] SATO T,TAKAHASHIH,HATAKEYAMA S,etal.The TRIM FLMNproteinTRIM45directlyinteractswithRACK1 andnegativelyregulatespkc mediatedsignalingpathway[j]. Oncogene,2015,34(10): DOI: / onc [7]UCHILPD,HINZA,SIEGELS,etal.TRIMprotein mediated regulationofinflammatoryandinnateimmunesignalingandits asociationwithantiretroviralactivity[j].jvirol,2013,87 (1): DOI: /JVI [8] LOEDIGEI,GAIDATZISD,SACKR,etal.Themammalian TRIM NHLproteinTRIM71/LIN 41isarepresorofmRNA function[j].nucleicacidsres,2013,41(1): DOI: /nar/gks1032. [9] MANDELLM A,KIMURAT,JAINA,etal.TRIMproteins regulateautophagy:trim5isaselectiveautophagyreceptor mediatinghiv 1restriction[J].Autophagy,2014,10(12): DOI: / [10] KOSAKAY,INOUE H, OHMACHIT, etal. Tripartite motif containing29(trim29)isanovelmarkerforlymph nodemetastasisingastriccancer[j].annsurgoncol,2007, 14(9): DOI: /s [11] KANNOY,WATANABEM,KIMURAT,etal.TRIM29 asanovelprostatebasalcelmarkerfordiagnosisofprostate cancer[j].actahistochem,2014,116(5): DOI: /j.acthis [12]JIANGT,TANGHM,LUS,etal.Up regulationoftripar titemotif containing29promotescancercelproliferationand predictspoorsurvivalincolorectalcancer[j].medoncol, 2013,30(4):715.DOI: /s [13]TANGZP,DONGQZ,CUIQZ,etal.Ataxia telangiec tasiagroupd complementinggene(atdc)promoteslung cancercelproliferationbyactivatingnf κbpathway[j]. PLoSONE,2013,8(6):e63676.DOI: /journal. pone [14]LAIW,ZHAO J,ZHANG C,etal.Upregulatedataxia telangiectasiagroupd complementinggenecorelateswith poorprognosisinpatientswithesophagealsquamouscelcar cinoma[j].disesophagus,2013,26(8): DOI: /j x. [15] AIL,KIM W J,ALPAY M,etal.TRIM29suppreses TWIST1andinvasivebreastcancerbehavior[J].Cancer Res,2014,74(17): DOI: / CAN [16] STEGEMANH,SPAN P N, KAANDERS JH, etal. ImprovingchemoradiationeficacybyPI3 K/AKTinhibition [J].CancerTreatRev,2014,40(10): DOI: /j.ctrv ( 收稿 : ; 修回 : ) ( 编辑王小寒 )

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot