戴素丽

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晤四弘
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1 1282 中国肿瘤生物治疗杂志 Chin J Cancer Biother, Dec. 2018, Vol. 25, No. 12 DOI: /j.issn x 临床研究非小细胞肺癌组织中高表达的 mir-1269 对肺癌细胞 A549 生物学行为的影响戴素丽 1, 白函瑜 1, 王耀杰 1, 魏思思 1, 陈亮 2, 张璁 1, 赵连梅 1, 单保恩 1 (1. 河北医科大学第四医院科研中心, 河北石家庄 ;2. 沧州市中心医院乳腺甲状腺外科, 河北沧州 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨 mir-1269 在非小细胞肺癌 (non-small-cell lung cancer, NSCLC) 组织中的表达和对人 NSCLC A549 细胞生物学特性的影响及其作用机制方法 : 选取 2017 年 1 月至 2018 年 1 月在河北医科大学第四医院胸外科进行首次手术切除的 34 例新鲜 NSCLC 癌组织及相应的癌旁组织, 应用 qrt-pcr 检测 NSCLC 癌组织及相应的癌旁组织中 mir-1269 的表达水平将 mir-1269 mimics 和 mimics NC 转染至 A549 细胞后, 应用 MTS 实验细胞划痕实验和 Transwell 实验检测 A549 细胞增殖迁移和侵袭能力, 流式细胞术检测其细胞周期的变化生物信息学软件预测 mir-1269 的靶基因, 并通过 Western blotting 和双荧光素酶报告基因实验验证 mir-1269 对靶基因的调控作用采用 Western blotting 检测已转染的 A549 细胞的细胞周期依赖性激酶抑制剂 p21 细胞周期蛋白 D2 以及上皮 - 间质转化 (epithelial-mesenchymal transition,emt) 相关蛋白 ZEB2 和 E-cadherin 的表达情况结果 :NSCLC 癌组织中 mir-1269 的表达水平显著高于对应的癌旁组织 (2.81±2.27 vs 1.61±1.36,P<0.05) mir-1269 mimics 转染组 A549 细胞的增殖迁移和侵袭能力显著高于空白对照组和 mimics NC 转染组 ( 均 P<0.01) 转染 mir-1269-mimics 的 A549 细胞 S 期细胞比例明显高于 mimics NC 转染组 [(46.54±1.57)% vs(23.32±3.15)%,p<0.01] mir-1269 可与 FOXO1 基因 3 端非翻译区的结合位点相结合, 且过表达 mir-1269 后,A549 细胞中 FOXO1 的表达水平及荧光素酶报告基因的活性均明显降低 ( 均 P<0.01) mir-1269 mimics 转染组 A549 细胞中 p21 E-cadherin 蛋白表达水平降低 ( 均 P<0.05), 而 CyclinD2 ZEB2 蛋白表达水平升高 ( 均 P< 0.05) 结论:miR-1269 在 NSCLC 组织中表达上调, 并且能够促进 A549 细胞的增殖迁移侵袭能力和影响细胞周期进程 ; 其作用机制可能与靶向调控抑癌基因 FOXO1 的表达有关 [ 关键词 ] 非小细胞肺癌 ;A549 细胞 ;mir-1269;foxo1; 增殖 ; 周期 ; 迁移 ; 侵袭 [ 中图分类号 ] R730.51;R734.2 [ 文献标识码 ] A [ 文章编号 ] X(2018) Effect of high expression of mir-1269 in non-small cell lung cancer tissues on biological characteristics of lung cancer A549 cells DAI Suli 1, BAI Hanyu 1, WANG Yaojie 1, WEI Sisi 1, CHEN Liang 2, ZHANG Cong 1, ZHAO Lianmei 1, SHAN Baoen 1 (1. Research Center, Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang , Hebei, China; 2. Department of Breast and Thyroid Surgery, Central Hospital of Cangzhou City, Cangzhou , Hebei, China) [Abstract] Objective: To investigate the expression of mir-1269 in non-small-cell lung cancer (NSCLC) tissues, and to explore its effect on the cellular biological characteristics of NSCLC A549 cells and the underlying mechanism. Methods: 34 pairs of NSCLC tissues and the corresponding adjacent para-cancerous tissues obtained from the patients, who underwent surgery in the Department of Breast Surgery, the Fourth Hospital of Hebei Medical University from Jan to Jan. 2018, were collected for this study. The expression level of mir-1269 in above tissue specimens was examined by real-time fluorescent quantitative PCR. After transfection with mir mimics and mimics NC (negative control), the proliferation, migration and invasion of A549 cells were detected by MTS, Wound healing and Transwell assay, respectively; and the changes in cell cycle distribution of A549 cells were examined by flow cytometry. The bioinformatics tool was used to predict the possible target gene of mir-1269, and the regulation effect of mir-1269 on target gene was then validated by Western blotting and Dual-luciferase reporter assay. In the meanwhile, the protein expressions of cyclin depen- [ 基金项目 ] 河北省科技计划基金资助项目 ( No ); 河北省财政支撑资助项目 (No ) Project supported by the Science and Technology Project Foundation of Hebei Province (No ), and the Financial Fundation of Hebei Province (No ) [ 作者简介 ] 戴素丽 (1989-) 女, 硕士, 研究实习员, 主要从事肿瘤分子生物学的基础研究, dslfighting@163.com [ 通信作者 ] 单保恩 (SHAN Baoen,corresponding author), 博士, 教授, 博士生导师, 主要从事肿瘤免疫学基因诊断抗肿瘤中药及肿瘤生物治疗的研究, shanbaoen@163.com

2 戴素丽, 等. 非小细胞肺癌组织中高表达的 mir-1269 对肺癌细胞 A549 生物学行为的影响 1283 dent kinase inhibitor p21, Cyclin D2, and EMT-related proteins (E-cadherin and ZEB2) in the transfected A549 cells were measured by Western blotting. Results: The expression level of mir-1269 in NSCLC tissues was significantly higher than that in paracancerous tissues (2.81±2.27 vs 1.61±1.36, P<0.05). The capacities of proliferation, migration and invasion of A549 cells in mir-1269 mimics transfection group were significantly higher than those in mimics NC group and blank control group (all P<0.01). And the cell proportion at S-phase in mir-1269-mimics group was obviously higher than that in mimics NC group [(46.54±1.57)% vs (23.32±3.15)%,P<0.01]. Bioinformatics analysis showed that mir-1269 could combine with 3 UTR of FOXO1 gene. After transfection with mir-1269 mimics, the expression level and luciferase activity of FOXO1 protein in A549 cells were significantly reduced (all P<0.01). Moreover, the protein expressions of p21 and E-cadherin were significantly decreased after over-expression of mir-1269 (all P<0.05), while the expressions of ZEB2 and Cyclin D2 were up-regulated (all P<0.05). Conclusion: The expression level of mir-1269 in NSCLC tissues was significantly increased, and it could enhance the proliferation, cell cycle progression, migration and invasion of A549 cells. The possible mechanism may be related to its targeted regulation of FOXO1. [Key words] non-small cell lung cancer (NSCLC); A549 cell; mir-1269; FOXO1; proliferation; cell cycle; migration; invasion [Chin J Cancer Biother, 2018, 25(12): DOI: /j.issn X ] 肺癌是临床最常见的恶性肿瘤之一, 在世界范 [1] 围内, 其发病率和病死率均居癌症首位肺癌根据病理类型的不同可分为非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer,nsclc) 和小细胞肺癌 (small cell lung cancer,sclc), 其中 NSCLC 约占 80% [2] 由于肺癌发病隐匿, 多数患者就诊时已是中晚期, 错过最佳治疗时机目前, 尽管对肺癌的诊断治疗和发病机制等方面的研究取得了较大进展, 但肺癌患者的长期生存并不乐观, 总体 5 年生存率不足 15% [3] 肺癌的发生发展是多基因改变共同作用的结果, 基因调控网络中的 micrornas(mirnas) 通过直接降解靶 mrna 或抑制其翻译, 从而调控肿瘤细胞的增殖迁 [4-5] 移血管形成等生物学过程近年来, 有关 mirna 与肺癌特别是 NSCLC 发生发展诊断治疗的关系备 [6] 受关注在临床肿瘤诊治中,miRNA 可以辅助肺癌 [7] [8-9] 的病理分型, 同时也可以作为诊断标志物, 还可 [10-11] [12] 以作为判断肺癌患者的预后指标 BU 等报道, 在晚期结直肠癌组织中 mir-1269 呈过表达状态, 与 mir-1269 低表达的患者相比, 高表达 mir-1269 的中晚期结直肠癌患者有较高的复发率和术后转移率进一步的荧光素酶报告基因实验证实,miR-1269 通过靶向 Smad7 和 HOXD10 来促进结直肠癌细胞的 [13-14] 迁移和侵袭能力有研究报道,miR-1269 的表达异常与肝癌的发生有关高表达 mir-1269 与肝癌患者的远处转移临床分期和肿瘤大小 [14-15] 呈正相关体外研究发现,miR-1269 通过与抑癌基因 FOXO1 和 SOX6 的 3 UTR 区结合, 从而促进肝癌细胞的增殖和克隆形成能力 FOXO1 转录因子是 FOX 家族中 FOXO 亚家族的重要成员, 作为一种肿瘤抑制因子,FOXO1 的表达在多种癌症中均受到 [16] mirna 的调控然而, 在肺癌中 mir 与 FOXO1 之间是否存在调控关系尚未见报道本研究首先在 NSCLC 组织中检测了 mir-1269 的表达情况及其对 NSCLC A549 细胞生物学特性的影响, 并进一步探讨了 mir-1269 对 FOXO1 基因表达的调控作用, 为 NSCLC 早诊早治和预后判定提供参考 1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂人肺癌细胞株 A549 来自于河北医科大学第四医院科研中心 RPMI 1640 培养基胰蛋白酶购自美国 Gibco 公司, 胎牛血清购自 Biological Industries (BI) 公司,TRIzol 购自美国 Invitrogen 公司,Platinum SYBR SuperMix 试剂 MTS 细胞增殖分析试剂盒均购自美国 Promega 公司,PCR 引物和 Lipofectamine TM 2000 转染试剂均购自美国 Invitrogen 公司, 逆转录试剂盒和 BCA 蛋白定量检测试剂盒购自美国 Thermo 公司,RIPA 细胞裂解液购自北京索莱宝生物科技有限公司,miR-1269-mimics 购自苏州吉玛基因公司, Transwell 小室 ( 孔径 3.0 µm) 购自美国 Corning 公司, Matrigel 购自美国 BD 公司, 结晶紫染液购自碧云天生物技术有限公司, 细胞周期试剂盒购自联科生物技术股份有限公司, 兔抗人 FOXO1 Cyclin D2 p21 ZEB2 E-cadherin 和 GAPDH 抗体购自美国 Proteintech 公司,DyLight TM 800 标记的羊抗兔 IgG 荧光二抗购自美国 Rockland 公司 1.2 组织标本的收集收集 2017 年 1 月至 2018 年 1 月在河北医科大学第四医院胸外科进行首次手术切除的 34 例新鲜 NSCLC 组织 ( 避开肿瘤出血和坏死部位 ) 及其相应的癌旁组织 ( 距癌组织边缘 5 cm) 所有标本均经手术后病理检查确诊为 NSCLC 于病案室收集患者姓名性别年龄手术记录病理号码病理报告吸烟史等临床资料 34 例患者中, 男性 30 例, 女性 4 例 ; 年龄 (48~79) 岁, 中位年龄 63 岁 ; 按照国际抗癌联盟推出的第八版肺癌 TNM 分期标准进行分期 :Ⅰ 期 3

3 1284 例,Ⅱ 期 11 例,Ⅲ 期 18 例,Ⅳ 期 2 例 ; 高分化者 25 例, 低分化者 9 例 ; 肿瘤直径 <5 cm 者 19 例, 肿瘤直径 5 cm 者 15 例 ; 有淋巴结转移者 23 例, 无淋巴结转移者 11 例 ; 有吸烟史者 26 例, 无吸烟史者 8 例所有患者均无其他重大基础疾病史, 手术前均未进行放化疗和免疫治疗本研究获得医院伦理委员会的批准, 所用的标本均得到患者的知情同意 1.3 细胞培养及转染将 A549 细胞置于含 10% 胎牛血清 100 U/ml 青霉素和 100 µg/ml 链霉素的 RPMI 1640 培养基, 在 37 CO 2 体积分数为 5% 的培养箱中培养取对数生长期的细胞进行实验, 转染前 1 d 将 A549 细胞接种到 6 孔板中, 待细胞汇合度为 60%~70% 时按 Lipofectamine 2000 转染试剂说明书操作实验分为 3 组 : 过表达阴性对照组 (mir-1269-mimics NC) 过表达组 (mir-1269-mimics) 和空白对照组转染时, 各组片段的终浓度均为 100 nmol/l 转染 6 h 后, 换为正常的完全培养液继续培养 h, 然后用于后续实验 1.4 qrt-pcr 实验检测 NSCLC 癌组织及其癌旁组织中 mir-1269 的表达水平用 TRIzol 试剂提取冰冻的 NSCLC 组织和相应癌旁组织的总 RNA, 紫外分光光度计检测 RNA 的纯度和浓度取 2 µg 总 RNA 利用逆转录试剂盒合成 cdna( 逆转录条件 :42 60 min,72 15 min) 以此 cdna 为模板进行 qrt-pcr 扩增 qrt-pcr 反应条件 :95 5 min,95 15 s,60 30 s,72 30 s, 共 40 个循环以 2 -ΔΔCt 值表示 mir-1269 的相对表达水平, 其值 >1 表示 mir-1269 的表达水平上调, 其值 1 表示 mir-1269 的表达水平下调以 U6 为内参, 引物序列 mir-1269 为 F:5 -GCTGGACTGAGCCGT- GC-3,R:5 -CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3 ;U6 为 F:5 - GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3,R: 5 - GGCTGAGAACTGAATTCCA - 3 实验重复 3 次 1.5 MTS 实验检测 mir-1269 对 A549 细胞增殖能力的影响接种转染后的各组细胞于 96 孔板中 ( / 孔 ), 每组设 6 个复孔细胞继续培养和 96 h, 加入 MTS 试剂 (500 μg/ml 10 µl/ 孔 ), 置于 37 反应 2.5 h, 采用酶联免疫检测仪检测 492 nm 波长处各孔的光密度 (D) 值以时间为横坐标,D 值为纵坐标绘制细胞生长曲线实验重复 3 次 1.6 流式细胞术检测 mir-1269 对 A549 细胞周期的影响用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化转染 24 h 后的各中国肿瘤生物治疗杂志, 2018, 25(12) 组细胞, 离心弃上清用 PBS 洗涤 1 次,DNA staining solution 和 10 µl Permeabilization solution, 涡旋震荡 5~10 s 混匀室温避光孵育 30 min 后上机检测实验重复 3 次 1.7 划痕实验检测 mir-1269 对 A549 细胞平面迁移能力的影响细胞转染 24 h 后, 用 200 µl 无菌的加样枪头在每孔单层细胞上轻轻划痕, 建立细胞划痕模型沿划痕边缘等距离间隔做上标记, 以便后续检测划痕后用 PBS 轻轻冲洗细胞 3 次, 更换为无牛血清的 RPMI 1640 培养基继续培养于划痕 h 后在倒置显微镜下观察划痕愈合程度并拍照测量划痕中间的距离, 并与 0 h 的划痕距离相比, 计算划痕间距缩小的百分率, 以此反映细胞的平面迁移能力实验重复 3 次 1.8 Transwell 小室实验检测 mir-1269 对 A549 细胞迁移和侵袭能力的影响收集转染后的各组细胞, 悬浮于无血清的 RPMI 1640 培养液中, 计数细胞将 Transwell 小室置于无菌 24 孔板中, 将各组细胞分别加入 Transwell 小室的上室 ( 个 / 小室 ), 下室加入 600 µl 含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培养液, 继续培养细胞 24 h 取出 Transwell 小室, 用棉签小心擦净上室面的细胞, 用 4% 多聚甲醛溶液于常温下固定 30 min, 风干后结晶紫染色 20 min, 自来水清洗后于倒置相差显微镜下观察并拍照 ( 200), 随机观察 5 个视野, 计数穿膜细胞数将置于 4 溶解过夜的 Matrigel 用无血清 RPMI 1640 培养液按 1 7 的体积比例进行稀释 Transwell 小室置于无菌 24 孔板中, 向小室中加入 20 µl Matrigel, 快速晃动, 使其均匀铺满小室底面待 Matrigel 凝固后, 其他操作按细胞迁移实验进行检测继续培养 48 h 后的细胞的侵袭能力实验重复 3 次 1.9 Western blotting 检测 mir-1269 靶基因的表达水平收集转染后的各组细胞, 应用 RIPA 裂解液提取各组细胞的总蛋白质 BCA 法进行蛋白质定量取 60 μg/ 孔进行 12% SDS-PAGE, 将电泳分离后的蛋白转移到 PVDF 膜上, 用含 5% 脱脂奶粉的封闭液在室温下封闭 1 h, 加入兔抗人 FOXO1( 体积稀释比例为 ) 和兔抗人 GAPDH 抗体 ( 内参照, 体积稀释比例为 ),4 反应过夜 ; 加入 DyLight TM 800 标记的羊抗兔 IgG 荧光二抗 ( 体积稀释比例为 ), 室温反应 1 h 用 Odyssey 红外荧光成像仪进行扫描, 以目的蛋白条带的灰度值 / 内参照蛋白条带的灰度值作为目的蛋白的相对表达水平实验重复 3 次

4 戴素丽, 等. 非小细胞肺癌组织中高表达的 mir-1269 对肺癌细胞 A549 生物学行为的影响双荧光素酶报告基因实验检测 mir-1269 对 FOXO1 基因的靶向作用由上海捷瑞生物工程有限公司合成 FOXO1 基因的 3 UTR, 并插入 pgl3-promoter 质粒载体中, 将该重组质粒命名为 pgl3-foxo1-3 UTR WT 此外, 利用定点突变将 FOXO1 基因的 3 UTR 的 mir-1269 的潜在结合部位 5'-CAGUCCA-3' 序列突变为 5'-AG- GCAAG-3', 并将该重组质粒命名为 pgl3-foxo1-3 UTR MUT 将 293T 细胞悬液计数后均匀接种于 24 孔板中, 待细胞汇合度达 60%~70% 时分别将 mir-1269-mimics mimics-nc pgl3-foxo1-3 UTR WT 或 pgl3- FOXO1-3 UTR MUT 质粒与 prl-tk 质粒共转染至每孔细胞中 ( 实验共分 4 组,pGL3-FOXO1-3 UTR WT+mimics-NC 组 pgl3-foxo1-3 UTR WT+miR mimics 组 pgl3-foxo1-3 UTR MUT+mimics- NC 组和 pgl3 - FOXO1-3 UTR MUT + mir mimics 组 ), 转染 6 h 后更换为新鲜的含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养液, 继续培养 36 h 之后按照 Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega) 试剂盒说明书进行操作, 检测各孔的荧光素酶活性相对荧光素酶活性 = 萤火虫荧光素酶活性值 / 海肾荧光素酶活性值实验重复 3 次 1.11 Western blotting 检测 mir-1269 对 p21 Cyclin D2 ZEB2 和 E-cadherin 蛋白表达的影响实验分为未转染组 NC 转染组和 mir-1269 mimics 转染组, 收集转染 60 h 后的各组细胞应用 RI- PA 裂解液提取各组细胞的总蛋白质 BCA 法进行蛋白质定量取 60 μg/ 孔进行 10% SDS-PAGE, 将电泳分离后的蛋白转移到 PVDF 膜上, 用含 5% 脱脂奶粉的封闭液在室温下封闭 1 h, 加入兔抗人 p21 (1 500) Cyclin D2(1 500) E-cadherin( ) ZEB2( ) 抗体和 GAPDH( ) 抗体,4 反应过夜 ; 加入 DyLight TM 800 标记的羊抗兔 IgG 荧光二抗 ( 体积稀释比例为 ), 室温反应 1 h 用 Odyssey 红外荧光成像仪进行扫描, 以目的蛋白条带的灰度值 / 内参照蛋白条带的灰度值作为目的蛋白的相对表达水平实验重复 3 次 1.12 统计学处理采用 SPSS13.0 统计学软件, 计量资料以 xˉ±s 表示, 两组间比较采用 t 检验, 多组间均数比较采用单因素方差分析, 组内两两比较采用 SNK-q 检验以 P<0.05 或 P<0.01 表示差异有统计学意义 2 结果 2.1 mir-1269 在 NSCLC 癌组织中的表达水平明显上调 qrt-pcr 检测结果 ( 图 1) 显示,NSCLC 癌组织 mir-1269 的表达水平明显高于对应的癌旁组织 (2.81±2.27 vs 1.61±1.36,P<0.05) * P<0.05 图 1 NSCLC 癌组织及对应癌旁组织中 mir-1269 的表达水平 Fig.1 Expression level of mir-1269 in NSCLC tissues and corresponding adjacent tissues 2.2 转染 mir-1269-mimics 后 A549 细胞中 mir-1269 的表达水平升高转染 mir-1269-mimics 和 mir-1269-mimics NC 后,qRT-PCR 法检测结果 ( 图 2) 显示,miR mimics 转染组 A549 细胞中 mir-1269 的表达水平明显高于空白对照组和 NC 转染组 (238.60±10.36 vs 1.00± ±0.08, 均 P<0.01); 而空白对照组表达水平与 NC 组比较无明显差异 (P>0.05) P<0.01 vs Ctrl or Mimics NC group 图 2 qrt-pcr 法检测 mir-1269-mimics 的转染效率 Fig. 2 The transfection efficiency of mir-1269-mimics was detected by qrt-pcr 2.3 过表达 mir-1269 提高 A549 细胞的体外增殖能力 MTS 实验检测结果 ( 图 3) 显示, 转染 mir mimics 组 A549 细胞的增殖能力明显高于 mir mimics NC 组和空白对照组 ( 均 P<0.01), 而空白对照组与 NC 组 A549 细胞增殖能力无明显差异 (P> 0.05)

1286 中国肿瘤生物治疗杂志, 2018, 25(12) 2.4 过表达 mir-1269 影响 A549 细胞周期进程流式细胞术检测结果 ( 图 4) 显示, 转染 mir- 1269-mimics 组 S 期细胞比例明显高于 mimics NC 转染组 [(46.54±1.57)% vs(23.32±3.15)%,p<0.

5 1286 中国肿瘤生物治疗杂志, 2018, 25(12) 2.4 过表达 mir-1269 影响 A549 细胞周期进程流式细胞术检测结果 ( 图 4) 显示, 转染 mir mimics 组 S 期细胞比例明显高于 mimics NC 转染组 [(46.54±1.57)% vs(23.32±3.15)%,p<0.01],g0/ G1 期细胞百分比明显低于 mimics NC 转染组 [(28.72±3.15)% vs(51.59±3.03)%,p<0.01], 而 G2/M 期细胞比例没有明显变化 2.5 过表达 mir-1269 提高 A549 细胞划痕愈合能力细胞划痕实验结果 ( 图 5) 显示, 转染 mir mimics 组 A549 细胞的划痕愈合能力明显高于空白对照组和 mimics NC 转染组 [(62.17 ± 3.19)% vs (37.17±1.74)% (42.62±2.72)%, 均 P<0.01], 而空白对照组与 mimics NC 转染组比较无明显差异 (P>0.05) 2.6 过表达 mir-1269 提高 A549 细胞迁移和侵袭能力 Transwell 细胞迁移实验结果 ( 图 6) 显示, 转染 mir-1269-mimics 组 A549 细胞穿过 Transwell 小室基底膜的细胞数明显高于空白对照组和 mimics NC 转染组 [(217.67±14.15) vs (83.33±12.50) (80.67±5.50) 个, 均 P<0.01], 而空白对照组与 mimics NC 组比较无明显差异 (P>0.05) Transwell 细胞侵袭实验结果显示, 转染 mir-1269-mimics 组 A549 细胞的侵袭能力明显高于空白对照组和 mimics NC 转染组 [(178.67± 3.79) vs (60.00±6.24) (58.00±5.57) 个, 均 P<0.01] P<0.01 vs Ctrl or Mimics NC group 图 3 过表达 mir-1269 对 A549 细胞增殖能力的影响 Fig.3 Effect of mir-1269 over-expression on proliferation of A549 cells A: Effect of mir-1269 mimics transfection on cell cycle of A549 cells; B: Statistical histograms of cell cycle 图 4 过表达 mir-1269 对 A549 细胞周期的影响 Fig.4 Effect of mir-1269 over-expression on A549 cells cycle P<0.01 图 5 过表达 mir-1269 对 A549 细胞划痕愈合能力的影响 Fig. 5 Effect of mir-1269 over-expression on A549 cells wound closure ability

戴素丽, 等. 非小细胞肺癌组织中高表达的 mir-1269 对肺癌细胞 A549 生物学行为的影响 1287 P<0.01 图 6 过表达 mir-1269 对 A549 细胞迁移和侵袭能力的影响 ( 200) Fig.6 Effect of mir-1269 over-expression on migration and invasion of A549 cells ( 200) 2.

de/) 预测 mir-1269 靶基因, 最后选取 FOXO1 基因为研究对象生物信息学分析软件结果 ( 图 7A) 显示,FOXO1 基因 3 UTR 上存在 mir-1269 的潜在结合位点在 A549 细胞中转染 mir-1269-mimics 后,Western blotting 检测结果 ( 图 7B) 显示, 转染 mir-1269-mimics 组 A549 细胞 FOXO1

6 戴素丽, 等. 非小细胞肺癌组织中高表达的 mir-1269 对肺癌细胞 A549 生物学行为的影响 1287 P<0.01 图 6 过表达 mir-1269 对 A549 细胞迁移和侵袭能力的影响 ( 200) Fig.6 Effect of mir-1269 over-expression on migration and invasion of A549 cells ( 200) 2.7 mir-1269 靶向作用于 FOXO1 基因生物信息学网站 (TargetScan: targetscan. org/ vert_72/; mirdb: org/; PicTar: 预测 mir-1269 靶基因, 最后选取 FOXO1 基因为研究对象生物信息学分析软件结果 ( 图 7A) 显示,FOXO1 基因 3 UTR 上存在 mir-1269 的潜在结合位点在 A549 细胞中转染 mir-1269-mimics 后,Western blotting 检测结果 ( 图 7B) 显示, 转染 mir-1269-mimics 组 A549 细胞 FOXO1 蛋白的表达水平明显低于空白对照组和 mimics NC 转染组 (0.34 ± 0.06 vs 1.00 ± ± 0.08, 均 P<0.01) 双荧光素酶报告基因分析结果( 图 7C) 显示,miR-1269 转染组 FOXO1 的相对荧光强度显著低于 mimics NC 转染组 (P<0.01), 而 FOXO1 3 UTR 中的 mir-1269 结合位点发生突变后,miR-1269 转染组和 mimics NC 转染组的相对荧光强度无明显差异 (P>0.05), 表明 mir-1269 过表达对报告基因的抑制作用消除 P<0.01 A: The wild FOXO1 binding sequence with mir-1269; B: Expression level of FOXO1 protein after transfection with mir-1269 mimics; C: Relative fluorescence activity by dual-luciferase reporter assay 图 7 生物信息学预测并验证 FOXO1 是 mir-1269 的作用靶点 Fig.7 Prediction and validation of FOXO1 as the target gene of mir-1269 by the bioinformatis 2.8 过表达 mir-1269 影响 A549 细胞中 p21 CyclinD2 E-cadherin 和 ZEB2 蛋白的表达水平 Western blotting 检测细胞周期依赖性激酶抑制剂 p21 细胞周期蛋白 D2 以及上皮 - 间质转化 (epithelial-mesenchymal transition,emt) 相关蛋白 ZEB2 和 E-cadherin 的表达情况, 结果 ( 图 8) 显示, 转染 mir mimics 组 A549 细胞中 p21 和 E-cadherin 蛋白表达水平低于空白对照组和 mimics NC 转染组, 而 Cyclin D2 和 ZEB2 蛋白表达水平高于空白对照组和 mimics NC 转染组 ( 均 P<0.05) 3 讨论肺癌是全世界癌症相关死亡的最常见原因, 因此探究肺癌的详细发病机制, 并寻找有效的治疗靶 [16] 点依然是当务之急近年来,miRNA 在癌症发生 [17] 发展过程中的重要作用引起了广泛关注有证据表明, 越来越多的 mirna 参与了肺癌的进展过程但关于 mir-1269 在 NSCLC 发生发展中的作用研究

1288 中国肿瘤生物治疗杂志, 2018, 25(12) 较少本研究通过对 NSCLC 患者的临床样本进行检测和分析, 发现 NSCLC 癌组织中 mir-1269 的表达水平高于配对的癌旁组织, 提示 mir-1269 可能参与了 NSCLC 的发生发展近年来, 大量的研究表明,miRNA 参与了肿瘤细胞的增殖分化转移代谢和凋亡等生物学过程在肝细胞癌中, 过表达 mir-1269

7 1288 中国肿瘤生物治疗杂志, 2018, 25(12) 较少本研究通过对 NSCLC 患者的临床样本进行检测和分析, 发现 NSCLC 癌组织中 mir-1269 的表达水平高于配对的癌旁组织, 提示 mir-1269 可能参与了 NSCLC 的发生发展近年来, 大量的研究表明,miRNA 参与了肿瘤细胞的增殖分化转移代谢和凋亡等生物学过程在肝细胞癌中, 过表达 mir-1269 可以促进肝癌细胞的增殖能力和促进肝癌细胞由 G0/G1 期向 S 期转 [13] 变本研究发现, 转染 mir-1269-mimics 后,A549 细胞的增殖活力明显增强流式细胞术检测结果显示, 过表达 mir-1269 能够促进 A549 细胞周期进程, 使 S 期细胞比例明显升高, 而 G0/G1 期细胞比例下降在结直肠癌中,miR-1269 的表达与患者的远处转移有关, 高表达 mir-1269 的患者有较差的预后 ; 在裸鼠的体内转移实验中,miR-1269 过表达组的结肠癌细胞通过盲肠注射的肝转移率为 87.5%, 通过尾静脉注射的肺转移率为 100%, 而对照组两种注射方式 [15] 均未出现转移, 说明 mir-1269 在结直肠癌的转移中发挥着重要作用本研究通过 Transwell 实验与细胞划痕愈合实验探究了 mir-1269 与肺癌细胞的迁移和侵袭之间的关系, 结果显示, 过表达 mir-1269 后, A549 细胞的划痕愈合能力和侵袭能力明显升高上述结果显示, 在 NSCLC 中 mir-1269 可能通过促进癌细胞增殖和转移来促进肺癌的恶性进展 P<0.01 vs Control or Mimics NC group 图 8 过表达 mir-1269 对 A549 细胞 p21 CyclinD2 E-cadherin 和 ZEB2 蛋白表达水平的影响 Fig.8 Effect of mir-1269 over-expression on the protein expressions of p21, CyclinD2, E-cadherin and ZEB2 in A549 cells mirna 发挥作用通常是通过调控其靶基因来实现的, 本研究通过对 mir-1269 的潜在靶基因进行预测发现 FOXO1 为其直接靶基因生物信息学软件分析显示,FOXO1 基因 3 UTR 上存在 3 个 mir-1269 的潜在结合位点 FOXO1 转录因子是 FOX 家族中 FOXO 亚家族的重要成员,FOXO1 的表达在多种癌 [16] 症中均受到 mirna 的调控在乳腺癌细胞 MCF-7 中,miR-27a mir-96 和 mir-182 共同靶向 FOXO1, 从 [19] 而促进乳腺癌细胞的生长在前列腺癌细胞中, 过表达 mir-370 能够下调 FOXO1 的表达, 从而促进癌 [20] 细胞的增殖本研究发现,NSCLC 癌细胞中过表达 mir 后,Western blotting 检测结果显示, FOXO1 的表达水平明显降低进一步通过双荧光素酶报告基因实验证明 mir-1269 能够直接与 FOXO1 的 3 UTR 结合而抑制其表达因此, 推测在肺癌中 mir-1269 可能通过靶向抑癌因子 FOXO1 来发挥促进癌细胞增殖和转移的作用作为转录因子,FOXO1 主要通过调控下游靶基因发挥抑制细胞生长和转移调控细胞周期等抑癌基因的作用在细胞核中,FOXO1 通过与靶基因的 DNA 结合区域相互作用, 进而促进 CDKN1A 和 CCND2 等基因的转录, 从而诱导癌细胞发生周期阻 [21-22] 滞, 抑制细胞生长 G1 期到 S 期转换是细胞周期中的重要转折点,CCND2 及 CDKN1A 在该过程中发挥至关重要的作用 EMT 在肿瘤的转移中发挥重要作用 FOXO1 能够参与 EMT 相关的信号通路和转 [23] 录因子的表达调控, 从而调控 EMT 过程在肝细胞癌中,FOXO1 通过抑制 ZEB2 的表达来阻止 EMT [24] 的发生, 从而抑制肝癌细胞的侵袭和转移 ZEB2 主要是通过抑制上皮性标志物 E-cadherin 的表达来 [25] 促进 EMT 的发生本研究发现, 过表达 mir-1269 能够加快细胞由 G1 期向 S 期进展, 并促进 A549 细胞的迁移能力 Western blotting 检测细胞周期及转移相关蛋白结果显示, 过表达 mir-1269 后 A549 细胞中 p21 E-cadherin 的表达均降低, 而 ZEB2 和 Cyclin D2 的表达升高, 表明 mir-1269 可能通过下调 FOXO1 的表达, 进而影响其靶基因的表达, 从而发挥促进细胞增殖和转移的作用综上,miR-1269 在 NSCLC 中高表达, 并且能够促进 NSCLC 癌细胞的增殖细胞周期进程迁移及侵袭能力, 其作用机制可能是通过靶向转录因子 FOXO1 来实现的, 提示 mir-1269 通过靶向抑制

8 戴素丽, 等. 非小细胞肺癌组织中高表达的 mir-1269 对肺癌细胞 A549 生物学行为的影响 1289 FOXO1 的表达来促进 NSCLC 的恶性进展, 本研究为进一步探索 mir-1269 在 NSCLC 进展过程中的作用机制提供了实验基础 [ 参考文献 ] [1] BRAY F, FERLAY J, SOERJOMATARAM I, et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[j]. CA Cancer J Clin, 2018, 29(7): DOI: /caac [2] JEMAL A, BRAY F, CENTER M M, et al. Global cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2): DOI: / caac [3] BERGHMANS T, PASLEAU F, PAESMANS M, et al. Surrogate markers predicting overall survival for lung cancer: ELCWP recomm endations[j]. Eur Respir J, 2012, 39(1): DOI: / [4] BARTEL D P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions [J]. Cell, 2009, 136(2): DOI: /j.cell [5] PASQUINELLI A E. MicroRNAs and their targets: recognition, regulation and an emerging reciprocal relationship[j]. Nat Rev Genet, 2012, 13(4): DOI: /nrg3162. [6] ZHANG Y, YANG Q, WANG S. MicroRNAs: a new key in lung cancer[j]. Cancer Chemother Pharmacol, 2014, 74(6): DOI: /s [7] DEL VESCOVO V, CANTALONI C, CUCINO A, et al. mir-205 expression levels in nonsmall cell lung cancer do not always distinguish adenocarcinomas from squamous cell carcinomas[j]. Am J Surg Pathol, 2011, 35(2): DOI: /PAS.0b013e [8] DEL VESCOVO V, GRASSO M, BARBARESCHI M, et al. MicroRNAs as lung cancer biomarkers[j]. World J Clin Oncol, 2014, 5 (4): DOI: /wjco. v5.i [9] SOLOMIDES C C, EVANS B J, NAVENOT J M, et al. MicroRNA profiling in lung cancer reveals new molecular markers for diagnosis[j]. Acta Cytol, 2012, 56(6): DOI: / [10] CHEN G, UMELO I A, LV S, et al. mir-146a inhibits cell growth, cell migration and induces apoptosis in non-small cell lung cancer cells[j / OL]. PLoS One, 2013, 8(3): e60317[ ]. DOI: / journal.pone [11] RANADE A R, CHERBA D, SRIDHAR S, et al. MicroRNA 92a-2: a biomarker predictive for chemoresistance and prognostic for survival in patients with small cell lung cancer[j]. J Thorac Oncol, 2010, 5(8): DOI: / JTO. 0b013 e3181d ea6be. [12] BU P, WANG L, CHEN K Y, et al. mir-1269 promotes metastasis and forms a positive feedback loop with TGF-β[J/OL]. Nat Commun, 2015, 6: 6879[ ]. ncbi. nlm. nih. gov / pmc/articles/pmc /.doi: /ncom ms7879. [13] GAN T Q, TANG R X, HE R Q, et al. Upregulated mir-1269 in hepatocellular carcinoma and its clinical significance[j]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(1): [14] XIONG G, WANG Y, DING Q, et al. Hsa-mir-1269 genetic variant contributes to hepatocellular carcinoma susceptibility through affecting SOX6[J]. Am J Transl Res, 2015, 7(10): [15] YANG X W, SHEN G Z, CAO L Q, et al. MicroRNA-1269 promotes proliferation in human hepatocellular carcinoma via downregulation of FOXO1[J/OL]. BMC Cancer, 2014, 14: 909[ ]. ncbi. nlm. nih. gov / pmc / articles / PMC /. DOI: / [16] LI C, ZHANG K, CHEN J, et al. MicroRNAs as regulators and mediators of forkhead box transcription factors function in human cancers[j]. Oncotarget, 2017, 8(7): DOI: /oncotarget [17] WONG M S, LAO X Q, HO K F, et al. Incidence and mortality of lung cancer: global trends and association with socioeconomic status[j]. Sci Rep, 2017, 7(1): DOI: /s [18] UDDIN A, CHAKRABORTY S. Role of mirnas in lung cancer [J]. J Cell Physiol, 2018, 9 (2): DOI: /jcp [19] GUTTILLA I K, WHITE B A. Coordinate regulation of FOXO1 by mir-27a, mir-96, and mir-182 in breast cancer cells[j]. J Biol Chem, 2009, 284(35): DOI: /jbc.M [20] WU Z, SUN H, ZENG W, et al. Upregulation of MircoRNA-370 induces proliferation in human prostate cancer cells by downregulating the transcription factor FOXO1[J/ OL]. PLoS One, 2012, 7(9): e45825[ ]. ncbi. nlm. nih. gov / pmc / articles / PMC /. DOI: /journal.pone [21] KATOH M, IGARASHI M, FUKUDA H, et al. Cancer genetics and genomics of human FOX family genes[j]. Cancer Lett, 2013, 328 (2): DOI: /j.canlet [22] 周欣亮, 吴昊, 李丹, 等. mir-133a-3p 在胃癌组织和血浆中的表达及其对胃癌细胞增殖的影响 [J]. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2018, 25(6): DOI: /j.issn X [23] MA Z, XIN Z, HU W, et al. Forkhead BOX-O proteins: Crucial regulators of cancer EMT[J]. Semin Cancer Biol, 2018, 50(1): DOI: /j.semcancer [24] DONG T, ZHANG Y, CHEN Y, et al. FOXO1 inhibits the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma by reversing ZEB2-induced epithelial-mesenchymal transition[j]. Oncotarget, 2017, 8(1): DOI: / oncotarget [25] SÁNCHEZ-TILLÓ E, LIU Y, DE BARRIOS O, et al. EMT-activating transcription factors in cancer: beyond EMT and tumor invasiveness[j]. Cell Mol Life Sci, 2012, 69(20): DOI: / s [ 收稿日期 ] [ 修回日期 ] [ 本文编辑 ] 王映红

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot