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1 北京大学学报 医学版 =;(,=&/>9;9-(9%:),%)090-#+82 + 结肠癌细胞中组织因子 活性凝血因子 表皮生长因子受体通路间交互作用机制 陈贺凯 戴 芸 吴 婷 汪 欣 万远廉 汤坚强 北京大学第一医院 普外科 消化内科 北京 论著 摘 要 目的 探讨结肠癌细胞中组织因子 活性凝血因子!"#$ %&& 通路与表皮生长因子受体 '#" '&( 通路之间是否存在交互作用 方法 在 野生型的 )%*+ 及 突变型的,- 结肠癌细胞中 以 & 活化 %&& 通路 采用.(%*/0(1$ # 检测 &( 配体双调蛋白 '"#$( 及表皮调节素 '"#$( 基因 蛋白表达改变 利用 ( 干扰技术敲低 %& 表达后活化 %&& 通路 检测其对 基因表达的影响 以证实 & 对 (( 表达调节作用依赖 %& 以表皮生长因子 '#" & 激活两细胞 &( 通路后 检测 %&& 通路关键分子 基因表达改变 结果 %&& 通路活化后 )%*+ 细胞 基因表达及 ( 蛋白表达水平均较对照组显著下调 基因表达量分别为 ( 蛋白表达量 + 均 3,- 细胞 基因表达及 (( 蛋白表达水平较对照组显著上调 基因表达量 (( 蛋白表达量 均 3%& 敲低后均可部分阻断 & 对两细胞 (( 表达调节作用 &( 通路激活后 )%*+ 细胞 基因表达较对照组无显著变化 基因表达未检测到 而,- 细胞的 及 基因表达均较对照组显著上调 表达量分别为 4 均 3 结论 结肠癌,- 细胞 %&& 通路与 &( 通路的活化可分别上调另一通路的关键分子表达并发生交互作用 基因突变可能对该交互作用的发生发挥关键作用 关键词 结肠肿瘤 凝血致活酶 因子 受体 表皮生长因子 中图分类号 (2 文献标志码 文章编号 2*252*+* ++ 6$2*252!" #$%# &%"&%%## 0))*7 89:$ 1;%$" 15$ 1:$*#$ %$*.$" 8'$$# " 8'$$#" /7$";$!&)'# 6$" 0$ ''!($ %' #$#!#7 $!"#$ * %&& $ '#" ' &( '$ $ #$ $ # $ # & )%*+ *# ' $,- *$ #$ $ #!%&&'.(%*/0($ 1$ # <' * $'"#$ ( $ '"#$ ( #"$&($ ($ ' $ #!# '!# 7$7$"$ <' $ %&%&*" ($$ & $ (<' $$ &*$ '$$$ %&<' $($.(%*/0(#$"!* $ &('$ '#" & )%*+ $,-# # %&&'! )%*+ # <' $ $ (#!# $ ( $ ($ ' $ #!# "$$#$*"#!$# "' "$<' $$ ' $ <' $( + #3&,-# <' $( $ ($ ' $ #!# $ ($ ' $ #!# "$$# '*"#!$#"' "$<' $ ' $ <' $($ ( #3% "#$"$ (<' $ &$ )%*+ $ 基金项目 国家自然科学基金 资助 '' #$&$$ 0$ '$$"*# 6.# 网络出版时间 **+ 网络出版地址 ' $7$7#+(+2#

2 + 北京大学学报 医学版 =;(,=&/>9;9-(9%:),%)090-#+82,-## '##7 7$7$"$ %&<' $&)%*+ #!$ &('$ $"$$(<' $ (<' $ $ )!,-#!$ &('$ "$$#" (<' $ $ <' $ 4 # 3# 9$ #$ $ #,- $! %&&'$ &('* # $ " ' "#$" ' $ $ "'# ##$ '#7 )*+,-0#$$'# % '#$ & (' '#" 组织因子 %& 是一相对分子质量为 2 的跨膜糖蛋白 在人体多数器官中都有表达 是启动外源性凝血的关键分子 此外 %& 在众多恶性实体肿瘤中呈现异常高表达 研究发现 活化的凝血因子!"#$ & 作为 %& 目前唯一明确的配体蛋白 在多种癌细胞中与 %& 胞外域结合为 %&& 复合物后引发一系列胞内信号通路 并最终促进肿瘤细胞侵袭 转 移? 表皮生长因子受体 '#" '&( 的异常活化通过其下游通路最终促进包括结直肠癌在内的多种肿瘤细胞生存 生长 增殖已被学者所熟知 近年有文献报道 人 )0% 细胞 %&& 通路活化后 可旁路磷酸化 &( 同时诱导 &( 配体肝素结合性表皮生长因子 '$* $$"&*#7" )*& 的表达 2 在人恶性胶质细胞瘤中 &( 的异常活化可诱导 %&& 的表达上调 4 但目前对于结直肠肿瘤的相关报道多局限于 %& 与肿瘤恶性进展的相关性方面 且 %&& 与 &( 两通路在结直肠癌中的相互作用方面的研究尚为空白 我们前期研究已证实 %& 在人结直肠癌组织中呈高表达 与肿瘤浸润深度 肝转移相关 + 且四系结肠癌细胞 1 14,- )0% %& & 通路活化后均发现各有不同的 &( 配体基因表达上调,- 细胞 %&& 通路活化后可旁路磷酸化 &(:4 位点 此外 通过免疫组织化学检测到临床结直肠癌组织中可异源性表达 & 根据这些前期研究成果 结合上述文献报道 我们推测 在人结肠癌细胞中 %&& 通路和 &( 通路之间可能存在相互调节作用 本研究旨在验证结肠癌细胞中 %&& 通路与 &( 通路之间的交互作用 该作用机制的明确可为晚期结直肠癌恶性进展分子机制提供更合理的理论依据 并为晚期结直肠癌靶向治疗药物研发提供新思路./ 材料与方法.. 材料与试剂人结肠癌细胞系 因 基因状态与 &( 通路密切相关 故选用 野生型的 )%*+ 及 突变型的,- 结肠癌细胞系同步实验 两系细胞均购自美国 %00 $ %'0# 0#* #$ 高糖 8@@ 细胞培养基 胎牛血清 # #& 转染用 ( 正义链 A*0* 0;;;;00*A 反义链 A*;;* ;00;;0;0;;00;;0*A 及转染试剂 (@5 转染用培养基 ='*@@ ( 提取用 %B# 试剂 (%*/0( 反转录试剂盒 (#*./0( 荧光染料 $ 均购自美国 9$!"$ 公司 细胞刺激药物重组 & 购自丹麦!7 公司 重组 & 购自美国 (C8 公司 (#*/0( 引物 表 由上海生工生物工程公司合成 细胞裂解液 (9/ 蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟 '$#$* #$##/@& 蛋白浓度测定二喹啉甲酸 $$$0 试剂盒购自上海碧云天生物技术公司 抗双调蛋白 '"#$( 一抗购自美国 (C8 公司 & 抗表皮调节素 '"#$ ( 一抗购自美国 " 公司 二抗购自美国 $0B 公司 ** 蛋白上样缓冲液购自南京凯基生物公司 0, 发光液购自美国 % 公司 表./ 各目的基因的引物序列!./.$' ""$ $ / '#$ B' A*0%0*A A*00%000%*A A*%%%0%%%00%%*A A*%%%0%%%0%%00%0%0*A A*00%000%%%*A A*0%0%00%0%%%%*A A*0000%0%0%0%0*A A*0%%00%00%%00%0%0*A A*0000%%%0%0*A A*00%0000%0%%*A 2 '"#$ '"#$ "##*'' "$.0 细胞培养与转染 + 2 )%*+,- 细胞均匀铺于 孔板 设空白对照

3 陈贺凯 等 结肠癌细胞中组织因子 活性凝血因子 * 表皮生长因子受体通路间交互作用机制 + 组 转染组 以含 D 体积分数 & 的 8@@ 完全培养基在 2 ED 体积分数 0= 条件下培养 在细胞生长至约 D 致密度时进行转染 弃培养基 无菌磷酸盐缓冲液 '' #$ / 洗 遍 加新鲜含 D & 完全培养基 以 ='*@@ 培养基分别溶解转染试剂 (@5 和 ( 两者混匀 室温放置 $ 后加入转染组细胞 对照组加等体积 / 转染 4 后提取总 ( 取 " 总 ( 反转录得 8(#*/0( 检测 %&( 表达 E $+ E 预变性 $ + E 变性 E 退火 延伸 $ 循环 检测重复 次以验证敲低效应.1 激活 %&& 通路后检测 &( 配体基因表达的改变两细胞系均设空白对照组 0$ 组 %& 敲低组 %& 组 & 刺激组 & 组 和 %& 敲低 & 刺激组 %&& 组 按 小节方法转染 %& 组和 %&& 组细胞后 饥饿处理 以 $#, 终浓度的 & 刺激 & 组和 %& & 组细胞 后提取各组总 (.(%*/0( 检测 &( 配体 的基因表达 实验独立重复 次. 检测 %&& 通路活化后 (( 蛋白表达的改变两细胞系设 0$ 组和 & 组 & 组加终浓度为 $#, 的 &0$ 组加等体积 / 后提取细胞总蛋白 0 法测蛋白浓度 加上样缓冲液 配胶上样 每泳道上样 " 总蛋白 - 恒压电泳 恒流电转 D 质量分数 牛奶室温封闭 E 过夜孵育一抗 %% 洗膜 次 $ 次 室温孵育二抗 %% 洗膜 次 $ 次 0, 发光 根据灰度值作柱状图 实验独立重复 次. 激活 &( 通路 检测 %&& 通路相关分子基因表达的改变两细胞系设 0$ 组和 & 组 以 ", 的 & 刺激 & 组细胞 0$ 组加等体积 / 后提取总 (.(%*/0( 检测 的基因表达 实验独立重复 次. 统计学方法应用 / 统计学软件 不同分组的基因 蛋白表达量以相对表达量的均数 标准差表示 统计学方法采用 检验 单因素方差分析 包含 检验 双侧检验 3 定义为差异有统计学意义 0/ 结果 0.%& 沉默效应验证 %&( 转染后 4 )%*+,- 细胞系对照组和 %& 组的 基因相对表达量分别为 4 2 均 3 图 0$ / %& 7$7 $ ($ 30$ 图./%&*( 转染 4 后 %& 敲低效应验证.(%*/0( %#./-$ %&*7$7$ $ 4.(%*/0( 00%&& 通路活化后 &( 配体基因表达改变 & 刺激 后 )%*+ 细胞系的 & 组 基因表达较 0$ 组均显著下调 基因在 0$ 组 & 组相对表达量分别为 基因在 0$ 组 & 组相对表达量分别为 2 20$ 组 %& 组和 %&& 组间差异均无统计学意义,- 细胞系 基因表达较 0$ 组显著上调 0$ 组 & 组相对表达量分别为 $ 组 %& 组和 %&& 组间差异均无统计学意义 基因各组两两间表达差异均无统计学意义 图

4 + 北京大学学报 医学版 =;(,=&/>9;9-(9%:),%)090-#+82 两细胞系 %&& 组与 & 组间基因表达差异有统计学意义 %&& 组与 0$ 组间差异 无统计学意义 即 & 诱导基因上 下调效应可被 敲减部分阻断 表明 & 上述效应依赖于 %& 0$ / %& 7$7 $ ($ & $#,& %&& $#, & %&3 0$ 图 0/.(%*/0( 检测 )%*+,- 细胞系不同组的 基因表达改变 %#0/$<' $$ $"'$ )%*+ $,-#.(%*(0( 01%&& 通路活化后 &( 配体蛋白表达改变 & 刺激 后 )%*+ 细胞 ( 蛋白表达量显著低于 0$ 组 + ( 蛋白表达在两组间差异无统计学 意义 2 图,- 细胞 & 组 ( ( 蛋白表达水平均显著高于 0$ 组 分别为 图 0$ / & $#,& ( '"#$ ( '"#$ /8) "##*''* "$3 0$ 图 1/1$ # 检测 )%*+ 细胞 %&& 通路活化后对 (( 蛋白表达的影响 %#1//$ <' $($ ( %&&'! $ )%*+ #1$ # 0&( 通路活化后检测 基因表达改变 & 刺激 )%*+ 细胞 %& 表达与 0$ 组相比无显著变化 基因表达未检测到,- 细胞系 & 刺激组 基因表达均较 0$ 组显著上调 分别为 4 43 图 1/ 讨论 本研究通过分别激活 基因野生型的 )%* + 及 基因突变型的,- 结肠癌细胞的 %&& &( 通路 检测两通路的相互调节作用 对于 )%*+ 细胞 %&& 通路活化后可负性调节 &( 通路 表现为 &( 配体 ( 的基因和蛋白表达下调 &( 通路活化后对 %&& 通路则无显著影响 对于,- 细胞 %&& 通路活化后可上调 &( 配体 (( 的基因和蛋白表达 &( 通路活化后则可上调 基因表达 两通路表现为相互促进的交互作用 基因状态不同的两种细胞 %&&*&( 通路间的相互作用截然不同 我们前期研究发现 结肠癌细胞 1 14 及 )0% 均为 >( 突变型 %&& 通路活化后均可上调 &( 配体基因表达 结合本实验研究结果推测 基因突变可能对 %&&*&( 通路间发生相互促进的交互作用机制发挥关键作用

5 陈贺凯 等 结肠癌细胞中组织因子 活性凝血因子 * 表皮生长因子受体通路间交互作用机制 + 0$ / & $#,& ( '"#$ ( '"#$ /8) "##*''* "$3 0$ 图 /1$ # 检测,- 细胞 %&& 通路活化后对 (( 蛋白表达的影响 %#//$ <' $($ ( %&&'! $,-#1$ # 0$ / & '#" ", %& 3 0$ 图 /.(%*/0( 检测 )%*+,- 细胞 &( 通路活化后 基因表达改变 %#/$<' $$ &('! $ )%*+ $,-#.(%*/0( 目前 %&& 通路与 &( 通路的相关性研究较少 我们前期通过基因表达谱芯片检测到 1 细胞 >( 突变型 %&& 通路活化后 &( 配体 均有不同程度表达上调 通过免疫组织化学检测到临床结直肠癌组织中可异源性表达 & 生理条件下仅表达于肝细胞 均 与本实验结果一致 )6 活化及白细胞介素 *4 $#7$*4 9,*4 上调为 2 %&& 通路的下游效应 1 " 等则进一步阐明了上述 %&& 通路效应通过促进 &( 磷酸化介导 而 &( 通路活化后上调 %&& 通路关键 4 分子 %&& 表达则只见于 $ 等的报道 上述研究均未涉及两通路的交互作用 且在结直肠肿瘤中的相关研究尚为空白 本研究证实了结肠癌细胞中 %&&&( 双通路交互作用机制的存在 并推测 基因突变可能对该机制的发生起关键作用 既往关于结直肠癌 ' 突变与 %& 高表 达的相关性研究也支持这一假设? %&& 信号通路在结直肠癌等众多实体肿瘤 的进展中发挥着重要作用? 近年以 %& 为靶标应用于肿瘤诊疗的研究成果已得到初步肯定 6 2 等报道 针对 %& 的靶向药物 %&)@ 将人 %& 单抗与细胞毒性药物连接 在 2 种不同的人实体瘤小鼠移植模型中表现出高效抑瘤作用 且对凝血作 4 用并无明显影响 等利用肿瘤血管内皮异常表达 %& 研制出一种 0 荧光染料标记的靶向结合 %& 的蛋白分子 可在体内定位肿瘤并成像 这一新技术有望应用于临床肿瘤的检测与治疗效果的监测 这些研究均表明 以 %& 为靶标在肿瘤的诊疗中具有极高的临床应用价值 &( 通路与结直肠癌发生 发展密切相关 抗 &( 单抗可用于治疗 基因野生型的晚期结直肠癌患者 该药物通过结合 &( 胞外域 阻断 &( 与其胞外配体结合导致的 &( 活化作用 从而达到抑制 &( 信号通路的效果 基因发生突变的患者对 &( 靶向治疗无效 + 传统观念认为 由于 基因突变导致的 ( 蛋白持续活化 使 &( 通路下游处于不依赖 &( 的持续

6 + 北京大学学报 医学版 =;(,=&/>9;9-(9%:),%)090-#+82 激活状态 从而导致 &( 靶向治疗的失败 本研究结果提示 基因发生突变除持续活化其下游通路外 还可使 &( 通过结合其胞外配体 & 产生对 %&& 信号通路的促进作用 %&& 通路的活化一方面促进结直肠癌细胞增殖 侵袭 转移 同时又进一步上调 &( 配体表达 形成正反馈环路强化上述作用 即 发生突变后 &( 与其胞外配体的结合虽对 &( 下游通路活化作用不再重要 但可通过与 %&& 通路发生交互作用进一步促进癌细胞恶性进展 因而我们推测 尽管临床上 基因突变的晚期结直肠癌患者对抗 &( 的靶向治疗无效 但该药物仍具有治疗意义 其疗效很可能在 &(*%& 联合靶向抑制后得以显现 %&& 通路与 &( 通路在结直肠肿瘤恶性进展中存在交互作用 这一发现有望为结直肠癌靶向治疗提供新思路 对本研究涉及的双通路下游相关效应分子的进一步明确 有望指导临床研发双通路抑制 较现有药物 如西妥昔单抗 更为高效的复合靶向药物 总之 本研究初步证实了结肠癌细胞中 %&& 与 &( 双通路的交互作用机制 但具体的反馈机制尚待进一步明确 如 双通路交互作用是通过直接激活还是间接激活实现 两通路各自下游通路是否同样存在交叉反应参与了这一正反馈过程 并最终影响癌细胞的生物学行为 基因突变对两通路相互作用的调节机制如何等 相信对 %&& * &( 通路交互作用机制的深入研究与进一步明确 将对研发晚期结直肠癌新型复合靶向治疗药物具有重大指导意义 参考文献 0#$ -7 (,-9$#$* $ $ # 0$ ? 0 1$ :, %$" #%! $<#' $*2 <' $ "!* $ *&!(> $ "$#$"'$ $ #$ $#9$0##8 2 2? 汤坚强 万远廉 刘玉村 等 组织因子 活化凝血 因子复合物对大肠癌,- 细胞系表达基质金属蛋白酶 *2 的调控作用 北京大学学报 医学版 2 +?2 汤坚强 万远廉 刘玉村 等 组织因子促进人类大肠癌细胞的侵袭及与基质金属蛋白酶类的相关性研究 北京大学 学报 医学版 2?4 $$ (,- %$!8 #$'' "#$ # 24?2 %$"% >77 > %$ #$$ <* ' $ 7$ ' $ " * '$ $ '$$ 0$ ( ?2 2 1 "@% /B)%'#" ' * &( $ ' #$ $7$ /:> $!#! $ '$$ "$#$"$ )0%# % ) +? #(# '$ #" $$"# % ( ''#? + 吴楠 万远廉 王振军 等 组织因子表达与直肠癌肝转移的关系及其调控 中华胃肠外科杂志? 汤坚强 樊庆 万远廉 等 组织因子 凝血因子 在大肠癌中的异位表达及其临床意义 北京大学学报 医学版 +? )6@ /$,0 # 7$ % #%* *''*"#$ 9,*4 <' $ # /(* $ #$ $ #* "$# 4 +?2 ( : )$" #@$' $ >* * #%&<' $ $ $ ##$ %&$ "* #$ 7 ' ' "$ 9$0##8 +? - #=$"$!$"# <' $ $ ##$ # '#$ ' "$ $ $""$# 2? 2 1$ : %$" #8'#$ '' * '$ " $ ##$!" $ $$ '"$ ''* 0$#% 4+?+2 -")) $ & #9$$ "$#$"'' " # 4 +?++ -")) '7 0 (#8 #0"#$ $ $''$ $7 =$"$? '#"$ #$ $* " $6"" <'$'*!"$ $"# 0$( 2? 4 >#1, : #-#B$"$$ '$ '!#!$$"0*## $ $** $8"%" 2? + 0$", ($ 1 5, #$*&(@ $$ ##$ #$ $! $ $ 0$0/# 2? ** 收稿 本文编辑 赵 波

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