796 第三军医大学学报,2018,40(9) htp://aammt.tmmu.edu.cn 0.05).GSEArevealedthatlowlevelofFBXL20waspositivelycorelatedwithG 2 /Mcheckpoint(P<0.01). Conclusion D

Size: px

Start display at page:

Download "796 第三军医大学学报,2018,40(9) htp://aammt.tmmu.edu.cn 0.05).GSEArevealedthatlowlevelofFBXL20waspositivelycorelatedwithG 2 /Mcheckpoint(P<0.01). Conclusion D"

贸游申
5 years ago
Views:

1 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2018,40(9) 795 DOI: /j FBXL20 对人非小细胞肺癌 A549 细胞生长的影响张博瀚, 吴庆琛重庆, 重庆医科大学附属第一医院胸心外科 [ 摘要 ] 目的观察 FBXL20(Fboxandleucinerichrepeatprotein20) 对人非小细胞肺癌 A549 细胞生长的影响并初步探究其机制方法采用慢病毒感染 A549 细胞, 构建对照组 (FBXL20vector 组 ) 及干扰组 (FBXL20RNAi 组 ), 通过 Westernblot 验证慢病毒敲减效率利用 CCK8 及集落形成实验观察 FBXL20 的下调对 A549 细胞增殖能力的影响, 流式细胞术检测细胞周期的变化,Westernblot 分析周期蛋白的改变, 基因集富集分析 (genesetenrichmentanalysis,gsea) 探究 FBXL20 可能参与的生物学过程结果干扰组 FBXL20 的蛋白表达 (0.36±0.02) 显著低于对照组 (0.58±0.01)(P<0.01) 与对照组相比, 干扰组的增殖能力增强 (P<0.05), 形成的集落数目也显著增加 (100±20vs53±6)(P< 0.05), 且停留在 G 2 /M 期的细胞比例明显降低 (5.65±1.35vs9.94±1.44)(P<0.05) Westernblot 结果显示 CyclinD1 ERK1/2 蛋白表达无明显变化 (P>0.05),CDK2 CyclinE CDK1 CyclinA Cyclin B1 蛋白表达显著增加, 而 perk1/2 则显著降低 (P<0.05) GSEA 结果显示 FBXL20 的低表达与 G 2 /M 检查点呈正相关 (P<0.01) 结论下调 FBXL20 可以加快 A549 细胞 G 2 /M 期的进程, 提高其生长能力其机制可能是通过抑制 perk 的激活, 使得其下游周期蛋白 CDK1 CyclinA CyclinB1 表达增加而实现的 [ 关键词 ] FBXL20; 非小细胞肺癌 ; 增殖 ; 细胞周期 [ 中图法分类号 ] R394.3;R730.23;R734.2 [ 文献标志码 ] A EfectsofFBXL20onproliferationinhumannonsmalcellungcancerA549cels ZHANGBohan,WU Qingchen DepartmentofCardiothoracicSurgery,theFirstAfiliatedHospitalofChongqing MedicalUniversity,Chongqing,400016,China [Abstract] Objective TodetecttheefectofFboxandleucinerichrepeatprotein20(FBXL20)on theproliferationofhumannonsmalcellungcancera549celsandminetheunderlyingmechanism. Methods LentiviralvectorFBXL20RNAiwasusedtotransfectA549celstoknockdowntheexpresionof FBXL20,andblanklentiviralvector(FBXL20vector)wasusedforcontrolcels.Knockdowneficiencywas verifiedbywesternbloting.cck8asayandcolonyformationasaywereusedtodeterminetheefectsof silencedfbxl20 on theproliferation. Flow cytometrywasperformed toexplorecelcyclealteration. ExpresionchangesofcelcycleproteinsweremeasuredbyWesternbloting.Genesetenrichmentanalysis (GSEA)wasconductedtoinvestigatethebiologicalprocesinvolvedwithFBXL20.Results Theprotein leveloffbxl20wasremarkablylowerintheinterferencecelsthanthecontrolcels(0.36±0.02vs0.58± 0.01,P<0.01).Comparedwiththecontrolcels,theinterferencecelshadgreaterproliferationability (P<0.05)andincreasedcolonycount(100±20vs53±6,P<0.05),andlescelsarestedinG 2 /M phase(5.65±1.35vs9.94±1.44,p<0.05).westernblotresultsshowedtherewerenosignificant diferencesinproteinlevelsofcyclind1anderk1/2(p>0.05),andtheproteinlevelsofcdk2,cycline, CDK1,CyclinA andcyclinb1werenotablyincreasedwhileperk1/2wasdistinctlydecreased(p< [ 基金项目 ] 重庆市卫生局重点科研项目 ( ) [ 通信作者 ] 吴庆琛, 电话 :(023) , qcwucq@163.com [ 优先出版 ] htp://kns.cnki.net/kcms/detail/ r html

2 796 第三军医大学学报,2018,40(9) htp://aammt.tmmu.edu.cn 0.05).GSEArevealedthatlowlevelofFBXL20waspositivelycorelatedwithG 2 /Mcheckpoint(P<0.01). Conclusion DownregulationofFBXL20canexpeditetheG 2 /MphaseofA549celsandenhancethegrowth ability,whichmayduetothesuppresionofperkactivation,andthereforeenhancementoftheexpresionof itsdownstreamcelcycleproteinscdk1,cyclinaandcyclinb1. [Keywords] FBXL20;nonsmalcellungcancer;proliferation;celcycle SupportedbytheKeyScientificResearchProjectofChongqingMunicipalHealthBureau( ).Corespondingauthor:WU Qingchen,Tel: , qcwucq@163.com 肺癌是全球范围内肿瘤死亡的最主要原因之一, 5 年生存率不到 15% [1] 在我国, 肺癌的发病率和病死率均位列第 1 位 [2] 肺癌约有 85% 为非小细胞肺癌 (nonsmalcellungcancer,nsclc), 它的主要治疗方式是手术合并术后的化疗, 但治疗效果仍不理想 [3] 分子靶向治疗发展迅速, 找到一种有效的治疗靶点可能成为治疗 NSCLC 的有效途径 FBXL20(Fboxand leucinerichrepeatprotein20), 也称作 SCRAPPER, 是 E3 泛素连接酶 SCF(Skp1CulinFbox) 复合体中的一种蛋白, 最初发现与中枢神经系统的突触传递相关 [4] 近年来,FBXL20 与肿瘤的关系也在一些文献中被阐明有人发现沉默 FBXL20 能降低肝癌 SMMC 7721 细胞的增殖和迁移能力 [5] 本研究为探究 FBXL20 与 NSCLC 的关系, 通过 RNA 干扰技术降低了 A549 中 FBXL20 的表达水平, 观察其对 A549 细胞的影响并研究潜在的作用机制 1 材料与方法 1.1 细胞株人非小细胞肺癌细胞株 A549 由分子肿瘤与表观遗传学重庆市重点实验室提供采用 RPMI1640 培养基, 配以 10% 胎牛血清并加入 100U/mL 青霉素及 100μg/mL 链霉素, 在 CO 2 浓度为 5% 的 37 孵箱内对 A549 进行培养选取处于对数期且生长良好的细胞进行实验 1.2 主要试剂 RPMI1640 培养基购于 HyClone 公司, 胎牛血清购于德国 PANBiotech 公司, 青霉素链霉素胰酶和嘌呤霉素, 购于美国 Gibco 公司, 慢病毒购于上海吉凯基因化学技术有限公司, 蛋白裂解液 (RIPA) 苯甲基磺酰氟 (PMSF) BCA 试剂盒购于碧云天公司,CCK8 试剂盒购于日本 DojindoMolecularTechnologies 公司, 细胞周期测定试剂盒 [ 内含 RNase 和碘化丙啶 (propidium iodide,pi)] 购于美国 BD 公司, 兔抗人 FBXL20 Cyclin D1 GAPDH 多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司, 鼠抗人 CDK2 CyclinE CDK1 CyclinA Cyclin B1 ERK1/2 perk1/2 单克隆抗体购于 SantaCruz 公司, 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和抗小鼠 IgG( 二抗 ) 购于 ABGENT 公司,PVDF 膜 ECL 化学发光试剂购于美国 Milipore 公司 1.3 方法慢病毒感染取对数生长期 A549 细胞, 用完全培养基制备密度为 /ml 的细胞悬液, 取 100μL/ 孔按照不同分组加入 96 孔板, 培养 24h 吸去上清液并根据分组加入不同的试剂, 继续培养 8~ 12h 后换液, 保持细胞正常生长感染 72h 后, 用显微镜观察绿色荧光, 并以感染效率在 80% 以上且细胞生长良好所对应的感染条件作为后续实验的依据取对数期 A549 细胞, 以 /ml 密度,2mL 接种体积种板于 6 孔板中, 培养 24h 弃上清, 按照所确定的条件分别加入适量包含沉默 FBXL20 的 shrna 的慢病毒 (5 ACTCCTGTTACGGATATTT3 ) 及空载体病毒 (5 TTCTCCGAACGTGTCACGT3 ), 同时加入事先稀释好的 Polybrene 以增强感染效果, 并保持其终浓度为 5μg/mL, 后续操作同前将感染成功的细胞转入培养瓶培养, 加入 1μg/mL 嘌呤霉素 2 周, 得到稳定株此后将 A549 细胞分为对照组 (FBXL20vector 组 ) 和干扰组 (FBXL20RNAi 组 ) CCK8 增殖实验实验分为 FBXL20vector 及 FBXL20RNAi 两组取对数期人非小细胞肺癌 A549 细胞, 以 / 孔种板于 96 孔板, 每组设置 5 个复孔并于孵箱中培养待细胞贴壁后加入 100μL RPMI1640 培养液 ( 包含 10μLCCK8 试剂 ), 孵箱中继续培养 2h 后用酶联免疫检测仪测定细胞在 450nm 处的光密度并记录数值, 设定时间点为 0h 此后 h 分别测定两组细胞的 D(450), 最后根据时间和所测得的数值绘制细胞生长曲线集落形成实验取对数生长期 FBXL20 vector 及 FBXL20RNAi 两组 A549 细胞, 以 500/ 孔的密度铺板于 6 孔板, 每组设置 3 个复孔,2 周后出现肉眼可见的成团细胞集落, 终止培养, 期间视细胞状态换

htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2018,40(9) 797 液先后以 4% 多聚甲醛及结晶紫分别固定和染色 20min, 清水轻柔洗净干燥后扫描并计数 1.3.

3 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2018,40(9) 797 液先后以 4% 多聚甲醛及结晶紫分别固定和染色 20min, 清水轻柔洗净干燥后扫描并计数流式细胞术检测细胞周期培养瓶中细胞融合度达 80% ~90% 时, 用不含 EDTA 的胰酶将人肺腺癌细胞 A549 消化成单细胞悬液, 离心后吸尽上清液并用 PBS 重悬, 再次离心后收集细胞, 用 2~3mL 预冷的 70% 冰乙醇轻轻将其吹散, 尽量保持为单个细胞的状态置于 4 固定至少 24h, 离心弃上清并用 2~3mLPBS 重悬, 重复至少 2 次用 400μLPBS 重悬, 加入 2.5μLRNase 于 37 放置 30min, 再混入 2μLPI, 室温避光 30min 后上机使用流式细胞仪做周期检测蛋白提取及蛋白质免疫印迹检测 (Western blot) 取对数生长的两组 A549 细胞, 弃培养基后用预冷的 PBS 充分清洗 3 次, 均匀加入适量 RIPA 及 PMSF 混合液 (100 1), 置于 4 摇床 20min 后刮下细胞并收集于 EP 管中, 用超声对细胞进行裂解后 4 离心 10min, 将上清液转移到另一个 EP 管中即获得细胞总蛋白之后用 BCA 法测定蛋白浓度, 加入蛋白上样缓冲液后在 100 的条件下变性 10min 根据想要测定的蛋白分子量配置相应浓度的聚丙烯酰胺凝胶, 以 40μg/ 孔进行电泳, 随后将分离后的蛋白电转至 PVDF 膜, 用浓度为 50μg/mL 的脱脂奶粉 (TBST 配置 ) 封闭 1h, 加入兔抗人 FBXL20(1 500) CyclinD1 (1 500) GAPDH(1 1000), 鼠抗人 CDK2(1 500) CyclinE(1 500) CDK1(1 500) CyclinA(1 500) CyclinB1(1 500) ERK1/2(1 750) perk1/2 (1 750) 后 4 摇床过夜 TBST 洗膜 3 次, 每次 10min 随后室温孵育二抗(1 3000)1h, 再用 TBST 洗膜 3 次, 每次 10min ECL 化学发光试剂显影, 以 GAPDH 作为内参分析条带灰度值比值基因集富集分析 (GSEA) 通过 htp:// software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp 下载 GSEA 软件, 从 GEO 数据库中的 GSE31210 数据集及 TCGA 数据库获取数据, 按照 FBXL20 表达水平中位数将数据分为高低两组, 将整理好的数据及分组文件导入 JAVA 软件, 选取 h:halmarkgenesets 和 c2:curated genesets 分析 FBXL20 的富集情况结果中红色表示 FBXL20 高表达, 蓝色表示 FBXL20 低表达, 标准化富集分数 (normalizedenrichmentscore,nes) 是富集分析的主要指标, 大于 0 表示该基因集富集于 FBXL20 高表达, 而小于 0 表示该基因集富集于 FBXL20 低表达, 值越大富集越显著 1.4 统计学处理所有统计学结果均基于 SPSS20.0, 作图使用 GraphPadPrism7.00 和 AdobeIlustratorCS6 计量资料以 x±s 珋表示, 两组数据比较首先用单样本 Kolmog orovsmirnov 检验查看数据是否符合正态分布, 如果符合, 则使用独立样本 t 检验, 如果不符合, 则使用非参数 MannWhitney 检验, 检验水准 α= 结果 2.1 慢病毒成功干扰 A549 中 FBXL20 的蛋白表达结果表明,FBXL20RNAi 组中的 FBXL20 蛋白相对表达量 (0.36±0.02) 显著低于 FBXL20vector 组 (0.58±0.01), 差异有统计学意义 (P<0.01, 图 1) 说明在 A549 中 FBXL20 的 shrna 慢病毒感染成功, 并构建出稳定株 1:FBXL20vector 组 ;2:FBXL20RNAi 组图 1 感染慢病毒后不同处理组 A549 中 FBXL20 的蛋白表达 2.2 FBXL20 的下调能促进 A549 细胞的增殖通过 CCK8 实验测量不同时间点 A549 细胞在 450nm 处的光密度值, 我们发现 FBXL20RNAi 组在 h3 个时间点的测量结果均高于 FBXL20 vector 组, 差异有统计学意义 (P<0.05, 图 2) 结果表明下调 FBXL20 能有效提高 A549 细胞的增殖能力 $!"# % $ $& ' a:p<0.05, 与 FBXL20vector 组比较图 2 CCK8 实验检测不同处理组 A549 细胞增殖能力 (n=3, 珋 x±s) % %

798 第三军医大学学报,2018,40(9) htp://aammt.tmmu.edu.cn 2.3 细胞集落形成实验细胞集落形成实验结果显示, 经过 2 周的培养, FBXL20RNAi 组 A549 细胞形成的集落数目为 (100± 20) 个, 显著高于 FBXL20vector 组所形成的 (53±6) 个集落数, 差异有统计学意义 (P<0.

4 下调 FBXL20 显著减少了停留在 G 2 /M 期的 A549 细胞比例我们已经发现 FBXL20 的下调会促进 A549 细胞的增殖, 因此采用流式细胞术检测 FBXL20 是否通过影响细胞周期来调控细胞的生长结果显示, 相较于 FBXL20vector 组,FBXL20RNAi 组 G 1 期细胞比例无明显变化 (47.11±1.09vs47.13±1.31)(P>0.

01)( 图 4C D), 证实了我们实验的结论因此 FBXL20 的下调使得停留在 G 2 /M 期的细胞比例降低, 加快了周期的进程, 从而促进细胞的增殖 2.

4 798 第三军医大学学报,2018,40(9) htp://aammt.tmmu.edu.cn 2.3 细胞集落形成实验细胞集落形成实验结果显示, 经过 2 周的培养, FBXL20RNAi 组 A549 细胞形成的集落数目为 (100± 20) 个, 显著高于 FBXL20vector 组所形成的 (53±6) 个集落数, 差异有统计学意义 (P<0.05, 图 3) 结果表明下调 FBXL20 的表达, 能够促进 A549 细胞的集落形成能力 A:FBXL20vector 组 ;B:FBXL20RNAi 组图 3 不同处理组 A549 细胞集落形成能力 ( 结晶紫 ) 2.4 下调 FBXL20 显著减少了停留在 G 2 /M 期的 A549 细胞比例我们已经发现 FBXL20 的下调会促进 A549 细胞的增殖, 因此采用流式细胞术检测 FBXL20 是否通过影响细胞周期来调控细胞的生长结果显示, 相较于 FBXL20vector 组,FBXL20RNAi 组 G 1 期细胞比例无明显变化 (47.11±1.09vs47.13±1.31)(P>0.05),G 2 /M 期的细胞比例明显减少 (5.65±1.35vs9.94±1.44), S 期相对增多 (47.23±0.56vs42.93±1.69), 差异有统计学意义 (P<0.05, 图 4A B) 除此之外,TCGA 及 GSE31210 的 GSEA 分析显示低表达 FBXL20 的样本富集于 G 2 /M 检查点的基因集 (NES 分别为和 -2.99,P<0.01)( 图 4C D), 证实了我们实验的结论因此 FBXL20 的下调使得停留在 G 2 /M 期的细胞比例降低, 加快了周期的进程, 从而促进细胞的增殖 2.5 干扰了 FBXL20 的表达后细胞周期相关蛋白的变化 Westernblot 结果显示, 相较于 FBXL20vector 组, FBXL20RNAi 组中 CDK2 CyclinE CDK1 CyclinA CyclinB1 的蛋白表达水平更高, 差异有统计学意义 (P<0.05), 而 CyclinD1 无明显差异 (P>0.05) ERK1/2 的磷酸化能抑制下游相关周期蛋白如 CDK1 CyclinA CyclinB1 的表达, 因此我们检测了 ERK1/2 蛋白的变化结果显示, 总的 ERK1/2 在干扰组和对照组无明显差异, 而干扰组 perk1/2 显著低于对照组 ( 图 5) 结果表明 FBXL20 的下调能够减少 ERK 蛋白的磷酸化, 从而增加 G 2 /M 周期相关蛋白的表达水平, 促进 A549 细胞增殖 '!"# $%&' ()!"# $%&' () '! "#! #! "#! *+!!%$ A B: 流式细胞术检测 FBXL20vector FBXL20RNAi 组细胞周期结果 ;C D:TCGA GSE 中的 GSEA 分析结果 (n=3, 珋 x±s) 图 4 流式细胞术检测不同处理组 A549 细胞周期及 GSEA 分析结果! "# $# "%!&& '"%!&& # # # ()*+, %-$ ! $ # A:Westernblot 检测结果 ;1:FBXL20vector 组 ;2:FBXL20RNAi 组 ;B: 蛋白灰度值分析 (n=3, x±s);1:fbxl20; 珋 2:CyclinD1;3:CDK2;4:CyclinE;5:CDK1;6:CyclinA;7:CyclinB1;8:ERK1/2;9:pERK1/2;a:P<0.05, 与 FBXL20vector 组比较图 5 Westernblot 检测不同处理组 A549 细胞相关蛋白表达量

5 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2018,40(9) 讨论 FBXL20 在肿瘤中扮演着不同的角色 ZHU [6-8] 等研究发现,FBXL20 基因在结直肠癌组织中的表达水平显著高于正常结直肠组织, 且能够通过 Wnt 通路和 Caspase 的激活促进结直肠癌的发生发展除此之外,FBXL20 可能通过介导 Ecadherin 的泛素化降解从而提高结直肠癌细胞的侵袭能力有报道显示在正常核型急性髓系白血病中, 高表达的 mir3151 是其不良结局的独立预后因子, 而 FBXL20 是 mir3151 的直接靶标,miR3151 能降低 FBXL20 的表达, 因此 FBXL20 可能扮演着抑癌的角色 [9] 同时, 有研究发现 FBXL20 在喉癌组织中的表达显著低于正常组织, 且与分化程度和有无淋巴结浸润相关, 可能是喉癌发生的一个抑制因子 [10] 在本研究中, 我们首先利用慢病毒感染 A549 细胞, 通过 Westernblot 验证干扰效果, 证实了在 FBXL20RNAi 组中 FBXL20 表达降低, 随后研究 FBXL20 的降低对 A549 细胞生物学功能的影响 CCK8 和集落形成实验说明 FBXL20 的下调能促进 A549 细胞的生长能力, 流式细胞术结果显示下调 FBXL20 使得停留在 G 2 /M 期的细胞减少, 细胞周期加快 GSEA 结果显示 G 2 /M 检查点基因集富集于低表达的 FBXL20 以上结果提示 FBXL20 在 NSCLC 中可能起到了抑制癌症的作用, 与它在正常核型急性髓系白血病和喉癌中的角色相同为了理解 FBXL20 在 NSCLC 中的作用机制, 我们检测了细胞周期相关蛋白 CyclinD1 CDK2 CyclinE CDK1 CyclinA CyclinB1 的变化 CyclinD1 是细胞 G 1 期所必需的蛋白,CDK2 和 CyclinE 结合形成复合体, 使细胞进入 S 期, 而 CDK1 CyclinA 及 CyclinB1 则是 G 2 /M 期的关键蛋白 [11] 相较于 FBXL20vector 组, 我们发现 FBXL20RNAi 组中 CyclinD1 无明显变化,CDK2 CyclinE CDK1 CyclinA 及 CyclinB1 显著增加, 说明 FBXL20 的下调没有影响到 G 1 期, 而使得 A549 细胞加速进入了 S 期, 且加快了 G 2 /M 期的进程, 这与流式细胞术检测周期所得到的结果一致早 [12] 在 1997 年,WOODS 等就发现高度活化的 Raf 可以通过促进 ERK1/2 的磷酸化而上调 p21 的表达, 进而抑制 CyclinDCDK4 以及 CyclinECDK2 复合物, 阻滞 G 1 /S 期且研究发现在 TP53 缺失时,Raf/MEK/ERK 的激活能够通过 Sp1 促进 CDKN1A(p21) 的转录而影响细胞周期 [13] 不仅如此, 有文献报道称 ERK1/2 的磷酸化会导致 p21 的激活, 致使下游的 CDK1 CyclinA CyclinB1 表达下降, 使周期阻滞于 G 2 /M 期 [14-15] 因此我们检测了 ERK1/2 及 perk1/2 的蛋白变化, 发现 FBXL20RNAi 组中的 ERK1/2 较对照组无明显变化, 而 perk1/2 则显著降低本研究发现, 下调的 FBXL20 能明显促进 A549 细胞的生长, 抑制 ERK1/2 的磷酸化并显著增加周期蛋白 CDK2 CyclinE CDK1 CyclinA 及 CyclinB1 的表达, 加快周期的进程, 初步揭示了 FBXL20 在 NSCLC 中可能通过调控 ERK1/2 的磷酸化影响细胞周期从而发挥抑癌作用的机制, 希望能为 NSCLC 的诊断和治疗提供参考参考文献 : [1] SIEGELR,NAISHADHAM D,JEMALA.Cancerstatistics, 2013[J].CA,2013,63(1):11-30.DOI: /caac [2] CHENW,ZHENGR,BAADEPD,etal.Cancerstatisticsin China,2015[J].CA,2016,66(2): DOI: /caac [3]MOLINAJR,YANGP,CASSIVISD,etal.Nonsmalcel lungcancer:epidemiology,riskfactors,treatment,andsurvi vorship[j].mayoclinicproceedings,2008,83(5): doi: / [4]YAOI,TAKAGIH,AGETAH,etal.SCRAPPERdependent ubiquitinationofactivezoneproteinrim1regulatessynaptic vesiclerelease[j].cel,2007,130(5): doi: /j.cel [5] 牛静静, 苗风济.siRNA 靶向沉默 fbxl20 基因对肝癌 SMMC7721 细胞生物学行为的影响 [J]. 川北医学院学报,2012,27(3): DOI: /j.isn NIUJJ,MIAOFJ.EfectofsiRNAtargetedtofbxl20onbio logicalbehavioroflivercancersmmc7721cels[j].jnorth SichuanMedCol,2012,27(3): DOI: /j. isn [6] 朱晓华, 邓世山, 谢兴国, 等. 结直肠腺癌发病基因 fbxl20 和 Ecadherin 的相关性研究 [J]. 实用肿瘤学杂志,2013, 28(6): DOI: /j.isn ZHUXH,DENG SS,XIEX G,etal.Theresearchabout corelation ofcolorectaladenocarcinoma gene fbxl20 and Ecadherin[J].JPractOncology,2013,28(6): DOI: /j.isn [7] ZHUJJ,LIK,DONG L,etal.RoleofFBXL20inhuman

6 800 第三军医大学学报,2018,40(9) htp://aammt.tmmu.edu.cn colorectaladenocarcinoma[j].oncolrep,2012,28(6): DOI: /or [8]ZHUJJ,DENGSS,DUANJ,etal.FBXL20actsasaninva sioninducerandmediatesecadherinincolorectaladenocar cinoma[j].oncollet,2014,7(6): doi: /ol [9] EISFELD A K,MARCUCCIG,MAHARRY K,etal.miR 3151interplayswithitshostgeneBAALCandindependently afectsoutcomeofpatientswithcytogeneticalynormalacute myeloidleukemia[j].blood,2012,120(2): DOI: /blood [10] 温蓓, 何刚.FBXL20 在喉癌组织中的表达及意义 [J]. 成都医学院学报,2016,11(6): DOI: / j.isn WENB,HEG.TheexpresionandsignificanceofFBXL20 inlaryngealcarcinomatisues[j].jchengdumedcol, 2016,11(6): DOI: /j.isn [11] 高燕, 林莉萍, 丁健. 细胞周期调控的研究进展 [J]. 生命科学,2005,17(4): DOI: /j.isn GAOY,LINLP,DINGJ.Areview:celcycleregulation [J].ChinBulLifeSci,2005,17(4): DOI: /j.isn [12]WOODSD, PARRY D, CHERWINSKIH, etal. Raf inducedproliferationorcelcyclearestisdeterminedbythe levelofrafactivitywitharestmediatedbyp21cip1[j]. MolCelBiol,1997,17(9): DOI: / MCB [13] KARKHANISM,PARK J.Sp1regulatesRaf/MEK/ERK inducedp21cip1transcriptionintp53mutatedcancercels [J].CelSignal,2015,27(3): DOI: / j.celsig [14]WANGL,JIANGX,CHENG,etal.Antitumoractivityof SL4againstbreastcancercels:inductionofG 2 /M arest throughmodulationofthemapkdependentp21signaling pathway[j].scirep,2016,6:36486.doi: / srep [15] LV C,SUN W,SUN H,etal.AsperolideA,amarine derivedtetranorditerpenoid,inducesg 2 /M arestinhuman NCIH460 lungcarcinomacels,ismediatedbyp53p21 stabilizationandmodulatedbyras/raf/mek/erk signa lingpathway[j].marinedrugs,2013,11(2): DOI: /md ( 收稿 : ; 修回 : ) ( 编辑栾嘉 )

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot