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1 第 27 卷第 27 期中国现代医学杂志 Vol. 27 No 年 11 月 China Journal of Modern Medicine Nov DOI: /j.issn 文章编号 : (2017) 下调 基因表达对胃癌细胞增殖 迁移和侵袭的影响鄢 赵乃阔 1, 胡庆军 1, 史朝晖 2 (1. 河南省焦作市人民医院消化内科, 河南焦作 ; 2. 河南大学淮海医院, 河南开封 ) 摘要 : 目的 探讨抑制 α-catulin 基因表达对胃癌细胞增殖 迁移和侵袭的影响, 以及可能的机制 方法 培养人胃癌细胞 SGC-7901, 根据转染物不同将细胞分为 sirna-α-catulin 组 sirna- 对照序列组和空白对 照组,MTT 法检测细胞增殖能力,Transwell 法检测细胞迁移和侵袭能力,Western blot 检测细胞中 α-catulin N- 钙粘蛋白 (N-cadherin) E- 钙粘蛋白 (E-cadherin) 和波形蛋白 (Vimentin) 表达 结果 sirna-α-catulin 组细胞 及 96h 时吸光度 A 值均低于 sirna- 对照序列组和空白对照组, 差异有统计学意义 ( <0.05); 与 sirna- 对照序列组和空白对照组比较,siRNA-α-catulin 组迁移细胞数和侵袭细胞数均降低, 差异有统计 学意义 ( <0.05); 与 sirna- 对照序列组和空白对照组比较,siRNA-α-catulin 组细胞中 α-catulin N-cadherin 及 Vimentin 蛋白相对表达量均降低, 而 E-cadherin 蛋白相对表达量增加, 差异有统计学意义 ( <0.05) 结论特异性沉默人胃癌细胞 SGC-7901 中基因表达可有效抑制细胞增殖 迁移和侵袭能力, 其机制可能与抑制上皮 - 间质转化过程有关 关键词 : 胃癌 ;α -catulin; 细胞增殖 ; 细胞侵袭 ; 上皮 - 间质转化 中图分类号 :R735.2 文献标识码 :A Genetic inhibition of on proliferation, migration and 鄢 invasion of gastric cancer cells Nai-kuo Zhao 1,Qing-jun Hu 1, Chao-hui Shi 2 (1. Department of Gastroenterology, People's Hospital of Jiaozuo City, Jiaozuo, Henan , China; 2. Huaihai Hospital Affiliated to Henan University, Kaifeng, Henan , China) Abstract: Objective To investigate the effect of genetic inhibition of on proliferation, migration and invasion of gastric cancer cells. Methods Human gastric cancer cell line SGC-7901 were cultured and were divided into sirna- 琢 -catulin group, sirna sequence control group and negative control group. MTT and Transwell assay were performed to measure cell proliferation and cell invasion, respectively. The levels of 琢 -catulin, N-cadherin, E-cadherin and Vimentin were determined by Western blot. Results MTT results indicated that optical density value at 24 h, 48 h, 72 h and 96 h in the sirna- 琢 -catulin group were significantly lower than that of sirna-control sequence group and negative control group ( <0.05). The amount of migrating cells and invasive cells in sirna- 琢 -catulin group were decreased dramatically compared with sirna-control sequence group and blank control group ( <0.05). Expression levels of 琢 -catulin, N- cadherin and Vimentin in sirna- 琢 -catulin group decreased while E-cadherin increased significantly when compared with sirna -control sequence group and blank control group ( < 0.05). Conclusion Genetic knockdown of gene in SGC-7901 cell line could prevent cell proliferation, migration and invasion by inhibition of transition of epithelial-mesenchymal. 收稿日期 : 鄢基金项目 : 河南省 2015 年科技发展计划 (No: ) 27

2 中国现代医学杂志 第 27 卷 Keywords: gastric cancer; ; cell proliferation; cell invasion; epithelial-mesenchymal transit 胃癌作为发病率高 致死率高的消化道恶性肿 瘤, 由于发病隐匿, 早期症状不明显且缺乏有效的筛 查方法, 多数患者临床确诊时已进展至中晚期, 错失 最佳的治疗时机 [1], 即使患者接受手术切除治疗, 由 于肿瘤复发 转移率高,5 年生存率仅 20% 左右 [2] 目 前, 影响胃癌复发 转移相关机制尚未完全清楚, 因 此, 从分子生物学方面积极探讨相关机制以指导治 疗, 对延长患者生命, 改善预后具有重要意义 α- catulin 作为一种细胞骨架连接蛋白, 在 Rho 信号通 路中发挥重要作用, 与炎症反应 细胞凋亡 骨架重 建 细胞迁移与侵袭以及上皮 - 间质转化等过程密 切相关 [3], 有研究指出 [4], 上皮 - 间质转化在胃癌细 胞转移 侵袭 抗凋亡和耐药中发挥重要作用 本研 究拟利用小分子干扰 RNA 技术 (small interference RNA,siRNA) 特异性下调人胃癌细胞 SGC-7901 中 α-catulin 基因表达, 探讨其对细胞增殖 迁移及侵 袭能力的影响, 以及可能的机制, 以期为胃癌机制研 究提供基础资料 1 材料与方法 1.1 主要试剂和设备 人胃癌细胞 SGC-7901( 购自美国 ATCC),RPMI 1640 细胞培养基 优质胎牛血清及胰蛋白酶 ( 购自 美国 Gibco 公司 ),Lipofectamine 2000 转染试剂盒 ( 购自美国 Invitrogen 公司 ),sirna-α-catulin 和 sirna- 对照序列 ( 上海吉玛制药技术有限公司设计 合成 ),MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 ECL 显色试剂盒 ( 购自碧云天生物技术公司 ), 二甲基亚 砜 (DMSO)( 购自北京索莱宝科技公司 ),Transwell 小室 ( 购自美国 Corning 公司 ), 兔抗人 α -catulin 多 克隆抗体 ( 购自上海万疆生物公司 ), 兔抗人 N- 钙 粘蛋白 (N-cadherin) 多克隆抗体 鼠抗人 E- 钙粘蛋白 (E-cadherin) 多克隆抗体 ( 购自美国 Santa Cruz 公司 ), 兔抗人波形蛋白 (Vimentin) 单克隆抗体 ( 购 自美国 Cell Signaling 公司 ), 实时荧光定量 PCR 仪 ( 购自 ABI 公司 ), 凝胶电泳分析系统 ( 购自美国 Biorad 公司 ) 1.2 方法 细胞培养和分组处理将人胃癌细胞 SGC 置于含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 细胞培养 基中, 于含 5% 二氧化碳 CO 2 的 37 恒温培养箱中培 28 养, 待细胞融合度达 85% 时, 用胰酶消化后, 传代培 养, 取 3~5 代细胞进行实验 按照 Lipofectamine TM 2000 转染试剂盒说明书对细胞进行转染, 根据转染 物不同将细胞分为 3 组 :1siRNA-α-catulin 组 转 染 α-catulin 干扰序列 : 正向 5'-CCAUUAACAUCAC CAACAATT-3', 反向 5'-UUGUUGGUGAUGUUAAU GGTT-3';2 sirna- 对照序列组 转染阴性对照序 列 : 正向 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3', 反 向 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3';3 空白对 照组 不做任何处理 转染后于含 5% CO 2 的 37 恒 温培养箱中继续培养, 完成后续实验 不同转染组细胞增殖能力检测取各转染组 细胞, 胰酶消化后, 调整细胞密度为 个 /ml, 接种于 96 孔板, 每孔 100 μl, 于含 5%CO 2 的 37 恒 温培养箱中进行培养, 分别于培养 和 96 h 时, 向各孔加入 MTT 液 ( 浓度 5g/L)20 μl,37 孵 育 6h, 去除上清液, 再加入 200 μl 的 DMSO, 于摇 床上振荡 15 min, 使沉淀溶解充分, 利用全自动酶标 仪取 490 nm 波长处对各孔吸光度 A 值进行检测 Transwell 法检测细胞迁移能力取各转染 组转染后培养 48 h 细胞, 调整细胞密度为 个 /ml, 取细胞悬液 200μl 加入 Transwell 小室 上室, 将 600 μl 含 20% 胎牛血清的 RPMI 1640 培 养液加入下室, 于 37 恒温培养箱中培养 24h, 取出 小室, 用棉签将上室中散落的细胞轻轻擦去, 甲醇固 定, 结晶紫染色后, 用倒置显微镜进行观察, 随机选 取 5 个高倍视野计数穿膜细胞数, 取均值作为迁移 细胞数 [5] Transwell 法检测细胞侵袭能力取 Matrigel 胶铺于 Transwell 小室中, 风干备用 其余步骤同 Western blot 检测各转染组细胞中 α-catulin N-cadherin E-cadherin 和 Vimentin 蛋白表达 各转染组转染后培养 48h 细胞, 加入细胞裂解液, 用 总蛋白提取试剂盒对细胞中总蛋白提取, 利用 BCA 蛋白定量检测试剂盒检测蛋白纯度并定量 取 50 μg 总蛋白, 进行 SDS-PAGE 电泳, 电转移至 PVDF 膜, 用 5% 脱脂奶粉 4 封闭 5h, 用 TBST 液漂洗 3 次, 加入一抗兔抗人 α-catulin 多克隆抗体 兔抗人 N- cadherin 多克隆抗体 鼠抗人 E-cadherin 多克隆抗 取

3 迁移和侵袭的影响 赵乃阔 等 下调 α-catulin 基因表达对胃癌细胞增殖 第 27 期 体 兔抗人 Vimentin 单克隆抗体 稀释比例分别为 及 过夜孵 3 组 细 胞 中 α-catulin N-cadherin E-cadherin 和 Vimentin 蛋白相对表达量差异有统计学意义 = 室温下孵育 4 h 利 育 TBST 液漂洗 3 次 加入二抗 利用 Image 用 ECL 显色试剂盒避光反应 15 min 拍照 和 均 J 图像分析软件分析细胞中 α-catulin N-cadherin α-catulin 组 细 胞 中 α-catulin N-cadherin 及 Vi- 与 sirna- 对照序列组和空白对照组比较 sirna- E-cadherin 和 Vimentin 蛋白相对表达量 统计学方法 数据处理采用 SPSS 21.0 统计软件 计量资料以 均数±标准差 x±s 表示 比较采用方差分析 两两 比较用 LSD- 检验 <0.05 为差异有统计学意义 2 =0.000 其中 结果 2.1 各组细胞增殖能力比较 sirna-α-catulin 组 sirna- 对照序列组 空白对照组 24 h sirna-α-catulin 组细胞 和 96 h 时 48 h 72 h 96 h 时间 吸光度 A 值均低于 sirna- 对照序列组和空白对照 图 1 各转染组细胞增殖能力比较 组 差异有统计学意义 <0.05 提示 sirna-α见图 1 catulin 组细胞增殖能力被抑制 表 1 各转染组细胞迁移和侵袭能力比较 x±s 2.2 各转染组细胞迁移和侵袭能力比较 3 组转染组迁移细胞数和侵袭细胞数差异有统 计学意义 = 和 均 =0.000 其中 与 sirna- 对照序列组和空白对照组比较 sirnaα-catulin 组迁移细胞数和侵袭细胞数均降低 差 异有统计学意义 <0.05 见表 1 和图 组别 迁移细胞数 侵袭细胞数 sirna-α-catulin 组 117.6± ± sirna- 对照序列组 179.5± ±10.2 空白对照组 182.3± ±9.5 值 值 各 转 染 组 细 胞 中 α-catulin N-cadherin E-cadherin 和 Vimentin 蛋白表达比较 A sirna-α-catulin 组 1 2 注 1 与空白对照组比较 < 与 sirna- 对照序列组比 较 <0.05 B sirna- 对照序列组 C 空白对照组 图 2 各转染组细胞迁移能力比较 结晶紫 400 A sirna-α-catulin 组 B sirna- 对照序列组 图 3 各转染组细胞侵袭能力比较 结晶紫 C 空白对照组

4 中国现代医学杂志 第 27 卷 mentin 蛋白相对表达量均降低, 而 E-cadherin 蛋白相 对表达量增加, 差异有统计学意义 ( <0.05), 见表 2 和图 4 表 2 各转染组细胞中 α-catulin N-cadherin E-cadherin 和 Vimentin 蛋白表达比较 (x±s) 组别 α-catulin 蛋白 N-cadherin 蛋白 E-cadherin 蛋白 Vimentin 蛋白 sirna-α-catulin 组 0.26±0.07 1)2) 0.32±0.08 1)2) 0.59±0.12 1)2) 0.43±0.14 1)2) sirna- 对照序列组 0.73± ± ± ±0.13 空白对照组 0.75± ± ± ±0.15 值 值 注 :1) 与空白对照组比较, <0.05;2) 与 sirna- 对照序列组比较, < 达被成功抑制 琢 -catulin [11] 有研究指出,α-catulin 可通过改变细胞周期 中的关键性基因而抑制肿瘤细胞衰老, 加速细胞增 N-cadherin 殖 本研究 MTT 细胞增殖结果显示,siRNA-αcatulin 组细胞 和 96h 时吸光度 A 值均低 E-cadherin 于 sirna- 对照序列组和空白对照组, 说明特异性沉 默胃癌细胞中 基因后, 细胞增殖能力被抑 Vimentin GAPDH 制, 提示 α-catulin 可能参与胃癌细胞增殖过程 本研究显示, 与 sirna- 对照序列组和空白对照组比 较,siRNA-α-catulin 组迁移细胞数和侵袭细胞数 1:siRNA-α-catulin 组 ;2:siRNA- 对照序列组 ;3: 空白对照组 均降低, 说明特异性沉默胃癌细胞中 α-catulin 基因 图 4 各转染组细胞中 α-catulin N-cadherin E-cadherin 和 Vimentin 蛋白表达 [12] 可有效抑制细胞迁移 侵袭能力 研究表明, 上皮 - 间质转化与肿瘤细胞增殖 迁移 侵袭能力密切相 关 N-cadherin E-cadherin 和 Vimentin 是上皮 - 间 3 讨论 质转化特异性标志物, 发生上皮 - 间质转化时,Ncadherin 胃癌发病率 致死率均位居我国消化道肿瘤首 Vimentin 表达升高, 而 E-cadherin 表达被抑 位, 具有发病率高 确诊晚 转移率高及预后较差等 [13] 制 本研究结果显示,siRNA-α-catulin 组细胞中 [6] [7] 特点, 研究表明, 胃癌复发 转移是导致患者死亡 N-cadherin Vimentin 蛋白表达被抑制, 而 E-cadherin 的主要因素 因此, 积极探讨影响胃癌侵袭 转移的 蛋白表达量增加, 说明特异性沉默 基因上 相关机制对治疗和预后具有重要意义 α-catulin 作 皮 - 间质转化过程被抑制 为 Rho 信号通路中重要组件, 由 CTNNAL1 基因编码, 综上所述, 特异性沉默人胃癌细胞 SGC-7901 中 其蛋白结构中含有与 α- 连环蛋白 (α-actinin) 和黏基因表达可有效抑制细胞增殖 迁移和侵着斑蛋白 (Vinculin) 结合位点, 与炎症 细胞衰老 凋袭能力, 其机制可能与抑制上皮 - 间质转化过程有关 [8] [9] 亡及骨架重构等过程密切相关, 有研究指出,αcatulin 在头颈部鳞癌中呈高表达 CAO 等指出, [10] 参 考 文 献 : α-actinin 与鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭密切相关, 可作为癌症患者预后的标志物和未来的治疗靶标 [1] PETRELLI F, BERENATO R, TURATI L, et al. Prognostic value 本研究利用 sirna 技术特异性沉默人胃癌 SGC-7901 of diffuse versus intestinal histotype in patients with gastric cancer: a systematic review and meta-analysis[j]. J Gastrointest Oncol, 细胞中 基因, 结果显示,siRNA-α-catulin 2017, 8(1): 组细胞中 α-catulin 蛋白表达量低于 sirna- 对照 [2] GADDE R, TAMARIZ L, HANNA M, et al. Metastatic gastric 序列组和空白对照组, 提示细胞中 基因表 cancer (MGC) patients: Can we improve survival by metastasecto- 30

5 第 27 期 赵乃阔, 等 : 下调 α-catulin 基因表达对胃癌细胞增殖 迁移和侵袭的影响 my? A systematic review and meta-analysis[j]. J Surg Oncol, 2015, 112(1): [3] BEAR MD, LIU T, ABUALKHAIR S, et al. Alpha-catulin colocalizes with vimentin intermediate filaments and functions in pulmonary vascular endothelial cell migration via ROCK[J]. J Cell Physiol, 2016, 231(4): [4] 杨柳, 石燕, 戴广海. 上皮细胞间质化在胃癌发生发展中的作用 [J]. 解放军医学院学报,2016, 37(3): [5] 于路平, 刘春雷, 李清, 等. 性别决定区 Y 框蛋白 18 在前列腺癌中的表达及其对细胞功能的影响 [J]. 中华泌尿外科杂志,2017, 38(2): [6] VEISANI Y, DELPISHEH A. Survival rate of gastric cancer in iran; a systematic review and meta-analysis [J]. Gastroenterol Hepatol Bed Bench, 2016, 9(2): [7] OKUGAWA Y, MOHRI Y, TANAKA K, et al. Metastasis-associated protein is a predictive biomarker for metastasis and recurrence in gastric cancer[j]. Oncol Rep, 2016, 36(4): [8] 马雪, 张斌, 韩春耀, 等. 下调 α-catulin 基因的表达对舌鳞癌细胞株 Tscca 侵袭及迁移能力影响的体外研究 [J]. 山东大学学报 ( 医学版 ), 2016, 54(6): [9] 邱波, 张卓, 申道福, 等. 头颈部鳞癌中 α-catulin 表达的临床病理和预后意义 [J]. 中国医科大学学报,2015, 44(12): [10] CAO C, CHEN Y, MASOOD R, et al. α-catulin marks the invasion front of squamous cell carcinoma and is important for tumor cell metastasis[j]. Mol Cancer Res, 2012, 10(7): [11] FAN L C, CHIANG W F, LIANG C H, et al. α-catulin knockdown induces senescence in cancer cells [J]. Oncogene, 2011, 30(23): [12] 白一禾, 秦兆宇, 贺福初, 等.HMG20A 对肝癌细胞体外增殖与迁移的影响及其机制 [J]. 复旦学报 ( 医学版 ),2016,43(4): [13] JI L, ZHANG B, ZHAO G. Liver X receptor α (LXRα) promoted invasion and EMT of gastric cancer cells by regulation of NF-κB activity[j]. Hum Cell, 2017, 30(2): ( 王荣兵编辑 ) 31

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