2183 (colagentypeialpha1,col1a1) 是细胞外基质 (ex tracelularmatrix,ecm) 的重要组成成分, 对细胞的黏附和分化有重要作用, 研究发现,COL1A1 基因在乳腺导管癌和乳腺小叶癌中均有不同程度的高表达, 并且可能与乳腺癌的发生和转移存在一定相关

Size: px

Start display at page:

Download "2183 (colagentypeialpha1,col1a1) 是细胞外基质 (ex tracelularmatrix,ecm) 的重要组成成分, 对细胞的黏附和分化有重要作用, 研究发现,COL1A1 基因在乳腺导管癌和乳腺小叶癌中均有不同程度的高表达, 并且可能与乳腺癌的发生和转移存在一定相关"

兴白
5 years ago
Views:

1 2182 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2012,28(12): [ 文章编号 ] (2012) 靶向 COL1A1 基因的 shrna 对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞增殖与凋亡的影响余海浪 1, 刘安玲 1, 周珏宇 1, 孟伟 1, 郑文岭 2 1, 马文丽 ( 1 南方医科大学基因工程研究所, 广东广州 ; 2 华南基因组研究中心, 广东广州 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨抑制 Ⅰ 型胶原 α1 链 (COL1A1) 基因表达对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞增殖及凋亡的影响方法 : 用已构建的 psilencer2.1-u6-col1a1 重组质粒转染乳腺癌细胞 MDA-MB-231, 采用 RT-PCR 和 Westernbloting 技术检测重组质粒对 COL1A1 基因表达的影响,MTT 比色法测定细胞增殖的抑制情况, 流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡的变化,Hoechst33258 荧光染色观察细胞凋亡的形态学变化结果 :RT-PCR 及 Westernbloting 结果证实重组质粒在 mrna 和蛋白水平分别显著抑制 COL1A1 基因表达 ;pshrna-col1a1 转染组细胞的增殖速度明显减慢且呈时间依赖关系 ; 与对照组相比,pshRNA-COL1A1 组细胞明显阻滞于 G 0 /G 1 期, 细胞凋亡率显著升高 (P<0.05), 出现细胞质浓缩核凝聚等凋亡形态学变化结论 :pshrna-col1a1 能有效抑制乳腺癌 MDA-MB-231 细胞增殖, 并诱导其凋亡, 为以 COL1A1 为靶点的乳腺癌基因治疗提供实验依据 [ 关键词 ] RNA 干扰 ;I 型胶原 α1 链 ; 乳腺肿瘤 ; 细胞凋亡 [ 中图分类号 ] R737.9 [ 文献标志码 ] A doi: /j.isn EfectsofshRNA targetingcol1a1geneonproliferationandapoptosis ofhumanbreastcancercellinemda-mb-231 YUHai-lang 1,LIUAn-ling 1,ZHOUJue-yu 1,MENGWei 1,ZHENGWen-ling 2, MAWen-li 1 ( 1 InstituteofGeneticEnginering,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China; 2 SouthChinaGenomicsRe searchcenter,guangzhou510800,china. wenli668@gmail.com) [ABSTRACT] AIM:ToinvestigatetheefectsofshRNA-mediatedcolagentypeIalpha1(COL1A1)genesi lencingontheproliferationandapoptosisofhumanbreastcancercellinemda-mb-231.methods:thespecificre combinantvectorpsilencer2.1-u6-col1a1wastransientlytransfectedintohumanbreastcancercellinemda-mb- 231withlipofectamine.RT-PCRandWesternblotingwereperformedtodetecttheexpresionlevelsofCOL1A1.MTT asaywasemployedtoevaluatetheefectofcol1a1genesilencingonthecelproliferation.flowcytometrywasusedto determinetheapoptosisandcelcycleoftransfectedcels.themorphologicalcharacteristicsofapoptosiswereobservedby Hoechst33258staining.RESULTS:Comparedwithmockgroupandscrambledgroup,themRNAandproteinlevelsof COL1A1werereducedbypshRNA-COL1A1transfection(P<0.05).TheproliferationofMDA-MB-231celstreated inshrna-col1a1wassignificantlyinhibitedinatime-dependentway.thepercentagesofg 0 /G 1 phasecelsandearly apoptoticrateweresignificantlyhigherinpshrna-col1a1groupthanthoseinmockandscrambledgroup(p<0.05). Thechangesofapoptoticmorphologysuchascelshrinkageandnuclearcondensationwerealsoobservedbystainingwith Hoechst33258underfluorescencemicroscope.CONCLUSION:TransfectionofeukaryoticexpresionvectorpshRNA- COL1A1efectivelyinhibitstheproliferation,inducesapoptosisandarestsMDA-MB-231celsinG 0 /G 1 phase. [KEYWORDS] RNAinterference;ColagentypeI,alpha1chain;Breastneoplasms;Apoptosis 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤, 远处转移已成为乳腺癌患者死亡的主要原因 Ⅰ 型胶原 α1 链 [ 收稿日期 ] [ 修回日期 ] [ 基金项目 ] 广东省医学科研基金资助项目 (No.B ) 通讯作者 Tel: ; wenli668@gmail.com

2 2183 (colagentypeialpha1,col1a1) 是细胞外基质 (ex tracelularmatrix,ecm) 的重要组成成分, 对细胞的黏附和分化有重要作用, 研究发现,COL1A1 基因在乳腺导管癌和乳腺小叶癌中均有不同程度的高表达, 并且可能与乳腺癌的发生和转移存在一定相关性 [1-2] RNA 干扰 (RNAinterference,RNAi) 是一种由双链 RNA(dsRNA) 介导的基因表达抑制途径, 具有高效性高稳定性和高特异性的优点 [3-4], 近来已经在功能基因组学研究和基因治疗方面取得了巨大进展 [5-7] 本研究利用靶向 COL1A1 的特异性 sir NA 真核表达载体 pshrna-col1a1, 瞬时转染人乳腺癌细胞 MDA-MB-231, 探讨 pshrna-col1a1 重组质粒对细胞体外增殖及凋亡的影响材料和方法 1 材料人乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 由本研究所保存 ;psilencer2.1-u6-col1a1( 以下简称 pshr NA-COL1A1) 重组质粒由本实验室前期构建 ;Lipo fectamine TM 2000 购自 Invitrogen; 胎牛血清购自杭州四季青公司 ;RPMI-1640 培养基购自 Gibco;MTT Hoechst33258 和 PI 均购自 Sigma;PrimeScriptRTre agentkit 购自 TaKaRa;COL1A1 鼠抗人多克隆抗体兔抗人 β-actin 单克隆抗体购自 SantaCruz;HRP 标记的羊抗鼠 IgG 和 HRP 标记的羊抗兔 IgG 购自北京中山公司 ;AnnexinV-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司 2 方法 2.1 细胞培养 MDA-MB-231 细胞用含 10% 胎牛血清无抗生素的 RPMI-1640 培养基 37 5% CO 2 条件下培养观察细胞生长情况, 每 2~3d 用胰酶消化, 传代培养 2.2 重组质粒转染当贴壁细胞汇合达 90% ~ 95%, 用无血清培养基洗 3 次, 将细胞分为脂质体对照组 (mock) 空载体组 (emptyvector) 阴性对照组 (scrambled) 及重组质粒处理组 (pshrna - COL1A1) 参照 Lipofectamine TM 2000 转染试剂说明书操作,72h 后收集细胞分别用蛋白裂解液及 Trizol 试剂提取总蛋白及总 RNA 备用 2.3 半定量 RT-PCR 检测 COL1A1mRNA 表达水平取上述总 RNA 进行逆转录,PCR 扩增 COL1A1 和内参照 β-actin COL1A1 引物序列 : 正义链 5 - CGATGGATTCCAGTTCGAGT-3, 反义链 5 - TTTTGAGGGGGTTCAGTTTG-3, 扩增片段长度 496 bp; 反应条件 :94 30s,60 30s,72 60s,30 个循环后,72 5min 2.4 Westernbloting 检测 COL1A1 蛋白表达水平取上述总蛋白进行 SDS-PAGE 凝胶电泳, 转膜后 NC 膜依次与 COL1A1 Ⅰ 抗 (1 200) β -actin (1 1000) 羊抗鼠 IgG/HRP 及羊抗兔 IgG/HRP 孵育, 常规曝光, 显影定影, 直至显示出电泳带, 用凝胶扫描成像系统进行半定量分析 2.5 MTT 检测细胞增殖取对数生长期的各组细胞, 用含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 制成细胞悬液, 以每孔个细胞接种于 96 孔培养板中培养, 分别在 24h 48h 72h 96h 120h 144h 和 168 h 后, 每孔加入 5g/LMTT 溶液 20μL, 振荡混匀, 避光状态下 37 5%CO 2 培养箱中继续孵育 4h, 终止培养 ; 弃孔内培养上清液后, 每孔加入 150μLDM SO, 振荡 10min 溶解结晶酶标仪检测 570nm 波长吸光度 A 值, 每组 5 个复孔, 实验重复 3 次 2.6 流式细胞术检测细胞周期取对数生长期的各组细胞, 用 PBS 制成单个细胞悬液 ; 加预冷的 75% 乙醇, 快速混匀,4 固定 1h;PBS 洗涤 3 次, 每次加 PBS2.5mL,1000r/min 离心 5min; 调整细胞浓度, 每份样品细胞数目约为 ; 加入 50μLRNase (10mg/L) 和 200μLPI(5mg/L), 室温下避光染色 30min; 检测前, 细胞经 300 目滤网过滤 ; 流式细胞仪进行细胞周期检测, 用 CelQuest 软件收取细胞 ( 每份样品至少取个细胞 ), 并分析细胞周期, 结果以细胞周期各时相细胞的百分率表示 2.7 细胞凋亡的形态学观察 (Hoechst33258 染色 ) 收集处理组细胞及对照组细胞 ( /L), 均匀滴至载波片上并用滤纸吸去多余液体, 干燥滴加 50% 固定液 (3 1 甲醇 / 乙酸 ) 固定 15min, 用 PBS 洗 2 次, 室温下再用 1mg/LHoechst33258 染液避光染色 10min, 再用 PBS 洗 2 次染色后的细胞在激发波长 348nm/ 发射波长 480nm 的紫外荧光显微镜下观察 2.8 流式细胞术检测细胞凋亡 (AnnexinV-FITC/ PI 染色法 ) 取对数生长期的各组细胞, 用 PBS 制成单个细胞悬液 ;PBS 洗涤 3 次, 每次加 PBS2.5 ml,1000r/min 离心 5min; 调整细胞浓度, 约取个细胞重悬于 1mL1 bindingbufer; 取 100μL 悬液, 加 5μLAnnexinV-FITC 和 5μLPI, 室温反应 15min; 加 400μL1 bindingbufer, 上流式细胞仪测定荧光含量

3 统计学处理采用 SPSS13.0 软件进行统计处理, 数据用均数 ± 标准差 ( x±s) 珋表示, 组间差异用单因素方差分析, 组间多重比较用 LSD 检验, 以 P<0.05 为差异有统计学意义结果 2 特异性 pshrna-col1a1 抑制 MDA-MB- 231 细胞 COL1A1 蛋白表达 Westernbloting 结果显示, 转染 pshrna - COL1A1 重组质粒的细胞中 COL1A1 蛋白抑制率为 66.98% ±2.08%, 显著高于脂质体对照组和阴性对照组 (P<0.05), 见图 2 1 特异性 pshrna-col1a1 抑制 MDA-MB- 231 细胞 COL1A1mRNA 表达 RT-PCR 结果显示, 转染 pshrna-col1a1 重组质粒的细胞 COL1A1mRNA 显著低于阴性对照组 (P<0.05), 抑制率为 63.05% ±3.13%, 而阴性对照与脂质体组比较无显著差异 (P>0.05), 见图 1 Figure2. TheresultsofWesternblotinganalysisofCOL1A1 proteinexpresioninmda-mb-231cels. x±s.n 珋 =3. P<0.05vsmockorscrambledgroup. 图 2 Westernbloting 检测 pshrna-col1a1 转染后乳腺癌 MDA-MB-231 细胞 COL1A1 蛋白的表达 Figure1.TheresultsofRT-PCRanalysisofCOL1A1mRNA expresioninmda-mb-231cels. x±s.n=3. 珋 P <0.05vsmockorscrambledgroup. 图 1 RT-PCR 检测 pshrna-col1a1 转染后乳腺癌 MDA-MB-231 细胞 COL1A1mRNA 的表达 3 特异性 pshrna-col1a1 抑制 MDA-MB- 231 细胞的生长用 MTT 法检测 24h~168h 细胞的生长状况, 发现 pshrna-col1a1 转染组细胞增殖减慢, 除 24h 外, 其余各时点 A 值均显著低于阴性对照及脂质体对照 (P<0.05), 并呈时间依赖性, 见表 1 而阴性对照与脂质体对照组细胞体外增殖活性无明显差异 (P>0.05) 表 1 MTT 法检测 pshrna-col1a1 对 MDA-MB-231 细胞增殖的影响 Table1.TheefectofpshRNA-COL1A1ontheproliferationofMDA-MB-231celsdetectedbyMTTasay(A 570. x±s.n=5) 珋 Group 24h 48h 72h 96h 120h 144h 168h Mock 0.29± ± ± ± ± ± ±0.12 Scrambled 0.28± ± ± ± ± ± ±0.28 shrna-col1a1 0.27± ± ± ± ± ± ±0.11 P<0.05, P<0.01vsmockorscrambledgroup.

２１８５４特异性ＲＮＡＣＯＬ１Ａ１对ＭＤＡＭＢ２１２与脂质体组和阴性对照组细胞比较ＲＮＡ细胞周期的影响ＣＯＬ１Ａ１转染组ＧＧ１期细胞数显著增多Ｓ期细胞流式细胞术检测各组细胞周期的变化见图表数显著减少Ｐ５细胞明显阻滞于ＧＧ１期ＦＤｆｆｆｂｆｗｍＡｍｋＢｄＣ图流式细胞术检测各组细胞的细胞周期表２

4 ２１８５４特异性ＲＮＡＣＯＬ１Ａ１对ＭＤＡＭＢ２１２与脂质体组和阴性对照组细胞比较ＲＮＡ细胞周期的影响ＣＯＬ１Ａ１转染组ＧＧ１期细胞数显著增多Ｓ期细胞流式细胞术检测各组细胞周期的变化见图表数显著减少Ｐ５细胞明显阻滞于ＧＧ１期ＦＤｆｆｆｂｆｗｍＡｍｋＢｄＣ图流式细胞术检测各组细胞的细胞周期表２流式细胞术检测各组细胞的细胞周期和凋亡Ｔｂ２ＴｆｗｍｄｆｍｄａＭＢ２１ｄｘ珋± ＳＧ２ＭＭｋ４± ５２５５±１９８２５±２７４１６２２±１１４Ｓｄ４７２± ７８５４１８± ４７２６５６±２５４ＧＡＧＧ１ＲＮＡＣＯＬ１Ａ１１２９± ４６９８±２９４１５４± ７１１９２７± ９７２６２± ９９Ｆ４ＭｆｍｄａＭＢ２１ｄｄｂＲＮＡＣＯＬ１Ａ１４Ｐ５ｖｍｋｄ５细胞凋亡的形态学观察用Ｈ２５８对ＭＤＡＭＢ２１细胞进行ＡｍｋＢｄＣ图４特异性ＲＮＡ作用后ＭＤＡＭＢ２１细胞形态学变化活细胞荧光染色结果如图４所示脂质体组和阴６特异性ＲＮＡＣＯＬ１Ａ１对ＭＤＡＭＢ２１性对照组细胞呈圆形或椭圆形染色质均匀分布细细胞凋亡的影响ＲＮＡＣＯＬ１Ａ１组胞核荧光较弱且着色均匀各组转染７２后流式细胞术检测结果表明重细胞核固缩核染色质浓缩箭头所示细胞在形态学组质粒ＲＮＡＣＯＬ１Ａ１组的细胞凋亡率显著高于上出现明显的凋亡特点表现为核浓染致密的颗粒脂质体对照组和阴性对照组Ｐ５见表２块状荧光或碎片样荧光图５Ｆ５ＤｆｆｂｆｗｍＡｍｋＢｄＣ图５流式细胞术检测各组细胞的凋亡率

5 2186 讨 ECM 是肿瘤细胞侵袭转移的天然屏障, 肿瘤细胞发生侵袭转移, 必须以运动功能为动力, 穿透 ECM COL1A1 基因全长 17537bp, 含有 51 个外显子, 位于染色体 17q21.33, 编码 I 型胶原纤维的前 α1 论链,COL1A2 基因编码 α2 链 I 型胶原纤维前体是由 2 条 α1 链和 1 条 α2 链形成的三聚体结构, 是 ECM 的重要组成成分, 对细胞的黏附分化有重要作用 I 型胶原纤维主要存在于人体的结缔组织中, 在骨组织皮肤中含量较多 [8] 近年来有报道称, 在乳腺癌的发生发展过程中存在 COL1A1 基因的异常表达, 并且可能与肿瘤细胞的增殖和迁移及肿瘤的预后相关 [1-2,9-11] 本研究通过 shrna 抑制 COL1A1 基因的表达后, 对体外培养的 MDA-MB-231 细胞增殖细胞周期和细胞凋亡的影响 RT-PCR Westernbolting 等证实上述质粒可在 mrna 及蛋白质水平显著抑制 COL1A1 表达, 肿瘤细胞生长受到抑制细胞周期和细胞的生长密切相关, 细胞周期过程为 G 0 /G 1 S G 2 /M 期,G 0 /G 1 期为 DNA 合成前期, 标志细胞进入增殖态, 增殖旺盛的细胞 G 0 /G 1 期持续时间短,S 期为 DNA 合成复制期,G 2 /M 期分别为 DNA 合成后期及有丝分裂期采用流式细胞术分析 RNAi 对人乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 的生长抑制作用与细胞周期的关系, 结果显示 pshrna-col1a1 组转染 72h 后 G 0 /G 1 期细胞比率明显高于其它 2 组提示肿瘤细胞中 COL1A1 基因被抑制后, 影响细胞的细胞周期正常移行, 阻止 G 0 /G 1 期细胞进入 S 期, 造成 pshrna-col1a1 组 G 0 /G 1 期细胞聚集,S 期细胞减少, 从而影响细胞的正常生长同时, 利用 Ho echst33258 染色和 AnnxeniV-FITC 检测细胞的凋亡情况结果显示 pshrna-col1a1 组细胞核固缩核染色质浓缩, 细胞核呈浓染致密的颗粒块状荧光和核裂解块状荧光, 细胞形态呈现出凋亡的典型变化而且, 与 mock 组和 scrambled 组相比,pshRNA -COL1A1 组细胞凋亡明显增多, 凋亡率达 13 29% ±0.43%, 提示 shrna-col1a1 转染介导 COL1A1 表达沉默可以显著促进乳腺癌 MDA-MB-231 细胞发生早期凋亡综上所述, 利用 RNAi 技术沉默 COL1A1 基因表达后, 能有效抑制 MDA-MB-231 细胞的生长, 并诱导其凋亡, 为后续研究 COL1A1 基因在乳腺癌 MDA-MB-231 细胞中的功能提供一定的实验依据, 但 COL1A1 基因对乳腺癌细胞的生长和凋亡作用的具体分子机制还有待进一步实验探索 [ 参考文献 ] [1] TurashvililG,BouchalJ, Baumforth K, etal. Novel markersfordiferentiationoflobularandductalinvasive breastcarcinomasbylasermicrodisectionandmicroaray analysis[j].bmccancer,2007,7:55. [2] MurabitoJM,RosenbergCL,FingerD,etal.Agenome -wideasociationstudyofbreastandprostatecancerin thenhlbi'sframingham HeartStudy[J].BMC Med Genet,2007,8(Supp1):S6. [3] PaddisonPJ,CaudyAA,BernsteinE,etal.Shorthair pinrnas(shrnas)inducesequence-specificsilencing inmammaliancels[j].genesdev,2002,16(8): [4] SuiG,SoohooC,AfarelB,etal.ADNAvector-based RNAitechnologytosuppresgeneexpresioninmammali ancels[j].procnatlacadsciusa,2002,99(8): [5] DuxburyMS,WhangEE.RNAinterference:apractical approach[j].jsurgres,2004,117(2): [6] ScherM,MorganMA,EderM.Genesilencingmediated bysmalinterferingrnasinmammaliancels[j].cur MedChem,2003,10(3): [7] 孙莹, 于浩, 张灵, 等.STAT3-siRNA 对胃癌细胞株 SGC-7901 增殖与凋亡的影响 [J]. 中国病理生理杂志,2010,26(2): [8] ReisFC,AlexandrinoF,SteinerCE,etal.Molecular findingsinbrazilianpatientswithosteogenesisimperfecta [J].JApplGenet,2005,46(1): [9] StulRA,TavasoliR,KennedyS,etal.Expresiona nalysisofsecretedandcelsurfacegenesoffivetrans formedhumancellinesandderivativexenografttumors [J].BMCGenomics,2005,6:55. [10] HaradaY,OhuchiN,IshidaT,etal.Tumormarkersin breastcancer[j].gantokagakuryoho,2001,28(7): [11] PerouCM,SorlieT,EisenMB,etal.Molecularportraits ofhumanbreasttumours[j].nature,2000,406(6797):

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽