24 郑州大学学报 ( 医学版 ) 2019 年 1 月第 54 卷第 1 期 doi: /j.issn 异甘草素对小儿血管瘤内皮细胞生物学特性及 PI3K/AKT 信号通路的影响 李燕 1) 2), 张瑞丽 1) 郑州大学附属儿童医院 (

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1 24 doi: /j.issn 异甘草素对小儿血管瘤内皮细胞生物学特性及 PI3K/AKT 信号通路的影响 李燕 1) 2), 张瑞丽 1) 郑州大学附属儿童医院 ( 河南省儿童医院 ; 郑州儿童医院 ) 药学部郑州 ) 中国中医科学院望京医院药学部北京 关键词 血管瘤 ; 异甘草素 ; 血管内皮细胞 ;PI3K/AKT 信号通路 ; 儿童 中图分类号 R725.5 摘要 目的 : 探讨异甘草素对小儿血管瘤内皮细胞生物学特性及 PI3K/AKT 信号通路的影响 方法 : 将培养 的小儿血管瘤内皮细胞分为 4 组, 分别用 和 80μmol/L 异甘草素处理 h, 采用 MTT 法检测细胞活力 处理 72h 后, 采用 Transwel 小室实验检测细胞的侵袭能力, 流式细胞仪检测细胞周期变化和凋亡, 实时荧光定量 PCR 和 Westernblot 检测细胞中 CleavedCaspase 3 Bax CyclinB1 MMP 9 和 p AKTmRNA 和蛋白的表达 结果 : 异甘草素能够呈时间 浓度依赖性地抑制小儿血管瘤内皮细胞生长 ; 随异甘草素作用浓度的升高, 侵袭细胞数和 G0/G1 期细胞百分比均逐渐降低, 而 G2/M 期细胞百分比及细胞凋亡率均逐渐升高 ;CleavedCaspase 3 BaxmR NA 和蛋白表达水平逐渐升高, 而 CyclinB1 MMP 9 p AKTmRNA 和蛋白表达水平逐渐下降 (P<0.05) 结论 : 异甘草素可能通过调控 PI3K/AKT 信号通路抑制小儿血管瘤内皮细胞的生长和侵袭, 诱导细胞周期阻滞, 并促进细胞凋亡 EfectsofisoliquiritigeninonbiologicalcharacteristicsandPI3K/AKT signalingpathwayofinfantilehemangiomaendothelialcels LIYan 1),ZHANGRuili 2) 1)DepartmentofPharmacy,Children shospitalafiliatedtozhengzhouuniversity(henanchildren shos pital;zhengzhouchildren shospital),zhengzhou )DepartmentofPharmacy,WangjingHospi tal,chineseacademyofchinesemedicalsciences,beijing Keywords hemangioma;isoliquiritigenin;vascularendothelialcel;pi3k/aktsignalingpathway;children Abstract Aim:ToinvestigatetheefectsofisoliquiritigeninonbiologicalcharacteristicsandPI3K/AKTsignaling pathwayofinfantilehemangiomaendothelialcels.methods:theculturedinfantilehemangiomaendothelialcelswerealo catedinto4groups,andweretreatedby0,20,40and80μmol/lisoliquiritigeninfor24,48,and72hours,andcelviability wasdetectedbymttmethod.after72hourtreatment,theinvasionabilityofthecelswasdetectedbythetranswelcham bertest,andcelcyclechangesandapoptosisweremeasuredbyflowcytometry.theexpressionsofcleavedcaspase 3, Bax,CyclinB1,MMP 9andp AKTmRNA andproteinincelsweretestedbyqrt PCR andwesternblot.results: Isoliquiritigenininhibitedthegrowthofthecelsinatime andconcentration dependentmanner(p<0.05).withthein creaseofisoliquiritigeninconcentration,thenumberofinvasivecelsandthepercentageofg0/g1phasecelsdecreased gradualy,whilethepercentageofcelsing2/m phasesandapoptosisrateofthecelsincreasedgradualy(p<0.05);the expressionsofcleavedcaspase 3andBaxmRNA andproteinincreasedgradualy,whiletheexpressionsofcyclinb1, MMP 9,p AKTmRNAandproteindecreasedgradualy(P<0.05).Conclusion:Isoliquiritigeninmayinhibitthegrowth andinvasionofinfantilehemangiomaendothelialcels,inducecelcyclearestandpromotecelapoptosisbyregulating PI3K/AKTsignalingpathway. 基金项目 河南省科技攻关计划项目 ( ) 作者简介 李燕, 通信作者, 女,1987 年 2 月生, 本科, 主管药师, 研究方向 : 临床药学, 药事管理,E mail: @qq.com

2 JournalofZhengzhouUniversity(MedicalSciences) Jan Vol.54 No.1 25 血管瘤是一种常发生于婴幼儿皮肤和软组织的先天性良性肿瘤或血管畸形, 大部分可自行消退, 但也有一少部分因生长在特殊部位或体积过大等因素影响到组织或器官功能, 甚至危及生命 血管瘤常见的治疗方法如手术切除 药物治疗和硬化治疗等均不能达到理想的治疗效果, 因此寻找安全有效的治疗手段一直是血管瘤临床研究的热点 血管瘤以血管内皮细胞增生为主, 抑制血管内皮细胞的过度增殖对血管瘤的治疗具有重要意义 异甘草素是一种从中草药甘草中提取的黄酮类化合物, 具有抗氧化 抗炎和抗肿瘤等药理活性, 其抗肿瘤活性已引起人们的重视 [1 2] PI3K/AKT 信号通路是血管形成的重要调节途径, 在血管瘤中异常活化 [3] 近年来 [4 6] 有研究报道, 异甘草素具有抗血管生成的作用, 并能够抑制实体瘤中 PI3K/AKT 信号通路激活, 但其对小儿血管瘤内皮细胞生物学行为和 PI3K/AKT 信号通路的影响尚不清楚 本研究旨在探讨异甘草素对小儿血管瘤内皮细胞生长 侵袭和凋亡的影响及其机制, 以期为儿童血管瘤的临床治疗提供参考 1 材料与方法 1.1 材料小儿血管瘤内皮细胞购自大连美仑生物公司 异甘草素购于美国 Sigma 公司, 纯度 98%, 使用时以 DMSO 溶解 RPMI1640 细胞培养基购于美国 Gibco 公司, 胎牛血清购于杭州四季青生物公司,MTT 试剂购于美国 Promega 公司,DMSO 购于美国 Sigma 公司,RIPA 裂解液 SDS PAGE 凝胶配制试剂盒 BCA 蛋白浓度测定试剂盒 反转录试剂盒和细胞周期检测试剂盒均购于中国碧云天生物技术研究所,AnnexinV FITC/PI 试剂盒购于凯基生物公司,CyclinB1 Bax MMP 9 和 p Akt 抗体均购于美国 Abcam 公司,CleavedCaspase 3 抗体购于武汉博士德公司, 辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG 抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司 流式细胞仪购于美国 BD Pharmingen 公司, 倒置显微镜购于日本 Olympus 公司,Transwel 小室购于美国 Coming 公司, 全自动酶标仪和细胞培养箱购于美国 Thermo 公司, 转膜仪购于美国 Bio RAD 公司 1.2 细胞培养小儿血管瘤内皮细胞复苏后, 用含 100U/mL 青链霉素双抗和体积分数 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培养基, 置于体积分数 5%CO 2 37 的细胞培养箱内常规培养 细胞贴壁后, 每 2d 换液一次, 待细胞铺满瓶底 75% 左右时, 以胰蛋白酶消化传代 1.3 细胞活力检测取 96 孔细胞板, 以每孔 100 μl 接种处于对数生长期的小儿血管瘤内皮细胞, 细胞密度为 个 /ml, 设对照组和低 中 高浓度异甘草素组, 分别用 和 80μmol/L 异甘草素处理, 每组 6 个平行孔, 另设 1 个只含有培养基的空白调零孔 于培养箱内分别培养 和 72h 后, 加入 5g/LMTT 溶液 200μL 再培养 4h 后, 加入 120μLDMSO 反应 10min 上酶标仪检测各组细胞在 490nm 处的吸光度 (A) 值, 细胞存活率 = ( 实验组 A- 空白 A)/( 对照组 A- 空白 A) 100% 实验重复 3 次, 下同 1.4 细胞侵袭能力的检测收集上述培养 72h 的各组细胞, 经 2.5g/L 胰蛋白酶消化后, 更换为无血清的 RPMI1640 培养基, 采用细胞计数设备计数 取 Matrigel 基质胶包被的 Transwel 小室, 在下室中加入 500μL 完全培养基, 上室中加入 400μL 含 10 5 个细胞的细胞悬液, 置于培养箱中培养 24h 后取出 用磷酸盐缓冲液洗涤上层小室, 晾干后于预冷的甲醇中固定 30min 去甲醇并洗涤后, 加入结晶紫染色 20min 洗涤晾干后, 于倒置显微镜下观察 选取 6 个区域计数细胞, 细胞侵袭能力以 6 个区域细胞数的平均数来表示 1.5 细胞周期和凋亡检测取生长良好的小儿血管瘤内皮细胞, 以每孔 个 /ml 的密度接种至 6 孔细胞板, 每孔 100μL 按照 1.3 中的分组处理细胞 72h, 以胰蛋白酶消化后, 加入 500μL 完全培养基终止消化, 转移至离心管中,1000r/min 离心 5 min 经磷酸盐缓冲液洗涤 3 遍后, 分别参照试剂盒说明书的步骤检测细胞周期和凋亡 1.6 PI3K/AKT 信号通路相关分子 mrna 的检测采用实时荧光定量 PCR 法 收集培养 72h 后的各组细胞, 采用 Trizol 法提取总 RNA 用反转录试剂盒以总 RNA 为模板合成 cdna 配制含有 2 μlcdna 8.5μLddH 2 O 12.5μLSYBPPremixEx Taq 和各 1μL 上下游引物的反应体系, 反应条件 : 95 预变性 60s;95 变性 15s,52~62 退火 20 s,72 延伸 70s, 共 40 个循环 采用 2 -ΔΔCt 法计算目的基因 mrna 的相对表达量 其中, 由上海生工生物工程股份有限公司合成的各引物序列见表 PI3K/AKT 信号通路相关分子蛋白的检测采用 Westernblot 检测 收集培养 72h 后的各组细胞, 加入 RIPA 裂解液提取总蛋白, 并根据 BCA 蛋白检测试剂盒测定提取总蛋白的浓度 取 60μg 总蛋白与蛋白上样缓冲液 ( 体积比 5 1) 混匀后置于 95 下反应 10min 采用移液枪将蛋白上样至 SDS PAGE 凝胶中以 80V 电压电泳 2h 转膜后, 放入

3 26 含去脂奶粉的封闭液中反应 1.5h 以封闭液洗涤后, 加入 Cleaved Caspase 3(1 800 稀释 ) Bax (1 500 稀释 ) CyclinB1(1 500 稀释 ) MMP 9 ( 稀释 ) 和 p AKT( 稀释 ) 抗体,4 摇床孵育 24h 以封闭液洗涤后, 再加入辣根过氧化物酶标记的二抗,37 反应 1.5h 洗膜后, 加入 ECL 显影, 凝胶成像系统收集图片, 以 β actin 为内参, 校正目的蛋白的相对表达量 表 1 实时荧光定量 PCR 引物序列 引物名称引物序列 (5 3 ) CleavedCaspase 3 F:AGCGAATCAATGGACTGTGG R:ACCATGGCTCAGAAGCACAC Bax CyclinB1 MMP 9 p AKT β actin F: 上游引物 ;R: 下游引物 F:ACATGGAGCTGCAGAGGAT R:AACCACCCTGGTCTTGGAT F:CGGTGTTCTGCTTCTCCC R:CTTTGTTACCAATGTCCC F:TCAGGGAGACGCCCATTT R:GGCAGGGTTTCCCATCAG F:TTTATTGGCTACAAGGAACG R:AGTCTGAATGGCGGTGGT F:ACACTGTGGCCCATCTACGAGG R:CTTTGCGGATGTCCACGTC 1.8 统计学处理应用 SPSS22.0 处理数据 采用 3 4 析因设计的方差分析比较不同浓度的异甘草素处理不同时间对细胞存活率的影响, 多组间其他指标的比较采用单因素方差分析, 两两比较采用 SNK q 检验, 检验水准 α= 结果 组细胞存活率的比较随异甘草素作用浓度的增加和作用时间的延长, 小儿血管瘤内皮细胞存活率降低, 见表 组细胞侵袭能力的比较处理 72h 后, 对照组侵袭细胞数为 (165.25±8.52), 低 中 高浓度异甘草素组侵袭细胞数减少, 分别为 (137.82± 6.35) (87.65±5.80) 和 (54.37±5.05)(F = ,P=0.002) 表 2 4 组细胞存活率的比较 (n=3) % 组别 24h 48h 72h 对照组 ± ± ±5.58 低浓度异甘草素组 89.62± ± ±3.63 中浓度异甘草素组 75.63± ± ±1.95 高浓度异甘草素组 56.78± ± ±2.32 F 组间 = ,P <0.001;F 时间 =30.221,P <0.001;F 交互 =5.105, P= 组细胞周期分布和细胞凋亡情况比较处理 72h 后, 随异甘草素作用浓度的升高,G0/G1 期细胞百分比逐渐降低, 而 G2/M 期细胞百分比逐渐升高 同时, 异甘草素能够呈浓度依赖性诱导细胞凋亡 见表 3 表 3 4 组细胞周期分布和凋亡率的比较 (n=3) % 组别 细胞周期 G0/G1 S G2/M 细胞凋亡率 对照组 68.78± ± ± ±0.48 低浓度异甘草素组 62.65± ± ± ±1.25 中浓度异甘草素组 55.92± ± ± ±2.62 高浓度异甘草素组 48.65± ± ± ±2.44 F P <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 : 组间两两比较,P< 组细胞 PI3K/AKT 信号通路相关分子 mr NA 及蛋白表达的比较见图 1 随异甘草素作用浓度的增加,CleavedCaspase 3 BaxmRNA 表达水平逐渐升高, 而 CyclinB1 MMP 9 p AKTmRNA 表达水平逐渐下降, 见表 4 PI3K/AKT 信号通路相关分子蛋白的表达结果与 mrna 一致, 见表 5 1~4: 分别为对照组和低 中 高浓度异甘草素组 图 1 4 组细胞 PI3K/AKT 信号通路相关分子蛋白的表达

4 JournalofZhengzhouUniversity(MedicalSciences) Jan Vol.54 No.1 27 表 4 4 组细胞中 PI3K/AKT 信号通路相关分子 mrna 的相对表达量 (n=3) 组别 CleavedCaspase 3 Bax CyclinB1 MMP 9 p AKT 对照组 1.00± ± ± ± ±0.39 低浓度异甘草素组 1.38± ± ± ± ±0.35 中浓度异甘草素组 1.79± ± ±0.30 # 1.89± ±0.21 高浓度异甘草素组 2.25± ± ±0.12 # 1.00± ±0.06 F P <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 : 组间两两比较,P<0.05;#: 与对照组和低浓度异甘草素组比较,P<0.05; : 与中浓度异甘草素组比较,P<0.05 表 5 4 组细胞中 PI3K/AKT 信号通路相关分子蛋白的相对表达量 (n=3) 组别 CleavedCaspase 3 Bax CyclinB1 MMP 9 p AKT 对照组 0.34± ± ± ± ±0.04 低浓度异甘草素组 0.48± ± ± ± ±0.03 中浓度异甘草素组 0.65± ± ±0.02 # 0.28± ±0.02 高浓度异甘草素组 1.17± ± ±0.01 # 0.19± ±0.02 F P <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 : 组间两两比较,P<0.05;#: 与对照组和低浓度异甘草素组比较,P<0.05; : 与中浓度异甘草素组比较,P< 讨论 血管瘤的治疗一直是临床上的棘手问题, 手术切除治疗虽然效果较好, 但在一些特殊器官如眼 鼻和耳等不宜开展, 因此寻找安全有效的治疗药物一直是血管瘤研究的热点 甘草是一种补益中草药, 具有祛痰止咳 补中益气 缓急止痛 解毒和调和诸药等功效 异甘草素是从甘草根分离出来的黄酮类化合物, 其抗肿瘤活性在肿瘤治疗领域备受关注 [7] Peng 等发现, 异甘草素通过降低 mir 37a 增加 PTEN 的表达, 抑制 AKT 信号, 发挥抗乳腺癌细胞增 [8] 殖和迁移的作用 Chen 等在卵巢癌中也证实异甘草素能够呈浓度 时间依赖性抑制肿瘤细胞的活力, 诱导 G2/M 期阻滞和细胞凋亡 此外, 异甘草素 [5] 也表现出较好的抗血管生成的作用 Ji 等研究指出, 异甘草素通过抑制软骨下骨的骨吸收和血管生 [9] 成延缓骨关节炎的进展 ; 王志强等发现, 异甘草素可抑制人微血管内皮细胞增殖 迁移, 诱导细胞阻滞于 S 期并促进细胞凋亡 然而, 异甘草素对血管瘤内皮细胞的影响未见报道 本研究以 和 80μmol/L 的异甘草素处理体外培养的小儿血管瘤内皮细胞, 采用常规生物学手段检测细胞生长 侵袭 凋亡以及细胞周期变化 结果发现, 异甘草素能够呈时间 浓度依赖性抑制小儿血管瘤内皮细胞的生长, 并呈浓度依赖性抑制其侵袭, 诱导细胞凋亡, 使细胞阻滞于 G2/M 期 这一结果进一步验证了异 甘草素抗肿瘤的广谱性 肿瘤细胞的生长和转移有赖于肿瘤血管的生成, 而肿瘤血管生成的过程是一个受多种基因和信号通路共同调控的复杂过程,PI3K/AKT 通路是该过程中一条重要的信号通路 AKT 是 PI3K/AKT 信号通路的核心蛋白, 活化的 AKT 可通过直接或间接介导下游相关蛋白参与肿瘤细胞的生物学过程, 调控肿瘤血管生成 [10 12] ;CyclinB1 是一种 G2 期周期蛋白, 在细胞从 G2 进入 M 期过程中发挥促进作用 Bax 是 Bcl 2 基因家族中的促凋亡基因, 可与抑凋亡基因 Bcl 2 形成异二聚体, 抑制 Bcl 2 产生, 促进细胞凋亡 ;Caspase 3 是公认的细胞凋亡执行因子, Caspase 9 的活化可激活下游 Caspase 3 引起细胞凋亡 ;MMP 9 是 MMPs 家族成员, 在维持细胞外基质降解和重塑过程中发挥着重要作用, 与肿瘤细胞的转移关系密切 ; 同时,CyclinB1 Bax Caspase 9 和 MMP 9 均是 AKT 下游相关靶基因, 也均在血管瘤的发生发展中发挥着重要作用 [13 15] [16] 此外, 吉毅等 指出 PI3K/AKT 信号通路在婴幼儿血管瘤中异常活化, 抑制 PI3K/AKT 通路能够明显促进血管内皮细 [6] 胞的凋亡 Huang 等研究已证实异甘草素可通过阻断 PI3K/AKT 信号通路抑制结肠癌细胞增殖和凋亡 本研究结果显示, 异甘草素处理后小儿血管瘤内皮细胞中 CleavedCaspase 3 和 Bax 表达均升高, 而 CyclinB1 MMP 9 和 p AKT 表达均降低 这一结 [3,17 18] 果与前人发现的异甘草素可通过下调 Cy

5 28 clinb1 表达诱导宫颈癌细胞周期阻滞在 S 和 G2/M 期, 下调 MMP 9 蛋白的表达可抑制胃癌细胞的侵袭, 上调 Caspase 3 和 Bax 表达可诱导膀胱癌细胞凋亡的结果相吻合 提示异甘草素可能通过抑制 PI3K/AKT 信号通路的活化发挥抑制血管瘤内皮细胞生长 侵袭和促进凋亡的作用 综上所述, 异甘草素可抑制小儿血管瘤内皮细胞生长和侵袭, 并促进细胞凋亡, 其机制可能与抑制 PI3K/AKT 信号通路活化有关 这一研究结果为异甘草素用于临床治疗小儿血管瘤提供了理论依据 参考文献 [1] WUY,CHENX,GEX,etal.Isoliquiritigeninpreventsthe progressionofpsoriasis likesymptomsbyinhibitingnf κb andproinflammatorycytokines[j].jmolmed(berl), 2016,94(2):195 [2] PENGF,DUQ,PENGC,etal.Areview:thepharmacolo gyofisoliquiritigenin[j].phytotherres,2015,29(7):969 [3] SIL,YANGX,YAN X,etal.Isoliquiritigenininducesap optosisofhumanbladdercancert24celsviaacyclin de pendentkinase independentmechanism[j].oncollet, 2017,14(1):241 [4] JIY,CHENS,LIK,etal.Signalingpathwaysinthedevel opmentofinfantilehemangioma[j].jhematoloncol, 2014,7(1):13 [5] JIBC,ZHANGZD,GUOWT,etal.Isoliquiritigeninblunts osteoarthritisbyinhibitionofboneresorptionandangiogen esisinsubchondralbone[j].scirep,2018,8(1):1721 [6] HUANG YL,WEIF,ZHAO K,etal.Isoliquiritigeninin hibitscolorectalcancercelshct 116growthbysuppress ingthepi3k/aktpathway[j].openlifesci,2017,12 (1):300 [7] PENG F,TANG HL,LIU P,etal.Isoliquiritigeninmodu latesmir 374a/PTEN/Aktaxistosuppressbreastcancer tumorigenesisandmetastasis[j].scirep,2017,7(1): 9022 [8] CHENHY,HUANGTC,SHIEH TM,etal.Isoliquiritigenin inducesautophagyandinhibitsovariancancercelgrowth [J].IntJMolSci,2017,18(10):2025 [9] 王志强, 张秀英, 李文广, 等. 异甘草素抗肿瘤活性及初步机制研究 [J]. 中国药理学通报,2015,31(8):1159 [10]MARTINIM,DESANTISMC,BRACCINIL,etal.PI3K/ AKT signalingpathway and cancer: an updated review [J].AnnMed,2014,46(6):372 [11]LIY,DAIYB,SUN JY,etal.Neuroglobinatenuatesbeta amyloid inducedapoptosisthroughinhibitingcaspasesac tivitybyactivatingpi3k/aktsignalingpathway[j].jmol Neurosci,2016,58(1):28 [12]LIN ML,CHEN SS,HUANG RY,etal.Suppression of PI3K/AktsignalingbysyntheticbichalconeanalogTSWU CD4inducesER stress andbax/bak mediatedapoptosis ofcancercels[j].apoptosis,2014,19(11):1637 [13]WU SY,WANG B,CHEN LF,etal.Clinicaleficacyof propranololinthetreatmentofhemangiomaandchangesin serum VEGF, bfgf and MMP 9[J].Exp TherMed, 2015,10(3):1079 [14]ZHAO HT,YUAN WL,WANG XK,etal.Expressionand significanceofapoptosis related factorsofmitochondrial pathwayindiferentphasesofinfantilehemangioma[j].j HardTissueBiol,2012,21(3):299 [15] 陈志雄, 张端莲, 陕声国, 等.CyclinB1 蛋白在血管瘤组织中的表达 [J]. 中国组织化学与细胞化学杂志,2003, 12(3):259 [16] 吉毅, 陈思源, 李凯, 等.PI3K/Akt 信号通路的异常活化对婴幼儿血管瘤内皮细胞凋亡的抑制作用 [J]. 中华小儿外科杂志,2014,35(2):93 [17] 张晶, 杨静, 汤宏斌. 异甘草素对人宫颈癌细胞增殖的抑制作用 [J]. 中国药理学与毒理学杂志,2005,19(6): 436 [18] 刘方康, 牛琼, 王爱丽, 等. 异甘草素对胃癌 SGC7901 细胞侵袭能力的影响 [J]. 天津医药,2015,43(11):1267 ( 收稿责任编辑徐春燕 )

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