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1 第 27 卷第 14 期中国现代医学杂志 Vol. 27 No 年 7 月 China Journal of Modern Medicine Jul. 217 DOI: /j.issn 文章编号 : (217) lncrn-t 促进结肠癌细胞侵袭与转移的机制研究 李薇 1, 孙锋 2, 吴雪松 2, 唐浩然 2, 何水旺 3 ( 昆明医科大学第二附属医院 1. 检验科,2. 胃肠外科一病区, 云南昆明 6511; 3. 中国科学院昆明动物研究所分子与病理实验室, 云南昆明 65223) LncRN-T promotes invasion and metastasis of colon cancer cells Wei Li 1, Feng Sun 2, Xue-song Wu 2,Hao-ran Tang 2, Shui-wang He 3 (1. Clinical Laboratory; 2. Department of Gastrointestinal Surgery, the Second ffiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming, Yunnan 6511, China; 3. Molecular and Pathological Laboratory, Kunming Institute of Zoology, Chinese cademy of Sciences, Kunming, Yunnan 65223, China) 摘要 : 目的研究被转化生长因子 β 活化的长链非编码 RN(LncRN-T) 对人结肠癌细胞侵袭和转移的影响及其潜在机制 方法通过荧光实时定量聚合酶链反应检测 LncRN-T 在结肠癌细胞系及人正常结肠上皮细胞中的表达 LncRN-T shrn 沉默效果和 pcdn3.1-lncrn-t 的过表达效果, 以及 Lnc RN-T 和白介素 11(IL-1mRN 的表达 ; 细胞侵袭和转移实验检测 LncRN-T 对结肠癌细胞侵袭和转移能力的影响 ;RN 结合蛋白免疫沉淀实验检测 LncRN 与 IL-11 mrn 的结合能力 ; 酶联免疫吸附法检测结肠癌细胞上清中 IL-11 蛋白的表达 结果 LncRN-T 在结肠癌细胞系中的表达较人正常上皮细胞增高 ;LncRN-T-shRN 可有效沉默 细胞中 LncRN-T 的表达,pcDN3.1-LncRN-T 可有效上调 SW62 细胞中 LncRN-T 的表达 ;LncRN-T 可促进结肠癌细胞的侵袭和转移能力 LncRN- T 可与 IL-11 mrn 结合并调控其表达, 增强其 mrn 稳定性, 促进其分泌 结论 LncRN-T 可通过介导炎症因子 IL-11 的分泌, 在结肠癌细胞的侵袭和转移过程中发挥重要作用 关键词 : 被转化生长因子 β 活化长链非编码 RN; 白介素 -11; 侵袭 ; 转移中图分类号 :R 文献标识码 : bstract: Objective To investigate the effect of long non-coding RN activated by TGF- 茁 (LncRN- T) on the migration and invasion of human colorectal cancer cells and the underlying mechanism. Methods The efficiency of LncRN-T shrn and pcdn3.1-lncrn-t, and the expressions of LncRN-T and IL-11 mrn were detected by quantitative real time PCR (qrt-pcr). The effect of LncRN-T on migration and invasion abilities of colorectal cells were analyzed by cell migration and cell invasion assays. The binding ability of LncRN-T and IL-11 mrn was analyzed by RN immunoprecipitation (RIP). The expression of IL-11 protein was analyzed by ELIS. Results The expression of LncRN-T in the colorectal cells was higher than that in the normal human colon epithelial cells. LncRN-T expression in the cells could be effectively silenced by LncRN-T shrn and LncRN-T expression in the SW62 cells could be efficiently upregulated by pcdn3.1-lncrn-t. LncRN-T could significantly promote the migration and invasion of colorectal cells. inding to IL-11 mrn, LncRN-T could upregulate IL-11 收稿日期 : [ 通信作者 ] 孙锋, SunFeng1971@163.com 33

2 中国现代医学杂志 第 27 卷 mrn expression, enhance the mrn stability of IL-11 and promote its secretion in colorectal cancer cells. Conclusions LncRN-T may play an important role in the migration and invasion of colorectal cells by enhancing the secretion of IL-11. Keywords: long non-coding RN activated by TGF- 茁 ; interleukin-11; migration; invasion [1] 结肠癌发病率居所有肿瘤的第 3 位 结肠癌多 [2-3] 为细胞增殖机制渐进性失控所致 因此, 有必要寻找结肠癌早期诊断和治疗的分子靶点 非编码 RN 在疾病进程中发挥至关重要的作 [4] 用 LncRN 为转录本 >2 nt 但不编码蛋白质的 RN [5] LncRN 通过对细胞增殖调控, 发挥癌基因或 [6-1] 抑癌基因的作用 结肠癌中已鉴定出一些在肿瘤进展中起关键作用的 lncrns [11] LncRN-T 是新发现的 lncrn, 可通过与 mir-2 家族结合促 进肝癌的侵袭 1 材料与方法 1.1 一般材料 Trizol 试剂购自北京碧云天生物技术研究所, RN 反转录试剂购自日本 TaKaRa 公司,LncRN- T-shRN 和 NC 由上海吉玛公司设计并合成, Lipofectamine TM 2 试剂购于美国 Invitrogen 公司, 实时荧光定量聚合酶链反应 (quantitative real-time polymerase chain reaction,qrt-pcr) 试剂 SYR Premix Ex Taq TM Ⅱ 购自日本 TaKaRa 公司,Transwell 小室购自美国 Milipore 公司, 真核表达质粒 pcdn 3.1 购自美国 Invitrogen 公司,DN 聚合酶 pfu Ultra Ⅱ Fusion HS DN polymerase 购自美国 Stratagene 公司,pMS2-GFP 购自美国 ddgene 公司,Magna RIP TM RN-inding protein Immunoprecipitation Kit 购自美国 Millipore 公司, 人白介素 11(Interleukin- 11,IL-1 酶联免疫吸附法 (enzyme-linked immunosorbent assay,elis) 试剂盒购自美国 Ray iotech 公司, 人结肠癌细胞系 HCT116 SW62 及人正常结肠上皮细胞 NM46 购自中国科学院上海细胞库 1.2 方法 细胞培养和转染人结肠癌细胞系和人结肠正常上皮细胞用含 1 ml/l 胎牛血清的 164 培养基, 置于 37 5ml/L 二氧化碳 CO 2 细胞培养箱 当细胞密度达 7% 后, 将 LncRN-T-shRN 和 LncRN-T-NC 经 Lipofectamine TM 2 转入结肠癌细胞中, 具体操作步骤参见脂质体试剂盒说明书 将转染后结肠癌细胞分别为 LncRN-T-shRN R 组和 LncRN-T NC 组 qrt-pcr 待细胞转染 48 h 后, 收集细胞, 用 Trizol 裂解结肠癌细胞, 分别提取细胞总 RN, 反转录为 cdn 作为模板 qrt-pcr 反应条件为 : 95 预变性 5min,95 变性 1 s,6 退火 3 s, 共 35 个循环, 实验重复 3 次 细胞转移与侵袭 Transwell 实验检测结肠癌细胞的侵袭和转移能力 胰酶消化处理细胞, 无菌磷酸盐缓冲溶液 (phosphate buffer saline,ps) 洗 2 遍, 1 g/l 牛血清白蛋白无血清培养液重悬细胞, 调整细胞密度为 个 /ml, 预先用 Matrigel 包被小室上室的基底膜, 加入细胞悬液 15 μl, 下室中加入 5μl 含 2ml/L 血清的培养基, 培养 48h 后, 取出小室, 无菌 PS 冲洗, 并用棉签小心擦去微孔膜内层的细胞, 用 95% 乙醇固定细胞 6min,4 g/l 结晶紫溶液染色后, 倒置显微镜下计数染色细胞并拍照 随机选取 5 个视野的平均值, 分析各组间的差异并绘制柱状图 检测细胞转移时,Transwell 小室的上室中无 Matrigel 包被, 其他操作同细胞侵袭实验 载体构建用 DN 聚合酶 pfu Ultra Ⅱ Fu sionhsdn polymerase PCR 扩增获得编码 LncRN- T 的全场 cdn 通过 Ⅲ Ⅰ 酶切位点, 将扩增片段接入真核表达质粒 pcdn3.1, 而后测序鉴定 RN 结合蛋白免疫沉淀 (RN inding Protein Immunoprecipitation,RIP) 将 pcdn3.1- MS2 pcdn3.1-ms2-lncrn-t pcdn3.1-ms2- LncRN-T-mut(IL-1 与 pms2-gfp 共转染入 SW62 细胞, 培养 48h RIP 具体操作步骤参见 Magna RIP TM RN-inding Protein Immunoprecipitation Kit 说明书 ELIS 收集各组细胞连续培养 48 h 后的细胞上清液, 参照人 IL-11 ELIS 试剂盒说明书检测细胞上清液 IL-11 的表达水平 1.3 统计学方法数据分析采用 SPSS 22. 统计软件, 计量资料以均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 多组间比较用方差分析, 两两比较用检验, <.5 为差异有统计学意义 34

3 第 14 期 李薇, 等 :lncrn-t 促进结肠癌细胞侵袭与转移的机制研究 2 结果 2.1 LncRN-T 在结肠癌细胞系中的表达分别提取正常结肠上皮细胞系 NCM46 及结肠癌细胞系 HCT116 SW62 细胞的总 RN, 各自反转录为 cdn qrt-pcr 检测各组间 LncRN- T 的表达, 发现正常结肠上皮细胞系 LncRN- T 相对表达量为 (1.±.5),HCT116 细胞为 (3.75±.15),SW62 细胞为 (3.17±.7), 细胞为 (4.14±.1, 经方差分析, 差异有统计学意义 ( =13.125, =.8) 进一步分析显示, 结肠癌细胞系与正常结肠上皮细胞系 LncRN-T 表达比较, 差异有统计学意义 ( <.5), 结肠癌细胞系 LncRN-T 表达水平高于 NCM46 细胞 见图 1 5 覮覮 4 3 覮 2 1 NCM46 HCT116 SW62 覮与 NCM46 组比较, <.5 图 1 NCM46 HCT116 SW62 及 细胞 LncRN-T 表达水平比较 (x±s) 2.2 LncRN-T shrn 和 pcdn3.1-lnc RN-T 的效率转染利用 LncRN-T-NC LncRN-T-shRN 转染 细胞, 利用 pcdn3.1 pcdn3.1-lnc RN-T 转染 SW62 细胞 培养 48 h 后, 分别提取各组细胞总 RN, 各自反转录为 cdn,qrt-pcr 检测各组 LncRN-T 的表达水平, 结果显示, LncRN-T-NC 组 LncRN-T 相对表达量为 (1.99±.5),Lnc RN-T-shRN 组为 (.31±.7), 经检验, 差异有统计学意义 ( =8.148, =.8),LncRN-T-shRN 组 LncRN-T 表达水平较低 pcdn3.1 组 LncRN-T 相对表达量为 (1.±.5),pcDN31-LncRN-T 组为 (2.27±.14), 经检验, 差异有统计学意义 ( =9.757, =.9),pcDN3.1-LncRN- T 组 LncRN-T 表达水平较高 见图 LncRN-T 对结肠癌细胞迁移能力的影响 LncRN-T-NC 组细胞迁移数为 ( ± ) 个,LncRN-T-shRN 组为 (53.287± 个, 经检验, 差异有统计学意义 ( =8.327, =.17), 沉默 LncRN-T 表达的 细胞穿过微孔膜的细胞数目减少 pcdn3.1 组细胞迁移数为 (45.453±23.414) 个,pcDN3.1-LncRN-T 组为 (17.517±27.486) 个, 经检验, 差异有统计学意义 (=11.531,=.2, 上调 LncRN-T 表达的 SW62 细胞穿过微孔膜的数目增加 见图 LncRN-T 对结肠癌细胞侵袭能力的影响 LncRN-T-NC 组侵袭细胞数目为 ( ± 个,LncRN-T-shRN 组为 (69.781± 个, 经检验, 差异有统计学意义 ( =3.721, =.17) 个, 沉默 LncRN-T 表达的 细胞穿过微孔膜的细胞数目减少 pcdn3.1 组侵袭细胞数目为 (54.419±21.67 个,pcDN3.1-LncRN-T 组为 ( ±24.586) 个, 经检验, 差异有统计学意义 ( =5.119, =.2, 上调 LncRN-T 表达的 SW62 细胞穿过微孔膜的数目增加 见图 LncRN-T 与炎症因子 IL-11 mrn 相互结合既往研究显示, 炎症因子 IL-11 可活化 STT3 信号通路, 促进结肠癌的发生 发展, 而药物抑制 IL LncRN-T NC 组 LncRN-T shrn 组 pcdn3.1 组 pcdn3.1-lncrn-t 组 图 2 细胞 与 LncRN-T NC 组比较, <.5; 与 pcdn3.1 组比较, <.5 SW62 细胞 转染 LncRN-T-shRN 或 pcdn3.1-lncrn-t 结肠癌细胞的 LncRN-T 表达水平比较 (x±s) 35

4 中国现代医学杂志 第 27 卷 LncRN-T NC 组 LncRN-T shrn 组 15 1 SW62 pcdn3.1 组 pcdn3.1-lncrn-t 组 5 SW :LncRN-T NC 组 ;2:LncRN-T shrn 组 ;3:pcDN 3.1 组 ;4:pcDN3.1-LncRN-T 组 与 LncRN-T NC 组比较, <.5; 与 pcdn3.1 组比较, <.5 图 3 LncRN-T 对结肠癌细胞迁移能力的影响 ( LncRN-T NC 组 LncRN-T shrn 组 2 15 SW62 1 pcdn3.1 组 pcdn3.1-lncrn-t 组 5 SW :LncRN-T NC 组 ;2:LncRN-T shrn 组 ;3:pcDN 3.1 组 ;4:pcDN3.1-LncRN-T 组 与 LncRN-T NC 组比较, <.5; 与 pcdn3.1 组比较, <.5 图 4 LncRN-T 对结肠癌细胞侵袭能力的影响 ( 信号通路可降低 STT3 的活化, 从而抑制结肠癌细的关系, 笔者用 5μmol/L α- 鹅膏覃碱处理 [13] 胞的增殖和侵袭能力 另有研究发现,LncRN- 和 SW62 细胞, 阻止 IL-11 mrn 的转录, 并利用 T 在肝癌细胞中可与 IL-11 mrn 结合, 因此笔 qrt-pcr 检测 IL-11 mrn 的表达水平 结果显示, 者进一步检测结肠癌细胞系中 IL-11 mrn 与 Lnc 沉默 LncRN-T 的 TH29 细胞中 IL-11 mrn RN-T 的关系 RIP 结果显示,SW62 细胞转染的半衰期较 LncRN-T NC 组缩短 ( =3.989, = pcdn3.1-ms2-lncrn-t 组富集 IL-11 mrn,.14), 而过表达 LncRN-T 的 SW62 细胞中而 pcdn3.1-ms2-lncrn-t-mut 组和 pcdn IL-11 mrn 的半衰期较 pcdn3.1 组延长 ( =2.981, 3.1-MS2 组不富集 IL-11 mrn( =3.891, =.2 =.35) 见图 6 进一步研究显示, 在 细胞中沉默 LncRN-T 2.7 LncRN-T 促进炎症因子 IL-11 自分泌的表达可下调 IL-11 的表达 ( =4.116, =.15), 在沉默 细胞中 LncRN-T 的表达可降低 SW62 细胞中过表达 LncRN-T 可上调 IL-11 细胞上清液中 IL-11 的分泌水平 ( =2.189, =.4, 的表达 ( =3.119, =.27) 见图 5 上调 SW62 细胞中 LncRN-T 的表达, 可促进 2.6 LncRN-T 增强炎症因子 IL-11 mrn 细胞上清液中 IL-11 的分泌 ( =3.297, =.35) 见的稳定性为进一步阐明 LncRN-T 与 IL-11 mrn 图 7 36

5 第 14 期 李薇, 等 :lncrn-t 促进结肠癌细胞侵袭与转移的机制研究 ) :pcDN3.1-MS2;2:pcDN3.1-LncRN-T; 3:pcDN3.1-LncRN-T-mut 1:LncRN-T NC;2:LncRN-T shrn 1:pcDN3.1;2:pcDN3.1-LncRN-T; 3:pcDN3.1-LncRN-T-mut(IL-1 C 1 ) 与 pcdn3.1-ms2 组比较, <.5; 与 LncRN-T NC 组比较, <.5;3) 与 pcdn3.1 组比较, <.5 图 5 结肠癌细胞中 LncRN-T 与 IL-11 mrn 相互作用关系 1 8 LncRN-T NC LncRN-T shrn pcdn3.1 2 pcdn3.1-lncrn-t LncRN-T shrn-mut(il 时间 /h 时间 /h 与 LncRN-T NC 组比较, <.5; 与 pcdn3.1 组比较, <.5 图 6 结肠癌细胞中 LncRN-T 增强 IL-11 mrn 的稳定性 讨论 1 2 1:LncRN-T NC;2:LncRN-T shrn 与 LncRN-T NC 组比较, <.5; 与 pcdn3.1 组比较, <.5 图 7 结肠癌细胞中 LncRN-T 促进 IL-11 的分泌 [9] 的转移 MLT-1 在结肠癌组织中异常高表达, 并越来越多的研究证实,LncRN 的异常表达与多通过调控 Wnt/β-catenin 信号通路, 促进结肠癌的侵种肿瘤的发生 发展密切相关,LncRN 通过不同机 [16] 制在不同的水平发挥调节作用, 从而发挥癌基因或袭和迁移 肿瘤易感候选基因 11 通过调控 hnrnp- [14-15] 抑癌基因的功能 随着二代测序技术的发展, 越 K 的表达, 以及活化 Wnt/β-catenin 信号通路, 从而 [17] 来越多的长链非编码 RN 被证实同结肠癌的恶性促进结肠癌的增殖和转移 尽管越来越多 LncRN 表型密切相关 研究表明, 同源基因转录反义 RN 被证实在多种肿瘤的发生 发展中发挥重要作用, 但 37 1:pcDN3.1;2:pcDN3.1-LncRN-T;3:pcDN3.1-LncRN- T-mut(IL 可调控多梳蛋白依赖性染色质状态, 从而促进结肠癌

6 中国现代医学杂志 第 27 卷 由于 LncRN 具有高度组织特异性和时空特异性, 目前急需进一步挖掘更多的与结肠癌发生 发展密切 相关的 LncRN LncRN-T 是新近鉴定出的可 被 TGF-β 活化的长链非编码 RN, 在肝癌中其可 介导 TGF-β 的促转移作用 更为重要的是最新文 献显示,LncRN-T 在胰腺癌 [18] 结直肠癌 [19] 及前 列腺癌等 [2] 多种实体肿瘤内异常高表达, 且与恶性肿 瘤的不良预后密切相关, 提示其可参与调控肿瘤的发 生 发展, 但其生理功能和作用机制尚不完全清楚 因此, 本课题进一步检测 LncRN-T 在结肠癌侵 袭和转移中的作用及其潜在机制 本研究发现,LncRN-T 在结肠癌细胞系中 的表达高于人结肠正常上皮细胞 NM46 进一步的 实验研究表明, 沉默 细胞中 LncRN-T 的 表达可抑制结肠癌细胞的侵袭和转移, 而过表达 SW62 细胞中 LncRN-T 的表达可促进结肠癌 细胞的侵袭和转移 为阐明 LncRN-T 在结肠癌 细胞系调控结肠癌细胞侵袭和转移的分子机制, 笔 者重点研究结肠癌细胞中 LncRN-T 与 IL-11 的关系 IL-11 属于 IL-6 超家族成员, 最初发现于纤维 母细胞上清液中, 该上清液可刺激 IL-6 依赖性的浆 细胞增殖及 lgg 生成 [21] 此后 IL-11 被发现具有多 种生物学功能, 尤其与肿瘤的发生 发展关系密切 研究显示, 乳腺癌细胞可分泌 IL-11, 其在乳腺癌骨 转移和不良预后中起至关重要的作用 [22-23] 另有研 究显示,IL-11 及其受体 IL-11R 在结肠癌组织中异 常高表达,IL-11 可通过 PI3K 信号通路促进结肠癌 细胞的侵袭和转移, 通过 p44/p42 MPK 通路促进 结肠癌细胞的增殖 [24] 而 LncRN-T 被证实在肝 细胞癌中可与 IL-11 结合并促进其分泌, 因此笔 者进一步检测结肠癌细胞中 LncRN-T 与 IL-11 的关系 结果显示, 沉默 细胞中 LncRN-T 的表达可下调 IL-11mRN 的表达, 降低 IL-11 mrn 的稳定性, 并抑制其分泌 ; 过表达 SW62 细 胞中 LncRN-T 的表达可上调 IL-11 mrn 的表 达, 增强 IL-11 mrn 的稳定性, 并促进其自分泌 因此, 笔者认为 LncRN-T 在结肠癌细胞中促进 结肠癌细胞侵袭和转移的部分机制为上调 IL-11 的 表达, 并促进其分泌而激活其下游信号通路 综上所述, 本研究检测 LncRN-T 在结肠癌 细胞侵袭和转移中的作用及潜在机制 研究发现, LncRN-T 促进结肠癌细胞的侵袭和转移 其可 38 能的潜在机制为 LncRN-T 与 IL-11mRN 结合 并调控其表达, 增强其 mrn 稳定性, 促进其分泌 本研究为 LncRN-T 在结肠癌细胞侵袭和转移 过程中的分子机制相关研究提供一定的前期基础, 为进一步研究 LncRN-T 在结肠癌发生 发展中 的作用提供理论基础, 为结肠癌的治疗提供新的分 子靶标 参考文献 : [1] TORRE L, RY F, SIEGEL RL, et al. Global cancer statistics, 212[J]. C Cancer JClin, 215, 65(: [2] CLVERT PM, FRUCHT H. The genetics of colorectal cancer[j]. nn Intern Med, 22, 137(7): [3] RUPNRIN C, DLMINI Z, NICKER S, et al. Colon cancer: genomics and apoptotic events[j]. iol Chem, 24, 385(6): [4] WPINSKI O, CHNG H Y. Long noncoding RNs and human disease[j]. Trends Cell iol, 211, 21(6): [5] KOGO R, SHIMMUR T, MIMORI K, et al. Long noncoding RN HOTIR regulates polycomb-dependent chromatin modifi cation and is associated with poor prognosis in colorectal cancers[j]. Cancer Res, 211, 71(: [6] CUI Z, REN S, LU J, et al. The prostate cancer-up-regulated long noncoding RN PlncRN-1 modulates apoptosis and proliferation through reciprocal regulation of androgen receptor[j]. Urol Oncol, 213, 31(7): [7] LU KH, LI W, LIU XH, et al. Long non-coding RN MEG3 inhibits NSCLC cells proliferation and induces apoptosis by affecting p53 expression[j]. MC Cancer, 213, 13: 461. [8] YNG F, ZHNG L, HUO XS, et al. Long noncoding RN high expression in hepatocellular carcinoma facilitates tumor growth through enhancer of zeste homolog 2 in humans[j]. Hepatology, 211, 54(5): [9] GUPT R, SHH N, WNG KC, et al. Long non-coding RN HOTIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis[j]. Nature, 21, 464(729: [1] WNG TH, YU CC, LIN YS, et al. Long noncoding RN CPS1-IT1 suppresses the metastasis of hepatocellular carcinoma by regulating HIF-1 alpha activity and inhibiting epithelialmesenchymal transition[j]. Oncotarget, 216, 7(28): [11] XIE X, TNG, XIO Y F, et al. Long non-coding RNs in colorectal cancer[j]. Oncotarget, 216, 7(5): YUN JH, YNG F, WNG F, et al. long noncoding RN activated by TGF-beta promotes the invasion-metastasis cascade in hepatocellular carcinoma[j]. Cancer Cell, 214, 25(5): [13] PUTOCZKI TL, THIEM S, LOVING, et al. Interleukin-11 is the dominant IL-6 family cytokine during gastrointestinal tumorigenesis and can be targeted therapeutically[j]. Cancer Cell,

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材料 方法 生物技术通报 张发洲 杨慧兰 为了构建单纯疱疹病毒 型 感染细胞多肽 真核表达质粒 应用 技术从 株 的基因组中扩增 基因 并连接至真核表达载体 对阳性克隆进行菌落 酶切和测序鉴定后 成功构建了重 组质粒 用 转染试剂盒将重组质粒 转染至 细胞中 并用 及 检测其表达情况 结果显示 基因在 细胞中得到正确表达 真核表达质粒 的构建成功 为进 一步研究 对宿主细胞的影响奠定了基础 单纯疱疹病毒 型 感染细胞多肽

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