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1 812 国际肿瘤学杂志 2017 年 11 月第 44 卷第 11 期 JIntOncol,November2017,Vol 44,No 11 论著 mir 92a 调控 KLF4 表达影响结肠癌细胞增殖的机制研究 黄虞杜冀晖龚慧王秀王磊李一凡 摘要 目的探讨微小 RNA 92a(miR 92a) 靶向调控 Krüppel 样因子 4(KLF4) 对结肠癌细胞增殖的影响 方法采用实时荧光定量 PCR(qRT PCR) 方法检测 21 例结肠癌和对应癌旁正常组织及 4 种结肠癌细胞 (HT29 SW480 SW620 HCT116) 中 mir 92a 的表达水平 选取结肠癌细胞株 HCT116 SW620 分别瞬时转染 mir 92amimic inhibitor, 在构建 mir 92a 高表达和抑制表达的细胞模型后, 采用 CCK 8 比色法检测细胞增殖活性, 运用流式细胞仪检测细胞周期, 采用 Westernbloting 方法检测 KLF4 的蛋白表达水平, 采用双荧光素酶报告基因检测细胞荧光素酶活性 结果结肠癌组织中 mir 92a 的表达水平为 (0.648±0.489)fmol/μg 总 RNA, 显著高于对应癌旁正常组织的 (0.064±0.062)fmol/μg 总 RNA, 差异具有统计学意义 (t=-5.420,p<0.001) 4 种人结肠癌细胞株中 HCT116 的 mir 92a 表达水平相对最低,SW620 的表达水平相对最高 上调 mir 92a 表达,HCT116 细胞 72h 增殖活性高于阴性对照组 (0.919± ±0.025), 差异具有统计学意义 (t=-9.309,p=0.001),s 期细胞增多 [(41.670±0.461)% (38.703±0.554)%,t=-7.127,P=0.002],KLF4 蛋白表达水平下调 (0.460± ±0.109,t=22.865,P=0.028); 抑制 mir 92a 表达,SW620 细胞 72h 增殖活性低于阴性对照组 (0.608± ±0.005), 差异具有统计学意义 (t=15.920,p<0.001),s 期细胞减少 [(31.935±0.365)% (34.955±0.465)%,t=8.849,P=0.001],KLF4 蛋白表达水平上调 (0.694± ±0.044,t=-5.246,P=0.034) mir 92a 3pmimic 与 KLF43 UTR 野生型质粒共转染 HCT116 细胞后, 与阴性对照组比较, 上调细胞 mir 92a 表达能使 Firefly 荧光素酶活性略有降低, 但差异无统计学意义 (t=0.878,p=0.429) 结肠癌组织中 mir 92a 表达与 KLF4 蛋白表达之间有一定的负相关趋势, 但无统计学意义 (r=-0.163,p=0.699) 结论 mir 92a 在结肠癌组织中高表达, 可能通过促进细胞周期从 G 0 G 1 期向 S 期转化而增强结肠癌细胞增殖能力 结肠癌细胞中高表达 mir 92a 可能通过抑制 KLF4 蛋白表达发挥调控作用, 但 KLF4 不是 mir 92a 的直接作用靶基因 关键词 结肠肿瘤 ; 细胞增殖 ; 微小 RNA 92a;Krüppel 样因子 4 基金项目 : 深圳市科技计划 (JCYJ ) mir 92apromotescolorectalcancercelproliferationbyregulationofKLF4geneexpresion Huang Yu,DuJihui,GongHui,WangXiu,WangLei,LiYifan.CentralLaboratory,ShenzhenNanshanClinical MedicineColegeofGuangdongMedicalUniversity,Shenzhen518052,China Corespondingauthor:DuJihui, jihuidu@163.com Abstract Objective ToevaluatetheefectofmicroRNA 92a(miR 92a)onregulatingcelprolifera tionbytargetingkrüppel likefactor4(klf4)incoloncancer.methods ThemiR 92aexpresionsin21 coloncancertisuesandmatchednormaltumor adjacenttisuesand4coloncancercels(ht29,sw480, SW620,HCT116)weredetectedusingquantitativereal timepolymerasechainreaction(qrt PCR).Models ofover expresionandsuppresionofmir 92awereestablishedbytransienttransfectionofmiR 92a 3pmimic tohct116andtransienttransfectionofmir 92a 3pinhibitortoSW620,respectively.Celproliferationactivity wasdetectedbythecck 8colorimetrymethod,celcyclesweredetectedbyflowcytometry,KLF4protein expresionwasdetectedbywesternbloting,andcelluciferaseactivitywasdetectedbythedualluciferase reportergeneexperiment.results TheexpresionlevelofmiR 92aincoloncancertisueswas(0.648± DOI: /cma.j.isn X 作者单位 : 广东医科大学深圳南山临床医学院中心实验室 通信作者 : 杜冀晖, jihuidu@163.com

2 国际肿瘤学杂志 2017 年 11 月第 44 卷第 11 期 JIntOncol,November2017,Vol 44,No )fmol/μgtotalRNA,significantlyhigherthanthatinmatchednormaltumor adjacenttisues[(0.064± 0.062)fmol/μgtotalRNA],withstatisticalysignificantdiference(t=-5.420,P<0.001).In4colon cancercellines,themir 92aexpresionlevelinHCT116celswasthelowest,andhighestinSW620cel. WhentheexpresionofmiR 92awasup regulated,thecelproliferationactivityof72hinhct116celswas higherthanthatinthenegativecontrolgroup(0.919±0.014vs.0.765±0.025),withstatisticalysignificant diference(t= ,P=0.001),theproportionofSphasecelswasalsosignificantlyincreased [(41.670±0.461)% vs.(38.703±0.554)%,t=-7.127,p=0.002),andklf4proteinexpresionwas decreased(0.460±0.048vs.0.758±0.109,t=22.865,p=0.028).whentheexpresionofmir 92awas down regulated,thecelproliferationactivityof72hinsw620celswaslowerthanthatinthenegativecontrol group(0.608±0.011vs.0.713±0.005),withstatisticalysignificantdiference(t=15.920,p<0.001), whiletheproportionofsphasecelswasdecreased[(31.935±0.365)% vs.(34.955±0.465)%,t= 8.849,P=0.001],andKLF4proteinexpresionwasincreased(0.694±0.121vs.0.479±0.044,t= ,P=0.034).KLF43 UTRwild typedualluciferasereportplasmidswereco transfectedwithmir 92a 3pmimictoHCT116cel,anddualluciferaseasayshowedthatmiR 92aslightlyrepresedfireflylucife raseactively,butthediferencewasnotstatisticalysignificant(t=0.878,p=0.429).therewasanegative corelationbetweentheexpresionofmir 92aandtheexpresionofKLF4proteinincoloncancertisues,but withnostatisticalsignificance(r=-0.163,p=0.699).conclusion mir 92aishighlyexpresedincolon cancertisues.itcanpromotecoloncancercelsproliferationviaenhancementofthecelcycletransitionof G 0 G 1 phasetosphase.up expresionofmir 92amayplayaroleindown regulatingtheexpresionofklf4 proteinincoloncancercels.however,klf4isnotadirecttargetgeneofmir 92a. Keywords Colonicneoplasms;Celproliferation;MicroRNA 92a;Krüppel likefactor4 Fundprogram:ShenzhenScienceandTechnologyProjectofChina(JCYJ ) 结肠癌是危害人类健康常见的恶性肿瘤之一, 在结肠癌的一系列癌变过程中, 伴随着多种癌基因的激活或抑癌基因的失活, 并与多种微小 RNA(miRNA) 对这些基因表达的调控有关 [1] 通过国内外研究及本课题组的前期研究发现,miR 92a 在结肠癌患者组织和血清中异常高表达, 且与淋巴结转移和预后相关, 提示 mir 92a 可能作为一种癌基因在结肠癌的发生发展中发挥调控作用 [2 4] 研究证实 mir 92a 具有促进多种肿瘤细胞增殖的作用 [5 8], 但 mir 92a 是否通过调控其下游靶基因发挥促进结肠癌细胞增殖的作用, 其机制并未完全明确 本研究通过实时荧光定量 PCR(qRT PCR) 方法检测 mir 92a 在结肠癌组织中的表达, 分析 mir 92a 高表达对结肠癌细胞增殖的影响, 及其对下游潜在靶点 Krüppel 样因子 4 (Krüppel likefactor4,klf4) 表达的调控机制, 旨在为结肠癌的分子靶向治疗提供新思路 1 材料与方法 1 1 材料和试剂人结肠癌细胞 HCT116 SW620 HT29 SW480 由香港中文大学赠予, 收集深圳南山医院 2015 年 1 月至 2016 年 6 月经手术切除的结肠癌及对应癌旁组织 ( 距肿瘤边缘 >4cm) 标本各 21 例 其中男 12 例, 女 9 例 ; 年龄 34~82 岁, 平均年龄 (54.7±13.9) 岁 入选患者均知情同意, 术前未经放化疗治疗, 切除标本 于液氮中保存 TRIzolReagent 反转录试剂盒 Power SYBR GreenPCRMasterMix Lipofectamine 2000 Opti MEM 培养基均购自美国 LifeTechnologies 公司 ; 反转录引物 mirna 引物 micron TM hsa mir 92a 3p mimic 和 microff TM hsa mir 92a 3pinhibitor 及相应阴性对照均由广州锐博生物科技有限公司合成 ; 高糖 DMEM 培养基购自美国 HyClone 公司 ;CCK 8 碘化丙啶 (PI) 购自上海碧云天生物公司 ;BCA Protein AsayKit 购自美国 Pierce 公司 ; 兔抗人 KLF4 单克隆抗体 [ab151733, 克隆号 :EPR3550(2)(ABC)] 购自美国 Abcam 公司 ; 兔抗人 GAPDH 单抗 ( AP) 购自美国 Proteintech 公司 ; 羊抗兔二抗 ( ) 购自美国 JacksonImmunoResearch 公司 ;pezx MT01 KLF43 UTR 野生型或突变型双荧光素酶报告质粒购自广州复能基因有限公司 ;Luc Pair TM mirlu ciferaseasaykit 购自美国 GeneCopoeia 公司 1 2 方法 细胞培养 : 结肠癌细胞株 HT29 SW480 SW620 和 HCT116 在含有 5% 胎牛血清的高糖 DMEM 培养基中,37 5%CO 2 的条件下培养 稳定传代 2~3 代, 取对数生长期细胞进行后续实验 qrt PCR 方法检测 mir 92a 表达 : 按 TRIzol 试剂说明书提取结肠癌组织和细胞中总 RNA, 检测总 RNA 的浓度和纯度后, 每个样本取 1μg 总 RNA

3 814 国际肿瘤学杂志 2017 年 11 月第 44 卷第 11 期 JIntOncol,November2017,Vol 44,No 11 按照 RNA 反转录试剂盒说明书进行反转录反应生成 cdna, 其反转录反应条件为 42 60min,70 10min 取 1μlcDNA 进行 PCR 扩增, 反应条件为 50 2min,95 10min,95 变性 15s,60 退火 延伸 1min,40 个循环 hsa mir 92a 3p 茎环状反转 录引物, 上 下游引物和内参 RNAU6 引物均购自广 州锐博生物科技有限公司 组织中 mir 92a 表达采 用绝对定量方法, 选用已知浓度的 mirna 标准品进 行 10 倍梯度稀释, 与待测样本一起进行 PCR 检测, 建立标准曲线和回归方程, 计算 mir 92a 的浓度 为 保证检测结果的可比性,miRNA 定量根据样本总 RNA 量进行标准化, 结果以每 μg 总 RNA 中的 mirna 含量表示 (fmol/μg 总 RNA) 细胞中 mir 92a 表达以 U6 作为内参, 采用 2 - Ct 的方法计算各组 mir 92a 的相对表达量, 实验重复 3 次, 计算平均值 细胞转染 : 取对数生长期人结肠癌细胞 HCT116 和 SW620 接种于 6 孔板中, 用含 10% 胎牛血 清的 1 DMEM 培养基培养细胞达 60% 融合时进行 瞬时转染, 按照 Lipofectamine 2000 转染试剂说明书 配制 50nmol/LmiR 92amimic 和 100nmol/LmiR 92ainhibitor 及相应阴性对照的转染复合物混悬液, hsa mir 92a 3pmimic 和 inhibitor 购自广州锐博生物 科技有限公司, 其序列分别是 hsa mir 92a 3pmimic: 5 UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU 3 和 5 ACAGG CCGGGACAAGUGCAAUA 3 ;hsa mir 92a 3pinhibitor: 5 ACAGGCCGGGACAAGUGCAAUA 3 将转染复合 物混悬液加入对应的 6 孔板中, 每孔加入不含血清的 1 Opti MEM 培养基调整终体积至 2ml, 置于 37 5%CO 2 条件下培养 5h 后换回 DMEM 培养基继续培 养 转染 48h 后收集细胞用于提取总 RNA, 转染 72h 后收集细胞蛋白用于后续实验 CCK 8 细胞增殖实验 : 取对数生长期人结肠 癌细胞 HCT116 和 SW620 按照一定的细胞密度 (HCT116 为 个 /ml,sw620 为 个 /ml) 接种于 96 孔板 (100μl/ 孔 ), 每组设 3 个平行复孔 放置过夜后按照上述转染浓度进行转染, 分别在转染 后 24h 48h 72h, 避光加入 CCK 8 溶液 10μl; 常规 培养 2h 后, 多功能读板仪检测 450nm 波长处的吸 光度 (A) 值, 即反映细胞的增殖活性 流式细胞术检测细胞周期实验 : 将对数生长 期人结肠癌细胞 HCT116 和 SW620 消化制成单个细 胞悬液, 按每孔 个细胞接种于 24 孔板, 每 孔体积 500μl 放置过夜后按照上述转染浓度进行 转染, 转染 48h 后用胰酶消化细胞, 分别收集各孔细 胞至相应流式管, 离心后弃上清, 加入 PI 染液 (0.5ml/ 管 ),4 避光染色 30min, 于 1h 内用流式细胞仪检测细胞周期并借助 MultiCycle 软件进行细胞周期分析 Westernbloting 检测 KLF4 表达 : 提取结肠癌细胞和组织中总蛋白, 采用 BCA 方法进行蛋白定量 等量上样后进行 SDS PAGE 凝胶电泳, 湿转至 PVDF 膜上,5% 脱脂牛奶封闭 2h, 加入一抗 ( 兔抗人 KLF4 浓度 ,GAPDH 浓度 ) 于 4 孵育过夜,TBST 漂洗 3 次, 每次 10min 加入羊抗兔二抗 (1 2000) 常温孵育 1h,TBST 漂洗 3 次, 每次 10min 滴加 ECL 显影液, 采用化学发光成像仪成像, 测定目的条带灰度值, 分析蛋白表达, 以 GAPDH 为内参计算 KLF4 蛋白相对表达量 双荧光素酶报告实验 : 将对数生长期结肠癌细胞 HCT116 按每孔 个细胞接种于 24 孔板, 待细胞达到 60% 融合时将 mir 92a 3pmimic 及阴性对照分别与 pezx MT01 KLF43 UTR 野生型或突变型重组质粒共转染 HCT116 细胞, 转染 48h 后按照美国 GeneCopoeia 公司的双荧光素酶检测试剂盒说明书进行操作 分别检测 Firefly 和 Renila 荧光素酶活性, 通过计算 Firely/Renila 荧光活性比值的变化反映 mirna 对潜在靶基因的调控作用 1 3 统计学方法应用 SPSS19.0 软件进行数据统计分析, 采用 Kolmogorov Smirnov 检验法进行数据正态性检验, 数据均符合正态分布, 计量资料用 x±s 表示, 两均数比较采用 t 检验, 相关性检验采用 Pearson 方法作相关分析 检验水准 α= 结果 2 1 mir 92a 在结肠癌组织中的表达 qrt PCR 结果显示,21 例结肠癌组织的 mir 92a 表达水平为 (0.648±0.489)fmol/μg 总 RNA, 显著高于癌旁正常组织的 (0.064±0.062)fmol/μg 总 RNA, 差异具有统计学意义 (t=-5.420,p<0.001) 2 2 建立 mir 92a 高表达和抑制表达的细胞模型采用 qrt PCR 方法检测 4 种结肠癌细胞株中 mir 92a 的相对表达水平, 结果见图 1A,HCT116 细胞 mir 92a 表达最低,SW620 细胞 mir 92a 表达最高 选择 mir 92a 表达相对最低 最高的 HCT116 SW620 细胞, 分别瞬时转染 mir 92amimic inhibitor 后检测 mir 92a 的表达水平, 结果见图 1B 与阴性对照组相比,HCT116 细胞转染 mir 92amimic48h 后, 其 mir 92a 的相对表达水平显著升高 ( ± ) 倍 (t=-8.628,p=0.013);sw620 细胞转染 mir 92ainhibitor48h 后, 其 mir 92a 的相对表达

4 国际肿瘤学杂志 2017 年 11 月第 44 卷第 11 期 JIntOncol,November2017,Vol 44,No 水平显著降低 (36.255±4.690) 倍 (t= ,p< 0.001) 证实 mir 92a 高表达和抑制表达的细胞模 型构建成功 0.608± ±0.005), 其差异具有统计学 意义 (t=5.720,p=0.005;t=7.268,p=0.002;t= ,P<0.001) 注 :A 为 4 种结肠癌细胞株中 mir 92a 的相对表达水平 ;B 为瞬时 转染 mir 92amimic inhibitor 后 mir 92a 表达水平的变化 ; 1 为 HCT116 转染 mir 92amimic 阴性对照组 ;2 为 HCT116 转染 mir 92amimic 组 ;3 为 SW620 转染 mir 92ainhibitor 对照组 ;4 为 SW620 转染 mir 92ainhibitor 组 ;mir 92a 为 微小 RNA 92a; a 为 P<0.05; b 为 P<0.01 图 1 瞬时转染 mir 92amimic inhibitor 后结肠癌细胞 mir 92a 表达水平的变化 2 3 mir 92a 高表达或抑制表达对结肠癌细胞增 殖的影响 采用 CCK 8 比色分析方法检测 mir 92a 表达水 平改变对结肠癌细胞增殖的影响, 细胞生长曲线见 图 2 转染 mir 92a 3pmimic24h 48h 72h 后, 与阴 性对照组比较,HCT116 细胞增殖 A 值明显增高 (0.304± ± ± ± ± ±0.025), 其差 异具有统计学意义 (t= ,P=0.042;t= ,P=0.007;t=-9.309,P=0.001); 反之, 转 染 mir 92a 3pinhibitor24h 48h 72h 后,SW620 细 胞增殖 A 值明显低于阴性对照组 (0.210± ± ± ±0.027 注 :A 为结肠癌细胞株 HCT116miR 92a 高表达后细胞增殖 活性 ;B 为结肠癌细胞株 SW620miR 92a 抑制表达后细胞增 殖活性 ;mir 92a 为微小 RNA 92a; a 为 P<0.05; b 为 P<0.01 图 2 mir 92a 高表达或抑制表达的结肠癌细胞增殖曲线 2 4 mir 92a 高表达或抑制表达对结肠癌细胞周 期的影响 采用流式细胞术检测细胞周期结果见表 1 表 2, HCT116 细胞转染 mir 92a 3pmimic 后, 其 S 期细胞 所占比例明显高于阴性对照 (t= ,P= 0.002);SW620 细胞转染 mir 92a 3pinhibitor 后, 与 阴性对照相比, 其 S 期细胞所占比例明显下降, 差异 具有统计学意义 (t=8.849,p=0.001) 2 5 mir 92a 高表达或抑制表达对结肠癌细胞 KLF4 蛋白表达的影响 运用生物信息学软件 Targetscan 预测 mir 92a 的靶基因, 结果显示 mir 92a 的种子序列与 KLF4 基 因 3 UTR 之间存在靶向结合位点 ( 见图 3), 提示 KLF4 可能是 mir 92a 的靶基因

5 国际肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 表 a高表达对结肠癌 HCT 细胞株 JI nonc l N v mb V l N a对 KLF UTR的靶向作用 细胞周期的影响 x±s 将构建好的双荧光 素 酶 报 告 系 统 EZX MT P值 KLF UTR野生型 WT 及突变型 Mu 重组质粒 细胞周期 阴性对照组 a c 值 G G 期 ± ± 见图 分别与 a c及阴性对照共转 S期 ± ± 染 HCT 细胞 检测荧光素酶的荧光活性变化 结 G M期 ± ± 果显示 a c及阴性对照分别与 EZX MT KLF UTR野生型质粒共转染 HCT 细胞 注 a为微小 RNA a 后 上调细胞 a表达能使 F f l y荧光素酶相对 表 a抑制表达对结肠癌 S W 细胞株 活性略有降低 但差异无统计学意义 P 细胞周期的影响 x±s 阴性对照组 G 期 G ± ± S期 ± ± M期 G a n h b 见图 提示在结肠癌细胞中 a与 细胞周期 ± 值 P值 KLF UTR无直接靶向结合作用 KLF并非 a的直接作用靶基因 ± 注 a为微小 RNA a 注 a为微小 RNA a KLF为 K ü l样因子 图 a 与 KLF UTR靶向结合位点序列及突变序列 注 a为微小 RNA a KLF为 K ü l样因子 图 Ta g s c a n软件预测 a与 KLF UTR之间存在靶向结合位点 转染 a c使 HCT 细胞 a表 达水平显著升高 其 KLF蛋白表达下调 低于阴性 对照组 ± ± 转染 a n h b 使 SW细胞 a表达水平显著降 低 其 KLF 蛋 白 表 达 上 调 高 于 阴 性 对 照 组 ± ± 差异具有统计学意 义 P P 见 图 结果提示结肠癌细胞 KLF蛋白表达受到 注 a为微小 RNA a KLF为 K ü l样因子 图 结肠癌细胞 HCT中 a与 KLF a负向调控 UTR直接靶向结合情况 结肠癌组织样本 a与 KLF蛋白表达的 相关性 采用 P a s n双变量相关分析方法对 例结肠癌 组织中 a的表达和 KLF的蛋白表达进行相 关性分析 两者相关系数为 P 见图 图 注 为 HCT转染 a c阴性对照组 为 HCT 转染 a c组 为 S W 转染 a nh b 对照组 为 SW 转染 a n h b 组 a为微小 RNA a KLF为 K ü l样因子 图 a高表达或抑制表达对结肠癌 注 KLF为 K ü l样因子 细胞 KLF蛋白表达的影响 图 结肠癌组织中 KLF蛋白表达水平

6 国际肿瘤学杂志 2017 年 11 月第 44 卷第 11 期 JIntOncol,November2017,Vol 44,No 注 :mir 92a 为微小 RNA 92a;KLF4 为 Krüppel 样因子 4 图 8 8 例结肠癌组织 mir 92a 表达与 KLF4 表达的相关性 3 讨论近年研究证实,miRNA 是一类高度保守的非编码小 RNA, 主要通过结合靶基因 mrna 的 5 UTR 或 3 UTR 在转录后水平上对基因的表达行负调控功能 [9] mirna 在肿瘤细胞中高表达起到癌基因的作用, 使细胞增殖和分化失去控制, 导致肿瘤的发生发展 [10] 已有研究发现 mir 92a 在结肠癌等多种肿瘤中高表达, 通过调控磷脂酰肌醇 3 激酶 / 蛋白激酶 (PI3K/Akt) 应激活化蛋白激酶 (JNK) β catenin 等信号通路及下游靶基因, 发挥促进肿瘤细胞增殖的作用 [5 7] 本研究结果显示, 结肠癌组织中 mir 92a 的表达水平显著高于正常对照, 与已有文献报道一致 [8,11] 通过在结肠癌细胞 HCT116 和 SW620 中分别转染 mir 92amimic 及 inhibitor 上调和下调 mir 92a 的表达, 结果表明 mir 92a 表达上调时, 结肠癌细胞增殖活性明显增强, 细胞周期中 S 期细胞比例明显增高 ;mir 92a 表达抑制后, 肿瘤细胞增殖能力明显降低, 细胞周期阻滞于 G 0 G 1 期, 提示 mir 92a 可能通过促使细胞周期由 G 0 G 1 期向 S 期转化, 发挥促进结肠癌细胞增殖的作用 进一步通过生物信息学预测发现 KLF4 可能是 mir 92a 的下游调控靶基因,KLF4 属于 Krüppel 样因子家族, 研究发现 KLF4 在结肠癌中表达下调, 发挥着抑癌基因作用 [12] KLF4 可通过诱导细胞周期负调控因子 p21 和抑制 CyclinD 的表达, 阻滞细胞从 G 1 期向 S 期转化, 抑制细胞的增殖 [13] 本研究结果表明上调或抑制结肠癌细胞 mir 92a 的表达, 细胞内 KLF4 的蛋白表达水平相应降低或升高, 呈负向调控关系, 提示 mir 92a 可能通过抑制 KLF4 表达对结肠癌细胞增殖发挥调控作用 本研究双荧光素酶报告实验结果显示在结肠癌 HCT116 细胞中 mir 92a 与 KLF43 UTR 无直接靶向 结合作用,KLF4 可能并非 mir 92a 的直接作用靶基因 进一步对结肠癌组织中 mir 92a 表达和 KLF4 蛋白表达水平进行相关性分析, 结果显示结肠癌组织 mir 92a 表达水平与 KLF4 蛋白表达之间有一定的负相关趋势, 但相关性并不显著 研究结果提示在结肠癌中 KLF4 可能不是 mir 92a 的直接作用靶基因, 但 mir 92a 可能通过某种途径间接负向调控 KLF4 的表 [11] 达 这与 Lv 等的研究结果并不完全一致 其原因可能是本研究选取的细胞株是 mir 92a 表达相对较低且细胞增殖能力较差的 HCT116 细胞, 不同于文献中所用的 mir 92a 表达最高且细胞增殖能力最强的 SW620 细胞株 由于肿瘤细胞的异质性及基因表达调控网络的复杂性,miR 92a 可能只是 KLF4 基因表达调控网络中的一个分子, 通过某种信号通路间接负向调控 KLF4 的表达 研究发现,miR 92a 可通过调控 β Catenin 信号通路促进肿瘤细胞的增殖 [7], Wnt/β catenin 信号通路在肠黏膜上皮细胞的增殖 分化和凋亡过程中发挥着至关重要的作用,KLF4 与 Wnt/β catenin 的交互作用可调控肠上皮分化平衡 [14 15], 推测 mir 92a 可能通过 Wnt/β catenin 信号通路间接抑制 KLF4 的表达从而促进结肠癌的细胞增殖 综上所述,miR 92a 在结肠癌组织中显著高表达, 并能促进细胞周期从 G 0 G 1 期向 S 期转化, 发挥促进肿瘤细胞增殖的作用 结肠癌细胞 KLF4 的蛋白表达受到 mir 92a 负向调控, 但 mir 92a 与 KLF4 3 UTR 无直接靶向结合作用, 有关 mir 92a 促进结肠癌细胞增殖的分子机制仍需进一步的实验研究 参考文献 [1]SlabyO,SvobodaM,MichalekJ,etal.MicroRNAsincolorectal cancer:translationofmolecularbiologyintoclinicalapplication[j]. MolCancer,2009,8(1):102.DOI: / [2]ZhouT,ZhangG,LiuZ,etal.OverexpresionofmiR 92acorelates withtumormetastasisandpoorprognosisinpatientswithcolorectal cancer[j].intjcolorectaldis,2013,28(1):19 24.DOI: /s [3] 许欣宜, 杜冀晖, 龚慧, 等.microRNAs 在结直肠癌患者血清中的表达及其诊断价值 [J]. 中华检验医学杂志,2014,37(9): DOI: /cma.j.isn [4]TsuchidaA,OhnoS,WuW,etal.miR 92isakeyoncogeniccom ponentofthemir 17 92clusterincoloncancer[J].CancerSci, 2011,102(12): DOI: /j x. [5]TianL,FangYX,XueJL,etal.FourmicroRNAspromoteprostate celproliferationwithregulationofptenanditsdownstream signals invitro[j].plosone,2013,8(9):e75885.doi: /jour nal.pone

7 818 国际肿瘤学杂志 2017 年 11 月第 44 卷第 11 期 JIntOncol,November2017,Vol 44,No 11 [6]HeG,ZhangL,LiQ,etal.miR 92a/DUSP10/JNKsignalingaxis promoteshumanpancreaticcancercelsproliferation[j].biomed Pharmacother,2014,68(1):25 30.DOI: /j.biopha [7]SongH,ZhangY,LiuN,etal.miR 92a 3pexertsvariousefectsin gliomaandgliomastem likecelsspecificalytargetingcdh1/β cate ninandnotch 1/Aktsignalingpathways[J].IntJMolSci,2016, 17(11):10.DOI: /ijms [8]HuS,LiuL,ChangEB,etal.Butyrateinhibitspro proliferative mir 92abydiminishingc Myc inducedmir 17 92aclustertranscrip tioninhumancoloncancercels[j].molcancer,2015,14:180. DOI: /s x. [9]HaM,Kim VN.RegulationofmicroRNAbiogenesis[J].NatRev MolCelBiol,2014,15(8): DOI: /nrm3838. [10]TieJ,FanD.BigrolesofmicroRNAsintumorigenesisandtumor development[j].histolhistopathol,2011,26(10): DOI: /HH [11]LvH,ZhangZ,WangY,etal.MicroRNA 92apromotescolorectal cancercelgrowthandmigrationbyinhibitingklf4[j].oncol Res, 2016, 23 (6): DOI: / X [12]GhalebAM,ElkarimEA,BialkowskaAB,etal.KLF4suppreses tumorformationingeneticandpharmacologicalmousemodelsof colonictumorigenesis[j].molcancerres,2016,14(4): DOI: / MCR [13]Meza SosaKF,Pérez GarcíaEI,Camacho ConchaN,etal.MiR 7 promotesepithelialceltransformationbytargetingthetumorsuppre sorklf4[j].plosone,2014,9(9):e doi: / journal.pone [14]ZhangW,ChenX,KatoY,etal.NovelcrostalkofKruppel like factor4andbeta cateninregulatesnormalintestinalhomeostasisand tumorrepresion[j].molcelbiol,2006,26(6): DOI: /MCB [15]YuT,ChenX,ZhangW,etal.Regulationofthepotentialmarker forintestinalcels,bmi1,byβ cateninandthezincfingerprotein KLF4:implicationsforcoloncancer[J].JBiolChem,2012,287 (6): DOI: /jbc.M ( 收稿日期 : 修回日期 : ) ( 本文编辑 : 孙娜 ) 读者 作者 编者 关于一稿两投和重复发表问题的处理原则 中华医学会系列期刊作为我国重要的医学信息源期刊, 原则上不接受一稿两投或重复发表的论文, 读者在这些期刊上所阅读的论文基本上都是原始的 首发的, 除非声明是按作者和编辑的意图重新发表的 这一立场符合中国和国际版权法 道德规范及资源使用的成本效益原则 但这一政策并不妨碍下列论文向中华医学会系列期刊投稿 :1 已经被其他刊物退稿的论文 ;2 发表初步报告后再发表完整的论文, 如已在其他刊物或专业学术会议的论文汇编上发表过摘要 ;3 在专业学术会议上宣读过, 但并未在其他刊物或会议汇编上全文发表或准备全文发表 因此, 作者在向中华医学会系列期刊投稿时, 必须就以前是否投寄过或发表过同样或类似的文稿向编辑部作充分的说明, 以免造成一稿两投或重复发表 如果文稿中部分内容已经发表, 作者应在新的文稿中明确指出有关内容并列出相应的参考文献, 同时将以前发表的文稿寄给编辑部, 以便编辑部决定如何处理新的文稿 如果一旦出现一稿两投现象, 且作者在投稿时没有作这方面的说明, 编辑部将立即退稿 ; 如果编辑部在发表前没有了解一稿两投的情况而造成重复发表, 编辑部将在本刊发表有关该文稿系重复发表的声明 对于一稿两投或重复发表的情况, 编辑部将向作者所在单位和该领域的其他科技期刊进行通报, 同时, 中华医学会系列期刊两年内将拒绝接受该论文第一作者所撰写的其他文稿 作者向中华医学会系列期刊投稿并收到编辑部回执后 3 个月未接到退稿, 则表明该稿件仍在处理中, 如果作者欲投寄其他刊物, 应事先与编辑部联系并征得编辑部的同意 本刊编辑部

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