中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2013,29(8): [ 文章编号 ] (2013) 糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白 B 对人肝癌细胞增殖凋亡和侵袭能力的影响及其分子机制张承彦 1,

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恩文
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1 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2013,29(8): [ 文章编号 ] (2013) 糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白 B 对人肝癌细胞增殖凋亡和侵袭能力的影响及其分子机制张承彦 1, 谢鑫 2, 张春喜 3 4, 高登升 ( 1 陕西能源职业技术学院, 陕西西安 ; 2 西北大学, 陕西西安 ; 3 西安航天总医院麻醉科, 陕西西安 ; 4 西安市第四医院新生儿科, 陕西西安 ) [ 摘要 ] 目的 : 研究糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白 B(glycoproteinnonmetastaticmelanomaproteinB,GPN MB) 对肝癌细胞增殖凋亡和侵袭能力的影响及其分子机制方法 : 以人 HepG2 细胞为研究对象, 构建 GPNMB 的小干扰 RNA(smalinterferingRNA,siRNA) 以及过表达载体, 转染入细胞后分别采用 MTT 法流式细胞术和 Tran swel 小室法观察其对 HepG2 细胞增殖凋亡及侵袭能力的影响结果 : 增殖实验结果表明 GPNMB 可促进 HepG2 细胞的增殖 ; 流式细胞术检测发现 GPNMB 对 HepG2 细胞凋亡几乎无影响 ; 细胞侵袭结果表明 GPNMB 可促进 HepG2 细胞的侵袭 ; 当整合素 β 1 亚基基因被 sirna 沉默后,GPNMB 对 HepG2 细胞增殖和侵袭的促进作用均受到明显抑制结论 :GPNMB 可能通过与整合素 β 1 亚基相互作用促进肝癌细胞的增殖和侵袭能力, 提示 GPNMB 可以作为治疗肝癌的潜在靶点 [ 关键词 ] 糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白 B;HepG2 细胞 ; 细胞增殖 ; 细胞凋亡 ; 肿瘤侵袭 [ 中图分类号 ] R395.2 [ 文献标志码 ] A doi: /j.isn EfectofGPNMBonproliferation,apoptosisandinvasionofhumanhep atomacels ZHANGCheng yan 1,XIEXin 2,ZHANGChun xi 3,GAODeng sheng 4 ( 1 ShaanxiEnergyInstitute,Xi an710613,china; 2 NorthwestUniversity,Xi an710069,china; 3 DepartmentofAnesthe sia,xi anaerospacegeneralhospital,xi an710100,china; 4 DepartmentofNeonatology,Xi anno.4hospital,xi an ,China.E mail:chengyan116@126.com) [ABSTRACT] AIM:ToinvestigatetheefectofglycoproteinnonmetastaticmelanomaproteinB(GPNMB)onthe proliferation,apoptosisandinvasionofhumanhepatomahepg2celsanditsmolecularmechanisms.methods:the GPNMBsiRNAandGPNMB overexpresingvectorwereconstructed,andthentransfectedintohepg2cels.mttasay, flowcytometryandtranswelchamberwereusedtodeterminetheefectsofgpnmbdown regulationandup regulationon theproliferation,apoptosisandinvasiveabilityofhepg2cels.results:theproliferationofhepg2celswasobviously promotedbytheup regulationofgpnmb.noefectofgpnmbontheapoptosisofhepg2celswasobserved.theinvasion ofhepg2celswasalsosignificantlypromotedbytheup regulationofgpnmb.whenintegrinβ 1 wassilencedbysirna, thepromotingefectofgpnmbontheproliferationandinvasiveabilityofhepg2celswassignificantlysuppresed.con CLUSION:GPNMBmaypromotetheproliferationandinvasionofHepG2celsbytheinteractionwithintegrinβ 1,and maybeusedasapotentialtherapeutictargetinlivercancer. [KEYWORDS] GlycoproteinnonmetastaticmelanomaproteinB;HepG2cels;Celproliferation;Apoptosis;Ne oplasminvasivenes 肝癌是我国最为常见的恶性肿瘤之一, 尤其在 40~50 岁的壮年男性发病较多, 在各种肿瘤中恶性程度较高, 严重影响人类的健康 [1 2] 近年来尽管肝癌的诊治取得了较大进展, 但关于肝癌细胞的增殖侵袭机制至今尚未完全阐明, 肝癌手术切除后的复发转移是影响疗效的主要原因之一因此, 肝癌细胞增殖侵袭转移这一领域的实验研究不仅有重要的理论意义, 而且有重要的应用价值糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白 B(glycoprotein nonmetastaticmelanomaproteinb,gpnmb) 是一种 Ⅰ 型跨膜糖蛋白, 在结构上分为胞外区跨膜区和胞浆区, 其胞内段具有整合素识别位点精氨酸 - 甘 [ 收稿日期 ] [ 修回日期 ] 通讯作者 Tel: ;E mail:chengyan116@126.com

2 1442 氨酸 - 天冬氨酸 (arginine glycine asparagine,rgd) 序列, 具有细胞黏附功能 gpnmb 广泛表达于多种组织, 如皮肤基底层毛囊生发细胞乳腺癌细胞肝癌细胞黑素瘤细胞破骨细胞等 [3] 近年来的研究表明, 它参与了多种细胞的生长增殖分化和凋亡等生理过程, 而异常表达的 GPNMB 还与多种疾病的病理生理过程相关 [4] 但 GPNMB 在肝细胞癌中的作用及其机制如何, 目前国内外研究报道还较少因此, 本研究通过 GPNMB 基因转染和小干扰 RNA (smalinterferingrna,sirna) 技术刺激体外培养的肝癌细胞, 观察 GPNMB 过表达和 GPNMB sirna 对肝癌细胞增殖凋亡侵袭转移能力的变化, 进一步明确 GPNMB 在肝癌细胞侵袭转移过程中的作用材料和方法 1 材料 1.1 细胞人肝癌细胞株 HepG2 购于中科院上海细胞所, 由本实验室保存 1.2 主要仪器及试剂 CO 2 细胞培养箱 (Binder), 酶联免疫检测仪 (Sheldon), 流式细胞仪 (Olympus), iq5 实时定量 PCR 仪和激光共聚焦显微镜 (Bio Rad),ECL 化学发光试剂盒 (BoehringerMannheim), BCA 蛋白浓度测定试剂盒 RNAisoPlus PrimeScript RTreagentKit SYBR PremixExTaq TM I EcoR I XhoI 和 T4DNA 连接酶 (TaKaRa), 抗 β 肌动蛋白抗体抗整合素 β 1 抗体辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG Lipofectamine TM RNAiMAX 载体 pmd19 T pcd NA3.1(+) 和抗 GPNMB 抗体 (Abcam),M254 培养基 MTT 二甲基亚砜 (demethylsulfoxide,dmso) TBST 缓冲液胎牛血清 (fetalbovineserum,fbs) 和碘化丙啶 (propidiumiodide,pi;gibco BRL) 1.3 引物所有引物均由上海生工合成, 其序列见表 1 表 1 引物序列 Table1.Primersequences Primername GPNMB P1(forreal timepcr) β actin(forreal timepcr) GPNMB P2(forgeneclone) GPNMB P3(foroverexpresion) GPNMB sirna Integrinβ 1 sirna Primesequence Forward:5 AAGTGAAAGATGTGTACGTGGTAACAG 3 Reverse:5 TCGGATGAATTTCGATCGTTCT 3 Forward:5 CTGGAACGGTGAAGGTGACA 3 Reverse:5 AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA 3 Forward:5 AACCTTGAGTGCCTGCGTC 3 Reverse:5 ACTTCCCCAAACCACAATATCTA 3 Forward:5 CCGGAATTCATGGAATGTCTCTACTATTTCCTGGGAT 3 Reverse:5 CCGCTCGAGTCATTAAGAAACTCCTTTAAATTCTTG 3 Forward:5 CUGCCAGAUUACAGAUAUTT 3 Reverse:5 AUAUCUGUUAACUGGCAGTT 3 Forward:5 GGGAGUUUGCUAAAUUUGATT 3 Reverse:5 TTCCCUCAAACGAUUUAAACU 3 UnderlinedletersinGPNMB P3forwardandreverseprimersrepresentthesequencesforEcoRIandXhoIdigestion,respectively. 2 方法 2.1 表达载体的构建将以 GPNMB P2 为引物扩增的 GPNMB 目的片段, 与 pmd19 T 载体在 16 条件下进行连接反应, 并将连接产物转化于感受态大肠杆菌 DH5α, 培养后进行筛选, 挑选阳性菌落摇菌并提取质粒, 电泳鉴定后获得重组质粒 pmd19t GPNMB 以重组质粒为模板, 以 GPNMB P3 为引物, 扩增 GPNMB 编码区序列, 扩增产物以 EcoRI 和 Xho I 双酶切, 并用 T4DNA 连接酶将其与真核表达载体 pcdna3.1(+) 连接, 获得重组表达载体 pcdna3.1 (+) GPNMB 2.2 转染按 cels/wel 接种 HepG2 细胞至 24 孔培养板中, 待其长至 60% 融合时, 采用 Lipo fectamine TM 2000 将 sirna 或重组表达载体 pcdna 3 1(+) GPNMB 转染细胞, 混匀后于 5% CO 2 37 恒温培养箱中孵育 24h 后采用 Westernbloting 法检测各组的转染效率 2.3 RNA 的提取与 real timepcr 检测采用 RNAisoPlus 试剂盒提取 HepG2 细胞中的总 RNA, 按照试剂盒要求操作按实验室常规方法进行逆转录和 PCR 扩增 Real timepcr 采用的体系为 :dntps 2μL,10 bufer5μl, 上下游引物各 10pmol/L,Pfu

3 1443 酶 0.5μL, 模板 2μL, 加三蒸水至总体积 50μL; 扩增条件为 : 预变性 94 5min, 进入循环,94 1 min,60 1min, 延伸 72 3min,30 个循环后,72 5min 以 β actin 为内参照, 依据 2 -ΔΔCt 法计算各组细胞 mrna 的相对表达量 2.4 Westernbloting 检测样品的蛋白水平每个样品取 40μg 蛋白进行常规 SDS PAGE 电泳, 蛋白浓度采用 BCA 试剂盒测定经电泳后转移至 PVDF 膜, 10% 脱脂奶粉 4 封闭 PVDF 膜过夜, 加 10% 脱脂奶粉稀释好的 Ⅰ 抗加于膜上, 室温反应 60min; 用 TBST 缓冲液 (0 05mol/LTris,0.15mol/LNaCl, 0 05% Tween200) 洗膜 10min 3 次 ; 加 Ⅱ 抗 37 孵育 45min,TBST 缓冲液洗膜 10min 3 次, 滴加 ECL 试剂, 将 PVDF 膜放入 X 光片暗盒, 在暗室中压片, 显影以 β actin 作为内参照 2.5 细胞增殖实验分别取对数生长期 HepG2 细胞接种于 96 孔培养板, 每孔 , 共 100μL, 每组 3 孔, 置于 37 5% CO 2 培养箱中培养 48h 将实验分为正常对照组 GPNMB 过表达组 GPNMB sir NA 组及 scrambled 组 ( 即空质粒转染细胞组, 主要是为了说明干扰试验的特异性 ),0.25% 胰酶消化各组细胞, 吸去胰酶, 加入正常培养液继续培养 60min 每孔加入 MTT 溶液 (5g/L)20μL, 继续孵育 4h, 弃上清, 每孔加入 150μLDMSO, 振荡 10min 后进行比色测定, 酶联免疫检测仪在 490nm 波长下读取吸光度 (absorbance,a) 2.6 细胞凋亡测定用 PBS 洗涤 HepG2 细胞 1 次, 加入 AnnexinV FITC, 室温避光放置 20min, 用 PBS 洗涤 2 次, 加 500μL 甲醛, 冰浴 25min, 用磷酸盐缓冲液 (phosphatebufersaline,pbs) 洗涤 2 次, 加入含有 10mg/LPI 和 1mg/LRNA 酶的 PBS 缓冲液, 室温避光孵育 20min, 进行流式细胞仪检测 2.7 细胞侵袭能力测定实验分为正常对照组 GPNMB 过表达组 GPNMB sirna 组以及 scrambled 组, 将培养的人肝癌细胞 HepG2 细胞消化成单细胞悬液, 无血清培养基洗 3 次, 将细胞悬液密度调整成 cels/l 备用预先将 Matrigel( 提前 12h) 用无血清培养基 DMEM 稀释成 1 3 浓度, 均匀地铺满 Transwel 小室上室的聚碳酸酯膜, 室温放置 1h, 使 Matrigel 凝固形成基质膜 Transwel 下室加入 700 μl 含 10% 胎牛血清的培养基, 小室内接种 200μL 无血清细胞悬液, 培养 18h 后取出 Transwel 膜, 预冷的 PBS 洗涤 2 次,4% 多聚甲醛固定 15min,0.1% 结晶紫染色 5~10min, 显微镜下拍照, 统计穿过 Tran swel 膜的细胞数 [5] 实验重复 3 次 3 统计学处理采用 SPSS11.0 统计软件分析数据以均数 ± 标准差 (mean±sd) 表示, 组间比较采用方差分析, 以 P<0.05 为差异有统计学意义结果 1 转染效率的测定取转染后各组细胞总 RNA 和蛋白, 采用 real timepcr 和 Westernbloting 检测 GPNMB 的 mrna 和蛋白水平的表达 Scrambled 组 HepG2 细胞中 GPNMB 的 mrna 表达水平较对照组无明显变化, 而 GPNMB 过表达组和 GPNMB sirna 组 HepG2 细胞中 GPNMB 的 mrna 表达水平分别为 1.28±0.09 和 0.62±0.03, 与对照组相比差异显著 (P<0.05), 见图 1 与对照组相比,scrambled 组 HepG2 细胞中 GPNMB 蛋白表达水平几乎无变化, 而 GPNMB 过表达组蛋白表达水平显著升高,GPNMB sirna 组蛋白表达水平明显降低, 见图 2 Figure1. ThemRMA expresionofgpnmbdetectedbyreal timepcr.mean±sd.n=3. P<0.05vscontrol. 图 1 Real timepcr 检测 GPNMBmRNA 表达 2 GPNMB 对 HepG2 细胞增殖的影响 MTT 法测定各组细胞的 A 值, 结果见图 3 与对照组相比,scrambled 组基本无变化,GPNMB 过表达可以显著促进 HepG2 细胞的增殖, 其 A 值是对照组的 1.4 倍, 差异显著 (P<0.05); 而 GPNMB sirna 则可以显著抑制 HepG2 细胞的增殖, 其 A 值仅为对照组的 0.4 倍, 差异显著 (P<0.05)

1444 Figure2.TheproteinexpresionofGPNMBdetectedbyWestern bloting.mean±sd.n=3. P<0.05vscontrol. 图 2 Westernbloting 检测 GPNMB 蛋白表达 Figure4.EfectofGPNMBonHepG2celapoptosis.

图 3 GPNMB 对 HepG2 细胞增殖的影响 3 GPNMB 对 HepG2 细胞凋亡的影响流式细胞术检测 AnnexinV/PI 荧光强度的结果见图 4 与对照组相比,scrambled 组 GPNMB 过表达及 GPNMB sirna 组的总细胞凋亡率均无明显差异 (P>0.

4 1444 Figure2.TheproteinexpresionofGPNMBdetectedbyWestern bloting.mean±sd.n=3. P<0.05vscontrol. 图 2 Westernbloting 检测 GPNMB 蛋白表达 Figure4.EfectofGPNMBonHepG2celapoptosis. 图 4 GPNMB 对 HepG2 细胞凋亡的影响 Figure3. TheefectofGPNMB onhepg2celproliferation. Mean±SD.n=3. P<0.05vscontrol. 图 3 GPNMB 对 HepG2 细胞增殖的影响 3 GPNMB 对 HepG2 细胞凋亡的影响流式细胞术检测 AnnexinV/PI 荧光强度的结果见图 4 与对照组相比,scrambled 组 GPNMB 过表达及 GPNMB sirna 组的总细胞凋亡率均无明显差异 (P>0.05) 4 GPNMB 对 HepG2 细胞侵袭的影响与对照组相比,scrambled 组基本无变化,GPN MB 过表达组细胞发生侵袭的个数为 124±9, 显著增多 (P<0.05),GPNMB sirna 组细胞发生侵袭的个数为 36±3, 显著减少 (P<0.05), 见图 5 Figure5.EfectofGPNMBonHepG2celinvasion.Mean±SD. n=3. P<0.05vscontrol. 图 5 GPNMB 对 HepG2 细胞侵袭的影响 5 GPNMB 通过整合素 β 1 调控 HepG2 细胞增殖与侵袭仅用整合素 β 1 sirna 处理时,HepG2 细胞的 GPNMB 蛋白表达水平较对照组和 scrambled 组下调 ; 而同时用整合素 β 1 sirna 和 GPNMB 过表达处理时,HepG2 细胞的 GPNMB 蛋白表达水平较整合素 β 1 sirna 组上调, 见图 6 仅用整合素 β 1 sirna 处理时, 细胞增殖与侵袭能力均显著下降 (P<0.05); 而同时用整合素 β 1 sirna 和 GPNMB 过表达处理细胞, 则可促进细胞增殖与侵袭 (P<0.05) 讨论癌症患者死亡的主要原因是肿瘤细胞的增殖和

5 1445 Figure6.TheGPNMBproteinlevelsinHepG2celswithdife renttreatments.mean±sd.n=3. P<0.05vscon trol; # P<0.05vsintegrinβ 1 sirna. 图 6 不同处理因素作用下 HepG2 细胞 GPNMB 蛋白表达水平的变化侵袭, 增殖和侵袭是所有恶性肿瘤的共同特征, 也是导致恶性肿瘤患者临床治疗预后差, 易复发的主要原因 [6] 肿瘤细胞的增殖和侵袭是癌基因与抑癌基因共同参与调节的复杂过程, 可以通过肿瘤增殖侵袭相关基因的过度表达或下调, 以及一系列基因产物的参与, 对肿瘤增殖侵袭转移整个过程进行调控 [7] 在 MTT 实验中,HepG2 细胞在 GPNMB 表达被特异性沉默后增殖速率明显下降, 这表明 GPNMB 直接影响肝癌细胞的生长活力, 对肝癌细胞的增殖起着重要作用 AnnexinV/PI 双染色法流式细胞术检测显示,GPNMB 对 HepG2 细胞凋亡基本无影响, 这说明 GPNMB 在肝癌细胞增殖过程中的影响不是决定性的文献也表明, 正常肝脏组织的肝细胞 GPNMB 蛋白低表达, 但在肝癌细胞中高度表达 [8], 即正常肝细胞在 GPNMB 蛋白表达水平很低的情况下能正常增殖, 而在增殖速率较快的肝癌细胞中降低 GPNMB 蛋白表达水平只会减慢细胞的增殖, 但不会引起致死性的变化整合素为 α 和 β 亚基非共价键连接而形成的异二聚体的跨膜糖蛋白, 是一类重要的细胞表面受体, 其配体主要为细胞外基质蛋白, 整合素通过识别胞 Figure7. GPNMB regulatedtheproliferationandinvasionof HepG2celsthrough interaction with integrin β 1. Mean±SD.n=3. P<0.05vscontrol; # P<0.05vs integrinβ 1 sirna. 图 7 GPNMB 通过整合素 β 1 调控 HepG2 细胞的增殖与侵袭外基质蛋白, 介导细胞与细胞外基质细胞与细胞间的黏附反应, 并接受转导级联信号以及调节细胞的存活运动增殖等生物学过程, 在肿瘤发生侵袭和转移等过程中起重要的作用 [9 10] 正常成人肝细胞没有基膜, 仅低水平表达 3 种整合素 :α 1 β 1 α 5 β 1 和 α 9 β 1, 但当肝细胞癌变时, 上述几种整合素受体有较大改变肝癌细胞整合素 β 1 亚基在肝癌细胞株的细胞膜表面具有较强的表达, 其表达明显高于正常肝细胞 [11] 本研究采用 RNA 干扰技术沉默整合素 β 1 亚基, 研究 GPNMB 对 HepG2 细胞增殖和侵袭的分子机制结果发现, 仅用整合素 β 1 sirna 处理时, 细胞增殖和侵袭能力均显著下降 ; 而同时用整合素 β 1 sirna 和 GPNMB 过表达处理细胞, 则可促进其增殖和侵袭有文献报道,CD151( 四跨膜蛋白超家族中的一重要分子 ) 在体外可通过整合素通路促

6 1446 进 HepG2 细胞的增殖迁移和侵袭 [12], 由此我们推测,GPNMB 对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响可能也是通过整合素 β 1 起作用由于肿瘤细胞的增殖和侵袭机制是一个复杂的多步骤的过程, 其幕后的细胞信号转导机制起着决定性作用, 而本研究仅考察了整合素 β 1 在肝癌细胞上的表达及影响, 其它整合素亚型的表达及贡献大小多种胞外配体分子协同作用机制还需要进一步研究 [ 参考文献 ] [1] 华鹏, 李宝金, 汪勇, 等.ATP 启动子驱动的 ycd/tk 双自杀基因靶向杀伤肝癌细胞的体内外研究 [J]. 中国病理生理杂志,2009,25(6): [2] Lyra GonzálezI,Flores FongLE,González GarcíaI,et al.adenoviralgenetherapyinhepatocelularcarcinoma: areview[j].hepatolint,2013,7(1): [3] HoashiT,SatoS,YamaguchiY,etal.Glycoproteinnon metastaticmelanomaproteinb,amelanocyticcelmar ker,isamelanosome specificandproteolyticalyreleased protein[j].fasebj,2010,24(5): [4] TomihariM,HwangSH,ChungJS,etal.Gpnmbisa melanosome asociated glycoprotein thatcontributes to melanocyte/keratinocyteadhesion in a RGD dependent fashion[j].expdermatol,2009,18(7): [5] ChoiET,EngelL,CalowAD,etal.Inhibitionofneoint imalhyperplasiabyblockingα V β 3 integrinwithasmal peptideantagonistgpengrgdspca[j].jvascsurg, 1994,19(1): [6] TsujimotoM,AozasaK,NakajimaY,etal.Hepatocelu larcarcinomawithsarcomatousproliferationshowingan unusualandwide spreadmetastasis[j].actapatholjpn, 1984,34(4): [7] 郭晓鹤, 张彩凤, 夏永华, 等.CADM 过表达对人胃癌 MKN 45 细胞增殖和侵袭的影响及其分子机制 [J]. 中国病理生理杂志,2012,28(12): [8] ZhouL,LiuF,LiY,etal.Gpnmb/osteoactivin,anat tractivetargetincancerimmunotherapy[j].neoplasma, 2012,59(1):1 5. [9] DesgroselierJS,ChereshDA.Integrinsincancer:biolog icalimplicationsandtherapeuticopportunities[j].nat RevCancer,2010,10(1):9 22. [10] RaymondK,FaraldoMM,DeugnierMA,etal.Integrins inmammarydevelopment[j]. Semin CelDevBiol, 2012,23(5): [11]SahinAO,BuitenhuisM.Molecularmechanismsunderly ingadhesionandmigrationofhematopoieticstem cels [J].CelAdhMigr,2012,6(1): [12] SadejR,RomanskaH,KavanaghD,etal.Tetraspanin CD151regulatestransforminggrowthfactorβsignaling: implicationintumormetastasis[j].cancerres,2010, 70(14):

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

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中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2013,29(8): [ 文章编号 ] (2013) 糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白 B 对人肝癌细胞增殖凋亡和侵袭能力的影响及其分子机制张承彦 1,