1071 肝癌大多数情况下为原发性肝细胞癌 (hepatocelu larcarcinoma,hcc), 其在世界最常见癌症中排名第五, 且病死率居第三 [1] 研究证实肝癌干细胞(livercancer stemcels,lcscs) 存在于肝癌组织中, 且与肝癌的复发转移以及肝癌患者的预后差有

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胡灵袁
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1 1070 论著 DOI: /j mir 125b 对肝癌干细胞自我更新能力的调控作用彭维 1, 赵湘湘 2, 苏立 1 1, 钱程杭州, 浙江理工大学生命科学学院 2 ) ( 重庆, 第三军医大学西南医院全军临床病理学研究所 1 ; [ 摘要 ] 目的观察 mir 125b 对肝癌干细胞 (livercancerstem cels,lcscs) 成球克隆形成增殖凋亡迁移的作用, 探讨 mir 125b 对肝癌干细胞自我更新能力的调控作用方法获取肝癌干细胞 ; 包装表达 mir 125b 的慢病毒并感染肝癌干细胞 ; 光镜计数法检测 mir 125b 对肝癌干细胞成球率及克隆形成率的影响 ;CCK 8 法检测 mir 125b 对肝癌干细胞增殖能力的影响 ;DAPI 染色观察 mir 125b 对肝癌干细胞凋亡的影响 ;Transwel 实验检测 mir 125b 对肝癌干细胞迁移能力的影响结果与对照组比较,miR 125b 显著降低 LCSCs 的成球率 ( 对照组 27.7%, 实验组 0.0%,P<0.01) 以及抑制其克隆形成能力 ( 对照组 29%, 实验组 6%,P<0.01); 同时 mir 125b 可促进 LCSCs 的凋亡, 抑制 LCSCs 的迁移能力 (P<0.01) 结论 mir 125b 对 LCSCs 的成球能力克隆形成能力具有明显的抑制作用, 表明 mir 125b 对 LCSCs 的自我更新能力具有负向调控作用 mir 125b 也能抑制 LCSCs 的迁移, 对 LCSCs 的凋亡具有促进作用 [ 关键词 ] mir 125b; 肝癌干细胞 ; 自我更新 [ 中图法分类号 ] R73 354;R730.23;R735.7 [ 文献标志码 ] A mir 125bregulatesself renewalinlivercancerstem cels PengWei 1,ZhaoXiangxiang 2,SuLi 1,QianCheng 1 ( 1 InstituteofClinicalPathology,SouthwestHospital,Third MilitaryMedicalUniversity,Chongqing,400038; 2 ColegeofLifeSciences,ZhejiangSci TechUniversity,Hangzhou, ZhejiangProvince,310018,China) [Abstract] Objective TodeterminetheefectsofmiR 125bonthesphereformation,clone formation,proliferation,apoptosisandmigrationoflivercancerstem cels(lcscs),andinvestigatethe regulativeroleofmir 125bontheself renewalcapacityoflcscs.methods ThelentivirusexpresingmiR 125bwasusedtoinfectobtainedLCSCs.Lightmicroscopecountingwasemployedtomeasurethesphere formationandcloneformationintheinfectedlcscs.cck 8asaywasusedtodetecttheefectofmiR 125bon theproliferationoflcscs.dapistainingandtranswelchambertestwasusedtoobservetheefectofmir 125b onthecelapoptosisandmigration.results Comparedwiththecontrolcels,miR 125bsignificantdecreased sphereformation(0.0% vs27.7%,p<0.01),inhibitedthecolonyformation(6% vs29%,p<0 01), promotedthecelapoptosis,andinhibitedthemigrationabilityinlcscsafterlentivirusinfection(p<0.01). Conclusion mir 125bexertssignificantinhibitoryefectonsphereandcloneformationofLCSCs,indicating itsnegativeroleintheregulationofself renewalcapacityofthestemcels.italsocaninhibitthemigrationand promotetheapoptosisoflcscs. [Keywords] mir 125b;livercancerstemcels;self renewal SupportedbytheNationalScienceFoundationforYoungScholarsofChina( ).PengWeiandZhaoXiangxiangareco firstauthorswhocontributed equalytothisarticle.corespondingauthor:qiancheng,e mail:cqian8634@gmail.com [ 基金项目 ] 国家自然科学基金青年科学基金 ( ) 同等贡献者 [ 通信作者 ] 钱程,E mail:cqian8634@gmail.com [ 优先出版 ] htp:// )

2 1071 肝癌大多数情况下为原发性肝细胞癌 (hepatocelu larcarcinoma,hcc), 其在世界最常见癌症中排名第五, 且病死率居第三 [1] 研究证实肝癌干细胞(livercancer stemcels,lcscs) 存在于肝癌组织中, 且与肝癌的复发转移以及肝癌患者的预后差有重要关系 [2] 因此, 靶向肝癌干细胞的治疗策略成为肝癌治疗的研究热点微小 RNA(microRNAs,miRNA) 是新近发现的内源性高度保守的非蛋白质编码长约 22 核苷酸单链小分子 RNA [3] mir 125b 是一种非编码多功能的小 RNA 分子, 通过下调靶基因或在转录水平抑制其表达, 在细胞的增殖分化凋亡等多个过程中扮演着重要角色 [4] 研究显示,miR 125b 与肝癌 [5] 乳腺癌 [6] 肺癌 [7] 前列腺癌 [8] 结直肠癌 [9] 口腔鳞癌 [10] 胶质瘤 [11] 白血 [12] 病等多种肿瘤的发生发展有关 mir 125b 既可上调发挥癌基因作用, 也可下调发挥抑癌基因作用近年来研究发现 mir 125b 参与肝癌细胞的增殖凋亡 [13] 肝癌细胞的侵袭转移 [14] 肝癌细胞的耐药 [15], 但其对肝癌干细胞的作用尚不清楚本研究通过表达 mir 125b 的慢病毒感染肝癌干细胞, 探讨 mir 125b 对肝癌干细胞成球与克隆形成增殖凋亡迁移等生物学行为的影响, 揭示 mir 125b 对肝癌干细胞自我更新能力的调控作用, 旨在为肝癌干细胞的研究提供实验依据 1 材料与方法 1.1 主要材料与仪器慢病毒质粒 :plko.1 mir125b FP635,pLKO.1 Scr FP635 以及 3 个包装质粒 (pmd2.g pmdlg/prre 及 prsv Rev) 由本实验室保存 HEK 293FT 细胞稳定表达 Nanog GFP 的 Huh7 细胞株由本实验室保存恒温 CO 2 培养箱 ( 美国 Thermo 公司 ) 多功能酶标仪 ( 美国 Thermo 公司 ) 流式细胞仪 ( 美国 BD 公司 ) 均由第三军医大学西南医院全军临床病理学研究所提供 1.2 主要试剂 DMEM/F12 培养基 DMEM 培养基均购自美国 Gibco 公司, 胎牛血清 (fetalbovineserum,fbs, 以色列 BI 公司 ), 胰蛋白酶 polybrene 均购自美国 Sigma 公司, 细胞因子 bfgf EGF HGF 均购自美国 PeproTech 公司,B27( 美国 Gibco 公司 ), 谷氨酰胺即 L G( 上海生工 ), 青链霉素 ( 华北制药 ) 完全培养基 :DMEM 培养基添加 10%( 体积比 ) 胎牛血清青霉素与链霉素 (100U/mL 100μg/mL); 成球培养基 :DMEM/F12 培养基 bfgf(20 ng/ml) EGF(20 ng/ml) HGF (10ng/mL) B27(50 ) L G(2mmol/L) 青霉素与链霉素 (100U/mL 100μg/mL) 质粒转染试剂盒 EfecteneTransfectionReagent(Qiagene 公司 ),CCK 8 试剂盒 ( 碧云天公司 ),DAPI 试剂盒 ( 碧云天公司 ), Transwel 细胞小室 ( 德国 MerckMilipore 公司 ) 1.3 测序鉴定 mir 125b 基因片段将慢病毒质粒 plko.1 mir125b FP635 送测序, 鉴定 mir 125b 基因片段, 测序结果与已知的 mir 125b 序列 5 CCGGTGTGCGCTCCTCTCAGTCCCTGAGACCCTA ACTTGTGATGTTTACCGTTTAAATCCACGGGTTAGGCT CTTGGGAGCTGCGAGTCGTGCTATTT 3 一致 1.4 获取肝癌干细胞将本实验室保存的稳定感染 Lv P Nanog GFP 慢病毒的 Huh7 细胞扩大培养后, 胰酶消化细胞, 培养基终止消化, 离心收集细胞,PBS 重悬细胞, 细胞悬液过 200 目筛网后, 流式细胞仪分选 GFP 阳性细胞, 这群 Huh7 Nanog pos 细胞为肝癌干细胞 [2] 1.5 脂质体转染法包装慢病毒并感染 LCSCs 常规脂质体转染法包装慢病毒, 简言之, 将 HEK 293FT 细胞以 /ml 铺 6 孔细胞培养板, 每孔 2mL 完全培养基, 于 37 5%CO 2 培养箱培养,12h 后细胞完全贴壁, 将上述慢病毒质粒及包装质粒在 1 5mLEP 管中按 ( ) 比例混合好 ; 按质粒转染试剂盒说明书操作步骤 : 加入 3.2μLEnhancerbufer, 涡旋 1s, 短暂离心收集管盖上液体, 室温静置 5min, 加入 efectene10μl, 涡旋 10s, 室温静置 10min, 这期间将 6 孔板中培养液换成 1.6mL 新鲜的 5%FBS 的 DMEM 培养液, 向混合后的溶液中加入 600μL 完全培养液, 用移液枪混匀后逐滴覆盖加入 6 孔板细胞中, 于 37 5%CO 2 培养箱培养转染 12h 后更换 2mL/ 孔的完全培养基, 继续培养转染 48h 后收集上清, PEG6000 纯化后, 过滤除菌, 滴度测定后分装 -80 保存将 Huh7 Nanog pos 细胞以 /ml 的密度铺 6 孔细胞培养板, 待细胞贴壁后, 换成含有 4mg/mL polybrene 的完全培养基, 并加入 10MOI 的慢病毒, 于 37 5%CO 2 培养箱培养,8~10h 后换新鲜的完全培养基继续培养根据加入的不同慢病毒分组 : 空白组 ( 不加病毒组 ) 对照组 (Lv Scr FP635 组 ) 和实验组 (Lv mir 125b 组 ) 根据 FP635 阳性比例, 流式细胞仪检测不同慢病毒感染 LCSCs 的效率 1.6 mir 125b 对 LCSCs 的成球率的影响感染 48h 后 2 组细胞均用常规方法收集 : 胰酶消化细胞, 培养基终止消化, 离心,PBS 重悬细胞, 然后对照组和实验组流式分选 FP635 阳性细胞 2 组细胞均用流式细胞仪以 20 个 / 孔的密度接种于低黏附 96 孔细胞培养板, 每组 12 个重复孔, 孔板中预先加入 100μL 成球培养基, 于 37 5%CO 2 培养箱培养,3d 后补充 1 次成球培养基 100μL, 再培养 7d 后, 显微镜下计数

3 1072 不同组细胞成球个数并计算其成球率 [16] 成球率 =( 平均细胞球数 / 接种细胞数 ) 100% 1.7 mir 125b 对 LCSCs 的克隆形成能力的影响感染 48h 后 2 组细胞均用常规方法收集 : 胰酶消化细胞, 培养液终止消化, 离心,PBS 重悬细胞, 然后对照组和实验组流式分选 FP635 阳性细胞 2 组细胞均用流式细胞仪以细胞数 50/ 孔接种于 24 孔细胞培养板, 每组 24 个重复孔, 每孔预先加入 1mL 完全培养基, 于 37 5%CO 2 培养箱培养, 每 3 天更换一次完全培养基 1mL, 培养 14d 后, 吸去培养基, 用 PBS 洗 1 遍, 用 4% 多聚甲醛固定 30min 后吸去,0.4% 结晶紫溶液染色 5min 后吸去, 用水轻柔洗净多余结晶紫溶液, 自然风干, 计数不同组 50 个细胞的克隆并计算其克隆形成率克隆形成率 =( 平均克隆形成个数 / 接种细胞数 ) 100% 1.8 mir 125b 对 LCSCs 的增殖能力的影响感染 48h 后 2 组细胞均用常规方法收集 : 胰酶消化细胞, 培养液终止消化, 离心,PBS 重悬细胞, 然后对照组和实验组流式分选 FP635 阳性细胞 2 组细胞均以 2000 个 / 孔的密度接种于 96 孔细胞培养板, 每组 21 个重复孔, 每孔预先加入 100μL 完全培养基, 于 37 5%CO 2 培养箱培养待细胞贴壁后, 每孔加入 10μL CCK 8 溶液, 混匀后在细胞培养箱继续培养 2h, 于多功能酶标仪检测波长 450nm 处光密度值 [D(450)], 每组每天检测 3 个复孔, 连续检测 7d, 分析不同组细胞增殖情况 1.9 mir 125b 对 LCSCs 的凋亡的影响将 Huh7 Nanog pos 细胞以 /ml 的密度铺 24 孔细胞培养板, 孔板内已预先放入细胞爬片, 每孔 500μL, 于 37 5%CO 2 培养箱培养待细胞贴壁后加入终浓度 4mg/mL 的 polybrene, 再分别加入两种慢病毒, 混匀后于 37 5%CO 2 培养箱培养,8~10h 后换新鲜的完全培养基继续培养 2d 后, 吸去培养液, 用 PBS 洗 2 遍,4% 多聚甲醛固定 30min, 再用 PBS 洗 2 遍, 每孔加入 300μLDAPI 染色液, 覆盖住细胞爬片即可, 室温放置 5~10min, 吸去 DAPI 染色液, 用 PBS 洗 1 遍,50% 甘油封片, 荧光显微镜下观察分析不同组细胞凋亡情况 1.10 mir 125b 对 LCSCs 的迁移能力的影响感染 48h 后 2 组细胞均用常规方法收集 : 胰酶消化细胞, 培养液终止消化, 离心,PBS 重悬细胞, 然后对照组和实验组流式分选 FP635 阳性细胞细胞用无 FBS 的 DMEM 培养基重悬, 密度为 /ml, 将 Tr answel 细胞小室置于 24 孔细胞培养板中, 向小室中加入的细胞即 200μL, 而 24 孔细胞培养板中加入 20%FBS 的 DMEM 培养基直至细胞小室内外液面齐平, 于 37 5%CO 2 培养箱培养 1~2d 后, 吸去培养液, 用 PBS 洗 2 遍,4% 多聚甲醛固定 30min, 吸去固定液, 将小室适当风干,0.1% 结晶紫染色 20min, 吸去结晶紫染色液, 用 PBS 轻柔洗涤, 再用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞, 显微镜下随机 5 个视野观察细胞并计数, 分析不同组细胞迁移情况 1.11 统计学分析数据以 x±s 珋表示, 采用 SPSS19.0 统计软件进行方差分析及 t 检验 2 结果 2.1 慢病毒感染 LCSCs 的效率慢病毒感染 LCSCs 后第 3 天, 收集细胞, 细胞悬液过 200 目筛网后, 流式细胞仪检测 FP635 阳性细胞比例, 确定两种慢病毒感染效率结果显示 :Lv Scr FP635 和 Lv mir 125b 感染 Huh7 Nanog pos 细胞的效率分别为 76.2% 和 64.4%( 图 1) 2.2 mir 125b 降低 LCSCs 成球率显微镜下统计结果显示 : 对照组 (Lv Scr FP635 组 ) 的成球数为 (6±1) 个 / 孔, 其成球率达到 27 7%; 而实验组 (Lv mir 125b 组 ) 各孔均未成球, 其成球率为 0 0% 感染了 Lv mir 125b 病毒的实验组 Huh7 Nanog pos 细胞, 其成球率较对照组 ( 感染 Lv Scr FP635) 而言, 呈显著的下降趋势 (P<0.01, 图 2) 这提示 mir 125b 可以明显下调 LCSCs 的成球能力! "! #"! " A: 空白组 ;B: 对照组 ;C: 实验组图 1 流式细胞仪检测 3 组 Huh7 Nanog pos 细胞的 FP635 阳性比例

1073 2.4 过表达 mir 125b 对 LCSCs 的增殖能力无影响 CCK 8 检测 mir 125b 对 LCSCs 增殖的影响, 其结果显示 : 与对照组相比,Huh7 Nanog pos 细胞过表达 mir 125b 后, 其增殖能力无明显变化 ( 图 4) A: 对照组 ;B: 实验组图 2 mir 125b 对 LCSCs 的成球能力的影响 ( 100) 2.

Lv mir 125b 组的克隆比 Lv Scr FP63 组小且少显微镜下观察结果显示 : 实验组 (Lv mir 125b 组 ) 克隆形成数为 (3±3) 个 / 孔, 其克隆形成率只有 6%; 而对照组 (Lv Scr FP635 组 ) 克隆形成数为 (14±3) 个 / 孔, 其克隆形成率达到 29%(P<0.

5 mir 125b 促进 LCSCs 的凋亡荧光显微镜下观察各组细胞 DAPI 染色情况可见未感染慢病毒的 Huh7 Nanog pos 细胞的细胞核呈均匀染色, 几乎看不到凋亡细胞感染 Lv Scr FP635 的 Huh7 Nanog pos 细胞同样染色比较均匀, 与未感染慢病毒组的情况类似而感染 Lv mir 125b 的 Huh7 Nanog pos

4 过表达 mir 125b 对 LCSCs 的增殖能力无影响 CCK 8 检测 mir 125b 对 LCSCs 增殖的影响, 其结果显示 : 与对照组相比,Huh7 Nanog pos 细胞过表达 mir 125b 后, 其增殖能力无明显变化 ( 图 4) A: 对照组 ;B: 实验组图 2 mir 125b 对 LCSCs 的成球能力的影响 ( 100) 2.3 mir 125b 抑制 LCSCs 克隆形成能力观察各组细胞克隆形成情况, 细胞培养过程中空白组 Huh7 Nanog pos 细胞和感染 Lv Scr FP635 病毒的对照组 Huh7 Nanog pos 细胞可在早期出现克隆, 并逐渐增大及增多, 而感染 Lv mir 125b 病毒的实验组 Huh7 Nanog pos 细胞克隆形成出现比较晚, 克隆较小且数目少 2 周后染色可见 Lv mir 125b 组的克隆比 Lv Scr FP63 组小且少显微镜下观察结果显示 : 实验组 (Lv mir 125b 组 ) 克隆形成数为 (3±3) 个 / 孔, 其克隆形成率只有 6%; 而对照组 (Lv Scr FP635 组 ) 克隆形成数为 (14±3) 个 / 孔, 其克隆形成率达到 29%(P<0.01, 图 3) 过表达 mir 125b 的 Huh7 Nanog pos 细胞的克隆形成能力明显下调这说明 mir 125b 可抑制 LCSCs 克隆形成能力 A: 对照组 ;B: 实验组图 3 mir 125b 对 LCSCs 的克隆形成能力的影响图 4 mir 125b 对 LCSCs 的增殖能力的影响 2.5 mir 125b 促进 LCSCs 的凋亡荧光显微镜下观察各组细胞 DAPI 染色情况可见未感染慢病毒的 Huh7 Nanog pos 细胞的细胞核呈均匀染色, 几乎看不到凋亡细胞感染 Lv Scr FP635 的 Huh7 Nanog pos 细胞同样染色比较均匀, 与未感染慢病毒组的情况类似而感染 Lv mir 125b 的 Huh7 Nanog pos 细胞可见细胞核固缩变的致密浓染高亮的凋亡细胞, 而且有些可见核碎裂, 甚至凋亡晚期出现的向胞核外突出的凋亡小体 ( 图 5) 结果表明 mir 125b 可促进 LCSCs 的凋亡 2.6 mir 125b 抑制 LCSCs 的迁移能力利用 LCSCs 向高浓度血清环境迁移的特点, 采用 Transwel 研究 mir 125b 对 LCSCs 迁移的作用,400 高倍视野观察结果显示, 与感染了 Lv Scr FP635 的对照组 [(208±18) 个 / 高倍视野 ] 相比,Lv mir 125b 组 [(158±26) 个 / 高倍视野 ] 的细胞向外迁移能力弱 (P<0.01, 图 6) 这提示 mir 125b 对 LCSCs 的迁移具有负向调节能力 A: 空白组 ;B: 对照组 ;C: 实验组 : 示细胞凋亡图 5 荧光显微镜下观察 mir 125b 对 LCSCs 的凋亡的影响 (DAPI 100)

1074 A: 对照组 ;B: 实验组图 6 mir 125b 对 LCSCs 的迁移能力的影响 3 讨论 mir 125b 作为抑制基因表达的非编码小 RNA, 在肝癌细胞的增殖与凋亡侵袭转移耐药等方面发挥作用但是,miR 125b 对在肝癌发生发展过程中起重要作用的肝癌干细胞的作用尚未可知本研究发现 mir 125b 对肝癌干细胞的成球能力发挥着明显的抑制作用另外,

5 1074 A: 对照组 ;B: 实验组图 6 mir 125b 对 LCSCs 的迁移能力的影响 3 讨论 mir 125b 作为抑制基因表达的非编码小 RNA, 在肝癌细胞的增殖与凋亡侵袭转移耐药等方面发挥作用但是,miR 125b 对在肝癌发生发展过程中起重要作用的肝癌干细胞的作用尚未可知本研究发现 mir 125b 对肝癌干细胞的成球能力发挥着明显的抑制作用另外, 在克隆形成方面,miR 125b 同样有着显著的抑制性这些研究结果证实了我们的猜想,miR 125b 不仅对肝癌细胞发挥作用, 更重要的是其对肝癌干细胞也发挥明显的抑制作用, 负向调控肝癌干细胞的自我更新能力而这一点或许是 mir 125b 抑制肝癌发生发展的主要原因我们进一步研究发现,miR 125b 促进肝癌干细胞的凋亡, 但是对肝癌干细胞的增殖没有影响此外, 本研究结果显示,miR 125b 对肝癌干细胞的迁移能力也有影响, 具有一定的抑制作用因此, 我们相信 mir 125b 在肝癌干细胞中扮演着重要角色虽然本研究结果显示 mir 125b 对肝癌干细胞的自我更新能力及迁移能力具有抑制作用, 但是, 其发挥作用的作用方式及其作用机制有待进一步探讨我们也正在进行这方面的研究,miR 125b 也许通过 Nanog 调控肝癌干细胞的自我更新, 也许通过 ZEB1 影响肝癌干细胞的侵袭转移, 这些都需要进一步研究去明确而本研究结果也为接下来的研究工作奠定了实验室基础, 为肝癌干细胞的研究提供新的实验数据参考文献 : [1] JemalA,BrayF,CenterMM,etal.Globalcancerstatistics [J].CACancerJClin,2011,61(2): [2]ShanJ,ShenJ,LiuL,etal.Nanogregulatesself renewalof cancerstemcelsthroughtheinsulin likegrowthfactorpath wayin human hepatocelularcarcinoma[j]. Hepatology, 2012,56(3): [3] 姜飞洲, 万小平, 陈晓悦, 等.MiR 125b 在肿瘤发生发展中作用的研究进展 [J]. 现代生物医学进展,2010,10 (8): [4]HuangK,DongS,LiW,etal.Theexpresionandregula tionofmicrorna 125bincancers[J].ActaBiochimBiophys Sin(Shanghai),2013,45(10): [5]TsangFH,AuV,LuW J,etal.PrognosticmarkermicroR NA 125binhibitstumorigenicpropertiesofhepatocelularcar cinomacelsviasuppresingtumorigenicmoleculeeif5a2 [J].DigDisSci,2014,59(10): [6]FelicianoA,CastelviJ,Artero CastroA,etal.miR 125b actsasatumorsuppresorinbreasttumorigenesisviaitsnovel directtargetsenpep,ck2-alpha,ccnj,andmegf9[j]. PLoSOne,2013,8(10):e [7] LiY,ChaoY,FangY,etal.MTA1promotestheinvasion andmigrationofnon-smalcellungcancercelsbydownreg ulatingmir 125b[J].JExpClinCancerRes,2013,32:33. [8]ShiXB,XueL,MaAH,etal.miR 125bpromotesgrowth ofprostatecancerxenografttumorthroughtargetingpro-ap optoticgenes[j].prostate,2011,71(5): [9] 张益, 周总光, 王玲, 等.miR 21 和 mir 125 在结直肠癌中的表达及其与临床病理指标的关系 [J]. 中华胃肠外科杂志,2009,12(6): [10] ShibaM,ShinozukaK,SaitoK,etal.MicroRNA 125b regulatesproliferationandradioresistanceoforalsquamous celcarcinoma[j].brjcancer,2013,108(9): [11]WuN,LinX,ZhaoX,etal.MiR 125bactsasanonco geneinglioblastomacelsandinhibitscelapoptosisthrough p53andp38mapk independentpathways[j].brjcancer, 2013,109(11): [12]BousquetM,HarisM H,ZhouB,etal.MicroRNAmiR 125bcausesleukemia[J].ProcNatlAcadSciU SA, 2010,107(50): [13] JiaH Y,WangY X,YanW T,etal.MicroRNA 125b FunctionsasaTumorSuppresorinHepatocelularCarcino macels[j].intjmolsci,2012,13(7): [14]LiangL,WongCM,YingQ,etal.MicroRNA 125bsup presesedhumanlivercancercelproliferationandmetasta sisbydirectlytargetingoncogenelin28b2[j].hepatolo gy,2010,52(5): [15] JiangJX,GaoS,PanYZ,etal.Overexpresionofmi crorna 125b sensitizes human hepatocelularcarcinoma celsto5 fluorouracilthroughinhibitionofglycolysisbytar getinghexokinaseⅡ[j].molmedrep,2014,10(2): [16]MisunoK,LiuX,FengS,etal.Quantitativeproteomica nalysisofsphere formingstem likeoralcancercels[j]. StemCelResTher,2013,4(6):156. ( 收稿 : ; 修回 : ) ( 编辑汪勤俭 )

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

1071 肝癌大多数情况下为原发性肝细胞癌 (hepatocelu larcarcinoma,hcc), 其在世界最常见癌症中排名第五, 且病死率居第三 [1] 研究证实肝癌干细胞(livercancer stemcels,lcscs) 存在于肝癌组织中, 且与肝癌的复发 转移以及肝癌患者的预后差有

1071 肝癌大多数情况下为原发性肝细胞癌 (hepatocelu larcarcinoma,hcc), 其在世界最常见癌症中排名第五, 且病死率居第三 [1] 研究证实肝癌干细胞(livercancer stemcels,lcscs) 存在于肝癌组织中, 且与肝癌的复发转移以及肝癌患者的预后差有