388 第三军医大学学报,2018,40(5) htp://aammt.tmmu.edu.cn 胃癌 (gastriccancer,gc) 是常见的消化系统肿瘤, 在我国发病率接近 30 [1-2] 由于胃癌早期发病症状不太明显, 确诊时已发展为晚期, 细胞的侵袭和转移能力明显, 预后差,5 年生存

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1 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2018,40(5) 387 DOI: /j 双氢青蒿素通过 Wnt/βcatenin 信号通路抑制胃癌细胞的增殖和侵袭刘洪伟, 梅基雄重庆, 重庆市中医院药剂科 [ 摘要 ] 目的探讨双氢青蒿素 (dihydroartemisinin,dha) 对胃癌细胞增殖侵袭和迁移能力的影响及其可能的分子机制方法用不同浓度 ( μmol/L) 的 DHA 分别作用于人胃癌 BGC823 和 SGC7901 细胞, 采用 MTT 法划痕实验 Transwel 法和流式细胞术分别检测细胞的增殖能力迁移能力侵袭能力和细胞周期与凋亡情况 Westernblot 检测细胞中 DVL2 GSK3β pgsk3β βcatenin 和 CyclinD1 等蛋白的表达量结果不同浓度的 DHA 可以抑制胃癌细胞的增殖迁移和侵袭, 且呈浓度依赖性增长 (P<0.05) DHA 作用 48h 后, 细胞 S 期比例显著增加, 诱导细胞凋亡 (P<0.05) DHA 可以降低胃癌细胞 Dvl2 pgsk3β βcatenin 和 CyclinD1 的蛋白表达水平 (P<0.05), 增加 GSK3β 蛋白的表达 (P<0.05) 同时,SKL2001 激活 Wnt/βcatenin 信号通路, 逆转 DHA 对胃癌细胞迁移和侵袭的抑制作用 (P<0.05);XAV939 抑制 Wnt/βcatenin 信号通路, 进一步加强 DHA 对胃癌细胞迁移和侵袭的抑制作用 (P<0.05) 结论 DHA 能有效抑制胃癌细胞的增殖侵袭和迁移, 阻滞细胞周期停留在 S 期, 诱导胃癌细胞凋亡, 其机制可能与抑制 Wnt/βcatenin 信号通路的激活有关 [ 关键词 ] 胃癌细胞 ; 双氢青蒿素 ; 增殖 ;Wnt/βcatenin [ 中图法分类号 ] R284.1;R735.2;R966 [ 文献标志码 ] A Dihydroartemisinininhibitsproliferationandinvasioninhumangastriccancercels throughsuppresionofwnt/βcateninsignalingpathways LIU Hongwei, MEIJixiong DepartmentofPharmacy, ChongqingHospitalofTraditionalChineseMedicine, Chongqing,400021,China [Abstract] Objective Toinvestigatetheefectofdihydroartemisinin(DHA)ontheproliferation andinvasioningastriccancercelsanditsposiblemolecularmechanism.methods Humangastriccancer cellinesbgc823andsgc7901wereexposedtodiferentconcentrationsofdha.mttasay,wound healingasay, Transwelchambertest, and flow cytometrywereused respectivelytomeasurethecel proliferation,migration,invasion,andcelcycledistributionandapoptosis.theexpresionlevelsofdvl2, GSK3β,pGSK3β,βcateninandCyclinD1weredetectedbyWesternbloting.Results DHAinhibited theproliferation,invasionandmigrationofbgc823andsgc7901celsinaconcentrationdependentmanner (P<0.05).DHAexposurefor48hsignificantlyincreasedthepercentageofgastriccancercelsatSphase, andinducedcelapoptosis(p<0.05).dha treatmentresultedinthedecreasesintheproteinlevelsof DVL2,pGSK3β,βcateninandCyclinD1(P<0.05),andincreaseinthatofGSK3β(P<0.05). SKL2001,agonistoftheWnt/βcateninpathway,reversedtheinhibitoryefectofDHAonproliferationand invasionofgastriccancercels(p<0.05),whiletheinhibitor,xav939,enhancedtheaboveefectsofdha (P<0.05).Conclusion DHAinhibitstheproliferation,invasionandmigration,areststhecelcycleatS phaseandinducescelapoptosisingastriccancercels,whichmaybeasociatedwithitssuppresionofwnt/ βcateninsignalingpathway. [Keywords] gastriccancercels;dihydroartemisinin;proliferation;wnt/βcatenin Corespondingauthor:MEIJixiong, mjx0025@163.com [ 通信作者 ] 梅基雄, mjx0025@163.com [ 优先出版 ] htp://kns.cnki.net/kcms/detail/ r html

2 388 第三军医大学学报,2018,40(5) htp://aammt.tmmu.edu.cn 胃癌 (gastriccancer,gc) 是常见的消化系统肿瘤, 在我国发病率接近 30 [1-2] 由于胃癌早期发病症状不太明显, 确诊时已发展为晚期, 细胞的侵袭和转移能力明显, 预后差,5 年生存率不足 20 [3-4] 近年来, 随着分子生物学的不断发展, 虽然胃癌的发病率和病死率显著降低, 但仍然是癌症死亡的第三大原因 [5] 手术结合药物化疗是目前临床上治疗胃癌的主要手段, 但是复发率较高, 药物治疗的并发症较多双氢青蒿素 (dihydroartemisinin,dha) 是一种半合成的青蒿素衍生物, 具有抗肿瘤的作用 [6-7] 有研究发现,DHA 能抑制卵巢癌 SKOV3 细胞的增殖, 诱导细胞凋亡 [8] 最新研究表明,DHA 能够通过激活 JNK1/2 和 p38mapk 通路促进胃癌细胞的凋亡, 提示 DHA 对胃癌具有一定的抗癌活性 [9] 本实验采用不同浓度的 DHA 作用于 BGC823 和 SGC7901 细胞, 观察 DHA 对胃癌细胞 BGC823 和 SGC7901 增殖侵袭迁移和凋亡能力及 Wnt/βcatenin 通路的影响, 进一步探讨 DHA 可能的作用机制, 旨在为临床上 DHA 抗肿瘤治疗提供一定的实验依据 1 材料与方法 1.1 主要试剂与材料人胃癌 BGC823 和 SGC7901 细胞 ( 中国科学院上海细胞生物研究所 ), 胎牛血清新生小牛血清和胰蛋白酶 ( 美国 HyClone 公司 ), 青霉素 / 链霉素 ( 北京鼎国昌盛生物技术公司 ),DMEM 培养基和 RPMI1640 培养基 ( 美国 GibcoBRL 公司 ),BCA 法蛋白浓度测定试剂盒 ( 碧云天公司 ),AV939 兔抗人 Dvl2 GSK3β pgsk3β βcatenin 和 CyclinD1 抗体 ( 美国 Sigma 公司 ), 鼠抗人 GAPDH 单克隆抗体 ( 武汉博士德生物工程有限公司 ),SKL2001(Milipore 公司 ),HRP 标记的羊抗兔 IgG 和羊抗鼠 IgG( 美国 CST 公司 ),DHA( 奥伦生物公司 ) 1.2 细胞培养与分组常规使用含 10 胎牛血清和双抗 ( 青霉素 100U/L, 链霉素 100mg/L) 的 DMEM 培养液 ( 胃癌 BGC823 细胞 ) 和 RPMI1640 培养液 ( 胃癌 SGC7901 细胞 ), 在 37,5CO 2 的饱和湿度恒温培养箱中培养, 隔天换液用无血清的 DMEM/RPMI1640 培养基将 DHA 稀释成不同的浓度 :10μmol/L( 低浓度 ) 20μmol/L( 中浓度 ) 及 40μmol/L( 高浓度 ) 将 BGC823 和 SGC 7901 细胞分为低剂量组中剂量组高剂量组和空白对照组, 将对数生长期的细胞接种至 6 孔板, / 孔, 当细胞汇合度达 70 ~80, 实验组加入 3 种浓度的 DHA 溶液, 空白对照组加入等量无血清的 DMEM/ RPMI1640 培养基,Wnt 抑制剂组加入高浓度 DHA 和 XAV939(1μmol/L),Wnt 激动剂组加入高浓度 DHA 和 SKL2001(20μmol/L), 每组重复设置 5 个孔 1.3 MTT 法检测细胞增殖活力取对数生长期的 BGC823 和 SGC7901 细胞, 以 / 孔接种到 96 孔板中, 细胞贴壁后, 加入不同浓度的 DHA( μmol/L) 分别孵育 h 后, 移去含 DHA 的培养基, 加入 10μL/ 孔 MTT(5mg/mL) 于 37 孵育 4h, 弃去上清, 每孔加入 150μLDMSO, 用酶标仪测定各孔在 570nm 波长的光密度值 [D(570)], 每个样本设置 3 个复孔 1.4 划痕实验检测细胞迁移将对数生长期的胃癌细胞以 / 孔接种到提前在底部画好刻度的 6 孔板, 当细胞汇合度达到 95 时, 移去培养基, 用已消毒的 10μL 枪头垂直划一条泳道, 用 PBS 洗涤 2 次后, 在显微镜下拍照, 记录 0h 细胞泳道的距离然后加入不同浓度的含无血清培养基 DHA, 培养 48h 后, 在显微镜下观察细胞迁移情况, 拍照, 每组细胞随机选取 5 处划痕位置测量宽度细胞相对迁移能力 =(0h 划痕距离 -48h 划痕距离 )/0h 划痕距离 Transwel 实验检测细胞侵袭用 Matrigel 包被 Transwel 小室基底膜上室面, 室温过夜取在对数生长期的胃癌细胞, 经胰酶消化后, / 孔于 24 孔板 Transwel 中,Transwel 小室的上室加入 200μL 含不同 DHA 浓度的无血清培养基, 在 Transwel 下室加入 600μL15 胎牛血清的 DEMR/ RPMI1640 培养基常规培养 48h 后,4 多聚甲醛固定 10min, 用 PBS 清洗 2 次, 甲醇透化 5min, 加入 1 结晶紫染色液染色 5min,PBS 洗涤 2 遍, 在显微镜下观察细胞并计数 1.6 流式细胞仪检测细胞周期取对数生长期的胃癌细胞, 以 / 孔接种于 6 孔板, 用不同浓度的 DHA 作用于胃癌细胞 48h, 胰酶消化收集细胞,PBS 洗涤后制备成细胞悬液, 加入预冷的 70 乙醇,4 固定过夜加入 PBS 洗涤 2 次后弃上清, 加入 PI 工作液, 室温下避光孵育 30min 后, 流式细胞仪检测细胞周期

3 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2018,40(5) 流式细胞仪检测细胞凋亡不同浓度的 DHA 孵育胃癌细胞 ( / 孔 )48h 后, 用预冷的 PBS 洗涤 2 次, 加入 10μLAnnexinV FITC 和 5μL 碘化丙啶染色液 (0.25mg/mL), 轻轻混匀, 室温避光孵育 20min, 流式细胞仪检测细胞凋亡 1.8 RTPCR 检测 Wnt/βcatenin 相关蛋白的表达不同浓度的 DHA 溶液处理胃癌细胞 48h 后, 常规收集胃癌细胞, 并按照 TRIzol 试剂盒步骤提取细胞中总 RNA, 以 βactin 为内参,qRTPCR 按照 SYBR Green 试剂盒说明书进行反应体系的配制, 检测 Dvl2 GSK3β βcatenin 和 CyclinD1 在细胞中的表达水平 PCR 引物均采用 Primer5 软件设计, 并由宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司合成 Dvl2 引物序列为 5 AGGAT ACCACCCTTCCGTTG3 ( 正义链 ) 和 5 GGCGCCAAG TACTTTTTCAA3 ( 反义链 ), 扩增片段大小为 109bp; GSK3β 引物序列为 5 GACGCTCCCTGTGATTTAT GTC3 ( 正义链 ) 和 5 GTTAGTCGGGCAGTTGGTG TAT3 ( 反义链 ), 扩增片段大小为 537bp;βcatenin 引物序列为 5 CGGTACATGCATGACTGAGAC3 ( 正义链 ) 和 5 GTCACGTGGTACGACGTCAGAT3 ( 反义链 ), 扩增片段大小为 310bp;CyclinD1 引物序列为 5 GAGTAGTGCGAAGCATAGGTCT3 ( 正义链 ) 和 5 CTAGCACGAGTAGTCGAGCGC3 ( 反义链 ), 扩增片段大小为 455bp βactin 引物序列为 5 ACGAGACCIAC CTTCAACTCCATC3 ( 正义链 ) 和 5 TAGAAGCATTT GCGGTGGACGA3 ( 反义链 ), 扩增片段大小为 304bp 1.9 Westernblot 检测 Wnt/βcatenin 相关蛋白的表达不同浓度的 DHA 溶液处理胃癌细胞 48h 后, 常规收集胃癌细胞, 用 RIPA 裂解液裂解细胞后离心, 取上清液, 用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度在 SDSPAGE 凝胶中, 每个泳道加入 40μg 的蛋白样品,110V 电泳分离蛋白, 电转至 PVDF 膜,5 脱脂奶粉室温封闭 1h, 然后将条带分别加入 Dvl2 GSK3β pgsk3β βcatenin 和 CyclinD1 一抗液中,4 孵育过夜,TBST 洗膜 3 10min, 二抗 37 孵育 2h,TBST 洗膜 3 30min,ECL 显影运用 QuantityOne 软件分析目的蛋白条带与 βactin 灰度比值, 计算相对表达量 1.10 统计学分析计量资料以 x±s 珋表示, 采用 SPSS21.0 统计软件进行组间单因素方差分析, 检验水准 α= 结果 2.1 DHA 抑制胃癌细胞的增殖用不同浓度的 DHA 刺激 BGC823 和 SGC7901 细胞 h, 细胞增殖活性明显下降, 与空白对照组比较,DHA 可显著抑制胃癌细胞的增殖, 且随着作用时间和作用浓度的增加, 细胞增殖抑制率逐渐增加 (P<0.05), 见图 DHA 对胃癌细胞周期的影响 DHA 对胃癌细胞周期的影响见图 2 与空白对照组比较,DHA 能够增加 S 期细胞比例, 减少 G 2 /M 期细胞比例 (P<0.05) 这提示 DHA 可将 BGC823 和 SGC7901 细胞阻滞在 S 期 2.3 DHA 诱导胃癌细胞凋亡流式细胞术检测细胞凋亡情况见图 3 不同剂量的 DHA 能明显促进人胃癌 BGC823 和 SGC7901 细胞的凋亡, 随着 DHA 剂量的增加, 细胞凋亡率明显增加, 与空白对照组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 1: 空白对照组 ;2:DHA 低剂量组 ;3:DHA 中剂量组 ;4:DHA 高剂量组 ;a:p<0.05, 与空白对照组比较 ;b:p< 0.05, 与 24h 比较图 1 DHA 作用不同时间对 BGC823(A) 和 SGC7901(B) 细胞增殖的影响

低剂量组 ;3:DHA 中剂量组 ;4:DHA 高剂量组 ;a:p<0.05, 与空白对照组比较图 2 DHA 对 BGC823 和 SGC7901 细胞周期的影响 '#!!! #!!! #! #!!!!!! #! ##!

4 390 第三军医大学学报,2018,40(5) htp://aammt.tmmu.edu.cn +( )* )*! )*!#!#!#!# ' '!#!#!#!# ( A: 流式细胞术检测 DHA 对 BGC823 和 SGC7901 细胞周期的影响 ;B C: 分别为 DHA 对 BGC823(B) 和 SGC7901(C) 细胞周期的影响 1: 空白对照组 ;2:DHA 低剂量组 ;3:DHA 中剂量组 ;4:DHA 高剂量组 ;a:p<0.05, 与空白对照组比较图 2 DHA 对 BGC823 和 SGC7901 细胞周期的影响 '#!!! #!!! #! #!!!!!! #! ##!! ## ## # # # A: 流式细胞术检测 DHA 对 BGC823 和 SGC7901 细胞凋亡的影响 ;B C: 分别为 DHA 对 BGC823(B) 和 SGC7901(C) 细胞凋亡率的影响 1: 空白对照组 ;2:DHA 低剂量组 ;3:DHA 中剂量组 ;4:DHA 高剂量组 ;a:p<0.05, 与空白对照组比较图 3 DHA 对 BGC823 和 SGC7901 细胞凋亡的影响

htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2018,40(5) 391 2.4 DHA 抑制胃癌细胞的侵袭和迁移 Transwel 侵袭实验结果显示, 低中高 3 个不同浓度的 DHA 作用于胃癌细胞 48h 后, 显著降低了胃癌细胞侵袭的数量 (P<0.

5 DHA 对胃癌细胞 Dvl2 GSK3β βcatenin 和 CyclinD1mRNA 表达量的影响低中高 3 个不同浓度的 DHA 作用于胃癌细胞 48h 后, 采用 RTPCR 检测 Dvl2 GSK3β βcatenin 和 CyclinD1mRNA 的表达量, 结果见图 5 与空白对照组比较,DHA 组 BGC823 和 SGC7901 细胞 Dvl2 βcatenin 和

5 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2018,40(5) DHA 抑制胃癌细胞的侵袭和迁移 Transwel 侵袭实验结果显示, 低中高 3 个不同浓度的 DHA 作用于胃癌细胞 48h 后, 显著降低了胃癌细胞侵袭的数量 (P<0.05, 图 4A), 且 DHA 抑制胃癌细胞的侵袭能力呈一定的浓度依赖性划痕实验结果显示, 在细胞划痕 48h 后, 与空白对照组比较,DHA 组细胞的划痕愈合速度显著变慢 (P<0.05, 图 4B) 提示 DHA 可以抑制 BGC823 和 SGC7901 细胞的侵袭和迁移能力 2.5 DHA 对胃癌细胞 Dvl2 GSK3β βcatenin 和 CyclinD1mRNA 表达量的影响低中高 3 个不同浓度的 DHA 作用于胃癌细胞 48h 后, 采用 RTPCR 检测 Dvl2 GSK3β βcatenin 和 CyclinD1mRNA 的表达量, 结果见图 5 与空白对照组比较,DHA 组 BGC823 和 SGC7901 细胞 Dvl2 βcatenin 和 CyclinD1mRNA 的表达量明显降低 (P<0.05), 同时 GSK3βmRNA 的表达量较空白对照组升高 (P<0.05) 2.6 DHA 对胃癌细胞 Dvl2 GSK3β pgsk3β β catenin 和 CyclinD1 蛋白表达量的影响低中高 3 个不同浓度的 DHA 作用于胃癌细胞 48h 后, 采用 Westernblot 进一步检测 Dvl2 GSK3β pgsk3β βcatenin 和 CyclinD1 蛋白的表达量, 结果见图 6 与空白对照组比较,DHA 组 BGC823 和 SGC 7901 细胞 Dvl2 pgsk3β βcatenin 和 CyclinD1 蛋白的表达量明显降低 (P<0.05), 同时 GSK3β 蛋白的表达量较空白对照组升高 (P<0.05), 进一步说明 DHA 作用于胃癌细胞后导致 GSK3β 的磷酸化水平降低 2.7 阻断或激活 Wnt/βcatenin 信号通路后 DHA 对胃癌细胞侵袭和迁移的影响进一步研究 DHA 通过抑制 Wnt/βcatenin 信号通路激活参与胃癌细胞的侵袭和迁移, 采用 XAV939 抑制和 SKL2001 激活 Wnt/βcatenin 信号通路 Transwel 侵袭实验结果 ( 图 7A) 显示,SKL2001 激活 Wnt/β catenin 信号通路后, 高浓度 DHA 作用于胃癌细胞, 胃癌细胞侵袭的数量与空白对照组比较未见明显差异 (P>0.05), 而 XAV939 抑制 Wnt/βcatenin 信号通路后,DHA 对胃癌细胞侵袭的数量进一步增加划痕实验结果 ( 图 7B) 显示,SKL2001 激活 Wnt/βcatenin 信号通路后, 能够明显抑制 DHA 对划痕愈合速度减慢的影响 (P<0.05), 而 XAV939 抑制 Wnt/βcatenin 信号通路后, 进一步减慢了划痕愈合速度提示 DHA 可能是通过调节相应靶蛋白的表达抑制 Wnt/βcatenin 信号通路的激活, 从而抑制胃癌 BGC823 和 SGC7901 细胞的侵袭和迁移 1: 空白对照组 ;2:DHA 低剂量组 ;3:DHA 中剂量组 ;4:DHA 高剂量组 ;a:p<0.05, 与空白对照组比较图 4 DHA 对 BGC823 和 SGC7901 细胞侵袭 (A) 和迁移 (B) 的影响!# '!!# '! 1: 空白对照组 ;2:DHA 低剂量组 ;3:DHA 中剂量组 ;4:DHA 高剂量组 ;a:p<0.05, 与空白对照组比较图 5 RTPCR 检测各组 BGC823(A) 和 SGC7901(B) 细胞中 Wnt/βcatenin 相关蛋白的表达

392 第三军医大学学报,2018,40(5) htp://aammt.tmmu.edu.cn!# # #!# # #!# #!# # 1: 空白对照组 ;2:DHA 低剂量组 ;3:DHA 中剂量组 ;4:DHA 高剂量组 ;a:p<0.

相关蛋白的表达 1: 空白对照组 ;2:DHA+SKL2001 组 ;3:DHA+XAV939 组 ;4:DHA 高剂量组 ;a:p<0.

[12] YAMACHIKA 等研究发现 ART 通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制肿瘤, 与常规的药物相比, 具有一定的选择性双氢青蒿素 (DHA) 是从中草药青蒿素中分离出来的衍生物和活性代谢物, 可以与亚铁原子发生反应, 引起 DHA 过氧桥断裂而生成细胞内活性氧代谢产物, 诱导肿瘤细胞发生氧化损伤

6 392 第三军医大学学报,2018,40(5) htp://aammt.tmmu.edu.cn!# # #!# # #!# #!# # 1: 空白对照组 ;2:DHA 低剂量组 ;3:DHA 中剂量组 ;4:DHA 高剂量组 ;a:p<0.05, 与空白对照组比较 ;A B: BGC823 细胞 Westernblot 检测蛋白表达及半定量分析结果 ;C D:SGC7901 细胞 Westernblot 检测蛋白表达及半定量分析结果图 6 Westernblot 检测各组 BGC823 和 SGC7901 细胞中 Wnt/βcatenin 相关蛋白的表达 1: 空白对照组 ;2:DHA+SKL2001 组 ;3:DHA+XAV939 组 ;4:DHA 高剂量组 ;a:p<0.05, 与空白对照组比较图 7 阻断或激活 Wnt/βcatenin 信号通路后 DHA 对各组胃癌细胞侵袭 (A) 和迁移 (B) 的影响 3 讨论越来越多的研究表明, 青蒿素 (artemisinin,art) 通过诱导细胞凋亡抗血管生成氧化应激等途径发挥抗肿瘤的作用 [10-11] [12] YAMACHIKA 等研究发现 ART 通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制肿瘤, 与常规的药物相比, 具有一定的选择性双氢青蒿素 (DHA) 是从中草药青蒿素中分离出来的衍生物和活性代谢物, 可以与亚铁原子发生反应, 引起 DHA 过氧桥断裂而生成细胞内活性氧代谢产物, 诱导肿瘤细胞发生氧化损伤 [13-14] 最新研究表明,DHA 也可能是一个潜在的化学预防药物, 在多种人类肿瘤细胞, 通过抑制细胞增殖阻滞细胞周期诱导细胞凋亡抑制血管生成和转移等途径发挥抗肿瘤的作用 [15-17] Wnt/βcatenin 信号通路在进化上高度保守, 参与调节细胞增殖细胞极性和细胞黏附等多种细胞活动 [18] 大量的研究发现,Wnt/βcatenin 信号通路对结直肠癌乳腺癌肝癌等恶性肿瘤细胞的发生发展起着关键性的作用 [19-21] 癌症细胞中 Wnt/βcatenin 信号通路的异常激活与 Wnt 蛋白的异常表达 βcate

7 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2018,40(5) 393 nin 蛋白的核转移等有关在细胞核中,βcatenin 蛋白与 T 细胞因子结合, 促进靶基因的转录, 激活下游基因, 促进肿瘤细胞的增殖, 抑制细胞凋亡王文娟 [22] 等研究发现,DHA 可以通过阻断 Wnt/βcatenin 信 [23] 号通路抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭 HUI 等的研究结果显示,DHA 通过靶向作用 Wnt/βcatenin 信号通路抑制皮肤癌鳞状 A431 细胞的生长, 促进 Caspase3 蛋白的表达水平, 降低 Survivin 蛋白的表达水平同时多项研究表明 Wnt/βcatenin 信号通路在胃癌的发生发展中发挥着重要作用 [24-25] Wnt 蛋白是一种细胞生长的信号因子, 可以作用于 Frz 蛋白, 在 LRP 蛋白的作用下, 激活细胞内的 Dvl 蛋白, 诱导细胞内的信号转导, 使 GSK3β 发生磷酸化并抑制其活性, 进而抑制 βcatenin 的降解, 使得 βcatenin 蓄积 β catenin 蛋白在细胞连接处与 Ecadherin 形成黏附复合物, 增加细胞间的黏附作用胞质中游离的 βcatenin 转入细胞核, 进一步激活下游 CyclinD1 等靶基因的转录, 使细胞的增殖和迁移能力增加这些靶基因参与调控肿瘤的发生发展和转移等过程有研究表明, 肺癌患者的 βcatenin 表达量越高, 肿瘤的恶性程度和侵袭能力越高强, 预后越差 [26] BGC823 为一种低分化的胃腺癌细胞系,SGC 7901 为一种中分化胃癌细胞系, 在本研究中采用不同浓度的 DHA 处理 BGC823 和 SGC7901 细胞发现, DHA 可以抑制胃癌细胞的增殖抑制率侵袭细胞数迁移愈合率,S 期细胞比例呈浓度依赖性增加在其他研究中也显示 DHA 对胃癌细胞增殖和侵袭的抑制作用, 与本研究具有相近结果 [9,27] 在进一步机制性研究中,RTPCR 结果显示 DHA 能够抑制 Dvl2 β catenin 和 CyclinD1mRNA 的表达, 同时促进 GSK3β mrna 的表达量 Westernblot 结果显示 DHA 下调 Dvl2 pgsk3β βcatenin 和 CyclinD1 蛋白的表达, 上调 GSK3β 蛋白的表达在 Wnt/βcatenin 信号通路中,GSK3β 可以抑制 βcatenin 蛋白而抑制细胞的增殖, 而 pgsk3β 可以抑制 GSK3β 的活性促进增殖因此,DHA 可能通过抑制 Dvl2 而减少 GSK3β 磷酸化, 进而抑制 βcatenin 和 CyclinD1 来减少胃癌细胞增殖侵袭和迁移为进一步验证 DHA 通过 Wnt/β catenin 信号通路发挥作用, 采用 XAV939 和 SKL2001 抑制和激活 Wnt/βcatenin 信号通路, 结果显示 SKL2001 激活 Wnt/βcatenin 信号通路可以逆转 DHA 对胃癌细胞迁移和侵袭的抑制作用,XAV939 抑制 Wnt/βcatenin 信号通路可以进一步加强 DHA 对胃癌细胞迁移和侵袭的抑制作用这说明 DHA 可能是通过调节相应靶蛋白的表达抑制 Wnt/βcatenin 信号通路的激活, 从而抑制胃癌 BGC823 和 SGC7901 细胞的增殖侵袭和迁移总之,DHA 可以通过调节相应靶蛋白的表达抑制 Wnt/βcatenin 信号通路的激活, 从而抑制胃癌 BGC 823 和 SGC7901 细胞的增殖侵袭和迁移 DHA 具有广泛的抗肿瘤作用, 毒副作用小, 可能是胃癌临床治疗的潜在替代药物, 为胃癌的药物治疗开辟新的途径参考文献 : [1] LYUZK,LICL,JIN Y,etal.Paeonolexertspotential activitiestoinhibitthegrowth,migrationandinvasionofhu mangastriccancerbgc823celsviadownregulatingmmp2 andmmp9[j].molmedrep,2017,16(5): DOI: /mmr [2] FITZMAURICEC,DICKERD,PAINA,etal.Theglobal burdenofcancer2013[j].jamaoncol,2015,1(4): doi: /jamaoncol [3] FERLAYJ, SOERJOMATARAM I, DIKSHIT R, etal. Cancerincidenceandmortalityworldwide:sources,methods andmajorpaternsinglobocan2012[j].intjcancer, 2015,136(5):E359-E386.DOI: /ijc [4]NAGINIS.Carcinomaofthestomach:Areviewofepidemiol ogy,pathogenesis,moleculargeneticsandchemoprevention [J].WorldJGastrointestOncol,2012,4(7): DOI: /wjgo.v4.i [5]HSUKW,FANGW L,HUANGKH,etal.Notch1path waymediatedmicrorna1515ppromotesgastriccancerpro gresion[j].oncotarget,2016,7(25): DOI: /oncotarget [6] JIN H,JIANG A Y,WANG H,etal.Dihydroartemisinin andgefitinibsynergisticalyinhibitnsclc celgrowthand promoteapoptosisviatheakt/mtor/stat3pathway[j]. MolMedRep,2017,16(3): DOI: / mmr [7] ZHANG T,HU Y,WANG T,etal.Dihydroartemisinin inhibitstheviabilityofcervicalcancercelsbyupregulating caveolin1andmitochondrialcarierhomolog2:involvement ofp53activationandnad(p)h:quinoneoxidoreductase1 downregulation[j].intjmolmed,2017,40(1): DOI: /ijmm [8] ZHAOJ,PAN Y, LIX, etal. Dihydroartemisinin and curcuminsynergisticalyinduceapoptosisinskov3celsvia upregulationofmir124targetingmidkine[j].celphysiol Biochem,2017, 43(2): DOI: /

8 394 第三军医大学学报,2018,40(5) htp://aammt.tmmu.edu.cn [9] ZHANGS,SHIL,MAH,etal.Dihydroartemisinininduces apoptosisinhumangastriccancercellinebgc823through activationofjnk1/2andp38mapksignalingpathways[j]. JReceptSignalTransductRes,2017,37(2): DOI: / [10]DASAK.Anticancerefectofantimalarialartemisinincom pounds[j].annmedhealthscires,2015,5(2): doi: / [11]CRESPOORTIZMP,WEIMQ.Antitumoractivityofarte misininanditsderivatives:from awelknownantimalarial agenttoapotentialanticancerdrug[j].jbiomedbiotechn ol,2012,2012: doi: /2012/ [12] YAMACHIKAE,HABTE T, ODA D. Artemisinin: an alternativetreatmentfororalsquamouscelcarcinoma[j]. AnticancerRes,2004,24(4): [13] ZHANGXG,LIG X,ZHAO SS,etal.A review of dihydroartemisininasanothergiftfrom traditionalchinese medicinenotonlyformalariacontrolbutalsoforschistoso miasiscontrol[j].parasitolres,2014,113(5): doi: /s z. [14]ZHANGZ,GUOM,ZHAOS,etal.ROSJNK1/2depend entactivationofautophagyisrequiredfortheinductionof antiinflammatoryefectofdihydroartemisinininliverfibrosis [J].FreeRadicBiolMed,2016,101: DOI: /j.freeradbiomed [15] ZHANGCZ,ZHANGH,YUNJ,etal.Dihydroartemisinin exhibitsantitumoractivitytowardhepatocelularcarcinomain vitroandinvivo[j].biochem Pharmacol,2012,83(9): DOI: /j.bcp [16] LIN R,ZHANG Z,CHEN L,etal.Dihydroartemisinin (DHA)inducesferoptosisandcausescelcyclearestin headandneckcarcinomacels[j].cancerlet,2016,381 (1): DOI: /j.canlet [17] LIUY,WANGW,XUJ,etal.Dihydroartemisinininhibits tumorgrowthofhumanosteosarcomacelsbysuppresing Wnt/betacateninsignaling[J].OncolRep,2013,30(4): DOI: /or [18] MOHAMMED M K,SHAO C,WANG J,etal.Wnt/β cateninsignalingplaysaneverexpandingroleinstem cel selfrenewal,tumorigenesisandcancerchemoresistance[j]. GenesDis,2016,3(1):11-40.DOI: /j.gendis [19]CAOJ,YANXR,LIUT,etal.MicroRNA552promotes tumorcelproliferationandmigrationbydirectlytargeting DACH1viatheWnt/betacateninsignalingpathwayincolo rectalcancer[j].oncollet,2017,14(3): DOI: /ol [20]ZHENGY,TRIVEDIT,LINRC,etal.Losofthevita mindreceptorinhumanbreastandprostatecancersstrongly inducescelapoptosisthroughdownregulationofwnt/beta cateninsignaling[j].boneres,2017,5:17023.doi: /boneres [21]TANZ,ZHENGH,LIUX,etal.MicroRNA1229over expresionpromotescelproliferationandtumorigenicityand activateswnt/betacateninsignalinginbreastcancer[j]. Oncotarget,2016,7(17): DOI: /oncotarget [22] 王文娟, 赵丹, 徐静, 等. 双氢青蒿素通过阻断 Wnt/β catenin 信号抑制骨肉瘤细胞系体外增殖和侵袭 [J]. 基础医学与临床,2014,34(8): DOI: /j.isn WANGW J,ZHAO D,XU J,etal.Dihydroartemisinin (DHA)inhibitsproliferationandinvasionofosteosarcoma cellineinvitrobysuppresingwnt/βcateninsignaling [J].BasicClinMed,2014,34(8): DOI: /j.isn [23] HUIH Y,WUN,WUM,etal.Dihydroartemisininsup presesgrowthofsquamouscelcarcinomaa431celsbytar getingthewnt/betacateninpathway[j].anticancerdrugs, 2016,27(2): DOI: /CAD [24]YUEH,TANGB,ZHAOY,etal.MIR519dsuppreses the gastric cancer epithelialmesenchymaltransition via Twist1andinhibitsWnt/betacateninsignalingpathway[J]. AmJTranslRes,2017,9(8): [25] MAO J,LIANG Z,ZHANG B,etal.UBR2enrichedin p53deficientmousebonemarow mesenchymalstem cel exosomepromotedgastriccancerprogresionviawnt/beta cateninpathway[j].stem Cels,2017,35(11): DOI: /stem [26] JINJ,ZHANP,KATOHM,etal.Prognosticsignificance ofβcateninexpresioninpatientswithnonsmalcellung cancer:ametaanalysis[j]. TranslLungCancerRes, 2017,6(1): DOI: /tlcr [27]SUNH,MENGX,HANJ,etal.Anticanceractivityof DHAongastriccanceraninvitroandinvivostudy[J]. TumourBiol,2013,34(6): DOI: / s ( 收稿 : ; 修回 : ) ( 编辑张维 )

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot