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翕握寿
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1 1512 DOI: /j 永生化食管上皮恶变细胞中核干细胞因子细胞周期蛋白 B1 和 PTEN 的表达胡梦竹 1, 王娟 2, 张巧 3, 高社干 4 1, 张功员 ( 郑州, 郑州大学公共卫生学院 : 流行病与卫生统计学教研室 1, 卫生毒理学教研室 3 ; 石家庄, 河北省人民医院病案统计室 2 ; 河南洛阳, 河南科技大学第一附属医院肿瘤内科 4 ) [ 摘要 ] 目的观察核干细胞因子 (nucleostemin,ns) 细胞周期蛋白 B1(CyclinB1) 及抑癌基因 PTENmRNA 和蛋白的表达情况方法正常食管上皮细胞 (shantouhumanembryonicesophageal epithelialcelline,shee) 和永生化食管上皮恶变细胞 (shantouhumanembryonicesophagealcarcinoma epithelialcelline,sheec) 连续传代培养, 取对数生长期 SHEE 和 SHEEC 细胞, 采用 RTPCR 及 Western blot 方法检测细胞中 NS CyclinB1 及 PTENmRNA 和蛋白的表达并做相关性分析,MTT 法检测抑制 NS 表达后的细胞增殖活性结果以 SHEE 细胞中 NS CyclinB1 和 PTENmRNA 的表达量为 1,SHEEC 细胞中对应的相对表达量分别为 (2.047±0.507) (2.214±0.213) 及 (0.668±0.188), 两组比较差异均有统计学意义 (P<0.05);SHEE 及 SHEEC 细胞中 NS CyclinB1 及 PTEN 蛋白表达量分别为 (1.142± 0.113),(3.161±0.108) (1.585±0056),(2.173±0.058) 及 (1.894±0.341),(1.162±0.524), 两组比较差异均有统计学意义 (P<0.05);NSmRNA 和蛋白与 CyclinB1mRNA 和蛋白的表达呈正相关 (r= 0.832,P<0.01;r=0.991,P<0.05), 与 PTENmRNA 和蛋白的表达呈负相关 (r=-0.924,p<0.01; r=-0.769,p<0.05);mtt 检测结果显示,NSRNA 干扰 (RNAinterference,RNAi) 组与空白对照组和阴性对照组在干扰后 12h 细胞增殖能力差异无统计学意义 (P>0.05), 而在干扰后 h 差异有统计学意义 (P<0.05) 结论 SHEEC 细胞中 NS CyclinB1mRNA 和蛋白的表达量均高于 SHEE, 而 PTEN 的表达量低于 SHEE,NS 可能对细胞恶变有影响 [ 关键词 ] 永生化食管上皮恶变细胞 ; 核干细胞因子 ; 细胞周期蛋白 B1;PTEN [ 中图法分类号 ] R329.28;R730.23;R735.1 [ 文献标志码 ] A Expresion ofnucleostemin, Cyclin B1 and PTEN in immortalized esophageal epithelialmalignantcels HuMengzhu 1,WangJuan 2,ZhangQiao 3,GaoShegan 4,ZhangGongyuan 1 ( 1 DepartmentofEpidemiologyandHealth Statistics, 3 DepartmentofHealthToxicology,ColegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan Province,450001; 2 MedicalRecordandStatisticsRoom,HebeiProvincialPeople shospital,shijiazhuang,hebei Province,050000; 4 DepartmentofMedicalOncology,FirstAfiliatedHospitalofHenanUniversityofScienceand Technology,Luoyang,HenanProvince,471000,China) [Abstract] Objective Todeterminetheexpresionofnucleostemin(NS),CyclinB1andtumor suppresorgene,phosphataseandtensinhomolog(pten)atmrnaandproteinslevelsinshantouhuman embryonicesophagealepithelialcelline(shee) andshantouhumanembryonicesophagealcarcinoma epithelialcelline(sheec).methods TheSHEEandSHEECcelswerecontinuouslysubcultured,and thecelsatthelogarithmicgrowthphasewereselectedfortheexpresionofns,cyclinb1andpten at [ 基金项目 ] 河南省基础与前沿技术研究计划项目 ( ) [ 通信作者 ] 张功员, zgy@ zu.edu.cn [ 优先出版 ] htp://

2 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2016,38(13) 1513 mrnaandproteinslevelsbyrtpcrandwesternbloting.thelevelswereanalyzedforcorelation.cel viabilitywasdetectedbymttasayafterinterferenceexpresionofns.results ThemRNAexpresionof NSandCyclinB1were2.047±0.507and2.214±0.213timeshigher,whilethatofPTENwas0.668± 0188timeslowerintheSHEECcelsthantheSHEEcels(P<0.05).Significancediferenceswerealso seenintheproteinlevelsofns,cyclinb1andptenbetweenthesheeandsheeccels(1.142±0.113vs 3.161±0.108,1.585±0.056vs2.173±0.058,1.894±0.341vs1.162±0.524,P<0.05).ThemRNA andproteinexpresionlevelsofnswerepositivelycorelatedwiththoseofcyclinb1(r=0.832,p<0.01; r=0.991,p<0.01),andnegativelycorelatedwithpten(r=-0.924,p<0.01;r=-0.769,p< 005).MTTasayshowedthattherewerenosignificantdiferenceincelproliferationamongNSRNAi group,mockgroup,andncgroupat12hafterrnainterference,butsignificantdiferenceswereseenin 24,36and48hthereafter(P<0.05).Conclusion TheexpresionofNSandCyclinB1atmRNAand proteinlevelsarehigher,whilethoseofptenislowerinsheeccelsthansheecels.nsmayafectthe malignantprogresionofcels. [Keywords] Shantouhumanembryonicesophagealcarcinomaepithelialcelline;nucleostemin; CyclinB1;phosphataseandtensinhomolog SupportedbytheProjectofBasicandAdvancedTechnologyResearchPlanofHenanProvince( ).Corespondingauthor:ZhangGongyuan, zu.edu.cn 目前, 食管癌仍是需要我国重点防控的恶性肿瘤之一 [1] 核干细胞因子(nucleostemin,NS) 是 2002 年 [2] Tsai 等发现的一个集中在大多数干细胞和许多肿瘤细胞中的新型蛋白, 可能有维持干细胞和癌细胞增殖的作用, 并能使细胞保持在不分化的状态 [3] 有研究发现,NS 基因在宫颈癌胃癌肝癌肾癌以及乳腺癌等细胞中均有高表达, 同时又对肿瘤细胞的恶性增殖周期进展和凋亡逃逸有着重要的作用 [4] 细胞周期蛋白 B1(CyclinB1) 是细胞周期蛋白家族中最早被发现的, 其基因定位于 5q12, 在人类恶性肿瘤中过表达, 促使细胞进入 G 2 /M 期, 加速细胞周期进程, 对细胞有丝分裂和细胞增殖有调控作用 [5], 并有研究发现其异常表达与肿瘤的侵袭转移及预后相关, 提示 Cyclin B1 在肿瘤发生发展中起作用 PTEN 是 1997 年发现的一种具有磷酸酶活性的抑癌基因 [6], 由人染色体 10q23 纯合性缺失导致 PTEN 基因可以抑制肿瘤细胞的生长及调节肿瘤细胞的侵袭和转移, 并且在多种肿瘤中发生突变和转移, 其低表达或缺失与肿瘤的发生发展密切相关 [7] 有研究表明 NS 可能与 Cyclin B1 是细胞通过 G 2 /M 检验点的关键因子,PTEN 是参与细胞周期调控重要的抑癌基因, 可与 NS 结合, 从而抑制其转录激活作用, 并且 NS 可能通过 PI3K/AKT/ PTEN 通路来影响细胞增殖本实验采用 RTPCR Westernblot 检测正常食管上皮细胞 (shantouhuman embryonicesophagealepithelialcelline,shee) 和永生化食管上皮恶变细胞 (shantouhumanembryonicesoph agealcarcinomaepithelialcelline,sheec) 中 NS 及与细胞增殖有关的 CyclinB1 和抑癌基因 PTENmRNA 和蛋白的表达差异, 并用 RNA 干扰技术抑制 NS 的表达, 然后检测细胞增殖活性, 初步探索 NS 对 SHEEC 细胞癌变的影响 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 SHEE 及 SHEEC 细胞, 由河南科技大学第一附属医院高社干教授惠赠新生牛血清 ( 美国 Gibco 公司 ),DMEMF12 培养基 ( 美国 Abcam 公司 ), 超纯 RNA 提取试剂盒 cdna 第 1 链合成试剂盒和 Nc 细胞核 / 质蛋白抽提试剂盒 ( 北京康为世纪生物科技有限公司 ),SYBRGreenMaster Mix MTTCelCountingKit( 南京诺唯赞公司 ), 鼠抗人多克隆 NS 抗体鼠抗人多克隆 CyclinB1 抗体和鼠抗人多克隆 PTEN 抗体 ( 美国 Abcam 公司 ), 辣根山羊抗兔 IgG 二抗 ( 北京中杉金桥生物技术有限公司 ) 主要实验仪器 7500FastRealtimePCR(System Applied Biosystems,ABI 公司 ),HFsafe1200 超净工作台和细胞培养箱 ( 上海 HealForce 公司 ), 荧光化学成像仪 ( 美国 BioRad 公司 ) 1.2 细胞培养用含 10% 新生牛血清和支原体抗生素 MPlasmocin

3 1514 (5mg/L) 的 DMEMF12 完全培养基, 在 5% CO % 湿度的恒温培养箱中培养,1~2d 换液, 2~3d 传代 1.3 RTPCR 检测 SHEE 及 SHEEC 细胞中 NS Cyclin B1 及 PTENmRNA 的表达细胞处于对数生长期时收集各组细胞并计数, 用康为世纪公司超纯 RNA 提取试剂盒提取细胞总 RNA, 微量核酸测定仪检测 RNA 浓度和纯度, 用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性按康为世纪公司的 cdna 第 1 链合成试剂盒说明书进行反转录合成 cdna 第 1 链从 GenBank 上查找到 NS(NM_ ) CyclinB1(NM_ ) PTEN(NM_000314) 的基因序列, 以 βactin 为内参, 所有引物由上海生工生物有限公司设计并合成 NS 引物上游 :5 AAAGCCATTCGGGTTGGAGT3 ; 下游 : 5 ACCACAGCAGTTTGGCAGCAC3, 产物片段长度 240bp CyclinB1 引物上游 :5 GCCAATAAGGAGG GAGCAGT3 ; 下游 :5 ACCTACACCCAGCAGAAACC 3, 产物片段长度 101bp PTEN 引物上游 :5 AGAC CATAACCCACCACAGC3 ; 下游 :5 ACACCAGTTCGT CCCTTTCC3, 产物片段长度 126bp βactin 引物上游 :5 TGACGTGGACATCCGCAAAG3 ; 下游 :5 CTG GAAGGTGGACAGCGAGG3, 产物片段长度 200bp RTPCR 反应体系为 20μL, 其中 AceQTMQpcr SYBR GreenMasterMix10μL,PrimerF(10μmol/L) 0.4μL,PrimerR(10μmol/L)0.4μL,ROXReference Dye20.4 μl, 模板 DNA 2 μl,rnasefreewater 6.8μL 采用两步法进行反应, 反应条件为 95 预变性 10min;95 10s,60 30s,40 个循环 ;95 15s, 60 60s,95 15s, 绘溶解曲线反应结果采用 2 -ΔΔCt 法分析各组中目的基因的相对表达量, 每组重复 6 次, 取平均值 RTPCR 产物的鉴定采用 2% 的琼脂糖凝胶电泳, 根据产物大小来判断目的条带以及有无非特性条带 1.4 Westernblot 检测 SHEE 及 SHEEC 细胞中 NS CyclinB1 及 PTEN 蛋白的表达采用康为世纪公司的 Nc 细胞核 / 质蛋白抽提试剂盒提取各细胞组的核蛋白, 并用 BCA 法测定蛋白样品的浓度制备 10% 分离胶和 5% 浓缩胶, 将测定好浓度的蛋白样品与 5 SDS 上样缓冲液 RNaseFree Water 按比例混匀,95 5min 进行变性, 室温冷却后短暂离心, 每孔 20μL 的上样量, 按照 80V40min, 120V80min 进行 SDSPAGE 电泳, 然后按纤维垫滤纸 PVDF 膜滤纸纤维垫的顺序进行转膜, 并赶走三明治中的气泡, 恒流 290mA90min 转膜 5% 脱脂奶在 37 恒温摇床上封闭 2h, 然后分别加入 NS 一抗 (1 7000) CyclinB1 一抗 (1 1000) PTEN 一抗 (1 500) 和内参 βactin 一抗 (1 5000),4 过夜后, TBST 漂洗 3 10 min, 再加入羊抗兔 IgG 二抗 ( ) 在 37 摇床上孵育 1h,TBST 洗膜 3 10min 后用 ECL 化学发光显色试剂盒在荧光化学成像仪中显影采用 IamgeJ 软件对 Westernblot 显影结果进行分析, 其条带以灰度值来呈现, 以解析度为单位, 按照灰度值的高低半定量分析样品中蛋白的相对表达量 1.5 MTT 法检测干扰 NS 后细胞增殖活性取对数生长期的 SHEEC 细胞, 收集细胞并计数, 以 (1.5~5) 10 4 /ml 的细胞数接种到 96 孔板, 每孔 100μL 实验设置空白对照组阴性对照组和 sirna 干扰组 (RNAi 组 ) sirna 干扰组在铺板 24h 后进行细胞转染, 用小干扰 RNA(siRNA) 干扰 NS 的表达, 转染后 h 进行 MTT 实验, 具体方法为吸弃转染的培养液,PBS 洗 2 次后向 96 孔板各孔中加入 50μL 稀释好的 MTT 反应液,37 恒温培养箱孵育 4h, 吸去上清, 然后每孔加入 150μLDMSO,37 恒温摇床上孵育 10min 后用酶标仪检测 490nm 波长处的光密度值 [D(490)], 每组重复 3 次, 取平均值 1.6 统计学方法采用 SPSS17.0 统计软件, 数据用 x±s 珋表示, 两组均数的比较采用两独立样本 t 检验, 两组间的相关性分析采用双变量相关分析, 多组均数间的比较采用单因素方差分析, 多组均数间的两两比较采用 LSD 法, 检验水准 α= 结果 2.1 SHEE 和 SHEEC 细胞中 NS CyclinB1 及 PTEN mrna 表达 SHEE 和 SHEEC 细胞中均有 NS CyclinB1 和 PTENmRNA 的表达, 主要在 240bp 101bp 126bp 和内参条带出现目的条带, 见图 1 NS CyclinB1mRNA 在 SHEEC 细胞中高表达,PTENmRNA 在 SHEEC 细胞中低表达以 SHEE 细胞中的表达量为 1, 与 SHEEC 细胞中 NS(2.047±0.507) CyclinB1(2.214±0213) 和 PTENmRNA(0.668±0.188) 的表达量差异有统计学意义 (P<0.01)

2 SHEE 和 SHEEC 细胞中 NS CyclinB1 及 PTEN 蛋白的表达 SHEE 和 SHEEC 细胞中均有 NS CyclinB1 和 PTEN 蛋白的表达, 见图 2 NS CyclinB1 蛋白在 SHEEC 细胞中高表达,PTEN 蛋白在 SHEEC 细胞中低表达各组中 NS CyclinB1 和 PTEN 的蛋白表达水平, 见表 1 mrna 表达的相关性 SHEE

4 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2016,38(13) 分别为 NS PTEN 和 CyclinB1mRNA 在 SHEE 细胞中的表达 ;2 4 6 分别为 NS PTEN 和 CyclinB1mRNA 在 SHEEC 细胞中的表达 ;M: 标准 (DL500) 图 1 RTPCR 检测 SHEE 及 SHEEC 细胞中 NS CyclinB1 和 PTENmRNA 的表达 2.2 SHEE 和 SHEEC 细胞中 NS CyclinB1 及 PTEN 蛋白的表达 SHEE 和 SHEEC 细胞中均有 NS CyclinB1 和 PTEN 蛋白的表达, 见图 2 NS CyclinB1 蛋白在 SHEEC 细胞中高表达,PTEN 蛋白在 SHEEC 细胞中低表达各组中 NS CyclinB1 和 PTEN 的蛋白表达水平, 见表 1 mrna 表达的相关性 SHEE 和 SHEEC 细胞中 NS 与 CyclinB1mRNA 的表达呈正相关 (r=0.832),ns 与 PTENmRNA 的表达呈负相关 (r=-0.924), 两组之间比较的差异具有统计学意义 (P<0.01) SHEE 和 SHEEC 细胞中 NS CyclinB1 及 PTEN 蛋白表达的相关性 SHEE 和 SHEEC 细胞中 NS 与 CyclinB1 蛋白的表达呈正相关 (r=0.991),ns 与 PTEN 蛋白的表达呈负相关 (r=-0.769), 两组之间比较的差异具有统计学意义 (P<0.05) 2.4 抑制 SHEEC 细胞 NS 表达对细胞增殖的影响酶标仪测定空白对照组阴性对照组和 sirna 干扰组 (RNAi 组 ) 细胞增殖活性结果见表 2, 同一时间两两比较结果显示, 转染 12h 时 RNAi 组与空白对照组阴性对照组比较细胞增殖活性差异无统计学意义 (P>0.05), 转染 h,3 组比较差异均有统计学意义 (P<0.05) 表 2 各组细胞转染后不同时间细胞增殖活性的变化 [D(490),n=6, x±s] 珋组别 12h 24h 36h 48h 空白对照组 0.383± ± ± ±0.099 阴性对照组 0.375± ± ± ±0.120 RNAi 组 0.371± ± ± ±0.076 F P !" #$" 1:SHEE 细胞 ;2:SHEEC 细胞图 2 Westernblot 检测 SHEE 及 SHEEC 细胞中 NS CyclinB1 PTEN 蛋白的表达表 1 SHEE 及 SHEEC 中 NS CyclinB1 PTEN 蛋白表达水平 (n=6, x±s) 珋细胞 NS CyclinB1 PTEN SHEE 1.142± ± ±0.341 SHEEC 3.161± ± ±0.524 t P SHEE 和 SHEEC 细胞中 NS CyclinB1 及 PTEN 表达的相关性 SHEE 和 SHEEC 细胞中 NS CyclinB1 及 PTEN 3 讨论食管癌是威胁人类生命健康最常见的恶性肿瘤之一, 它的浸润转移是引起食管癌恶化的主要原因癌基因和抑癌基因相互作用, 共同参与肿瘤的发生发展 [8] 核干细胞因子 NS 在多种人类癌细胞中高表达, 在干细胞的早期多潜能状态时表达丰度很高, 而在干细胞分化开始时 NS 基因的表达几乎完全消失, 在分化的成体组织中该基因完全不表达近年来研究发现,NS 与细胞恶性增殖细胞周期进展以及肿瘤的发生发展紧密相关 [9] 本研究采用正常食管上皮细胞 SHEE 及其恶变细胞 SHEEC 作为实验对象 SHEE 及 SHEEC 细胞系是 [10] 由沈忠英建立并培养传代, 永生化食管细胞系可以研究正常食管细胞诱导恶变转化成永生化细胞以及向恶性细胞转化的条件及其发生发展的过程, 为食管癌的癌变过程及其治疗提供一种新的模型 [11], 是近年来肿瘤研究的新热点和新领域研究结果发现癌细胞

5 1516 SHEEC 中 NS 基因和蛋白的表达量显著高于正常细胞 [12] SHEE, 张功员等研究同样发现食管鳞状细胞癌组织中 NS 蛋白的表达率显著高于癌旁不典型增生组织和正常食管黏膜组织本研究还发现细胞周期蛋白 CyclinB1mRNA 和蛋白均在 SHEEC 中高表达, 而抑癌基因 PTENmRNA 和蛋白却在 SHEEC 细胞中低表 [13] 达, 这与 Qin 等研究结果相一致同时还做了 NS CyclinB1 及 PTEN mrna 和蛋白相关性分析, 在 SHEE 和 SHEEC 细胞中,NSmRNA 和蛋白与 Cyclin B1mRNA 和蛋白的表达呈正相关, 与 PTENmRNA 和蛋白的表达呈负相关, 提示 NS 可能与 CyclinB1 共同作用, 通过调控细胞周期而作用于细胞增殖,PTEN 可与 NS 结合从而抑制其转录激活作用, 具体机制问题还需进一步的研究细胞增殖实验表明干扰 NS 表达后,SHEEC 细胞增殖能力低于空白对照组和阴性对照组, 提示 NS 低表达能抑制 SHEEC 细胞的增殖活性但是, 永生化食管上皮恶变细胞是由促癌物十二烷基葵豆蔻 (TPA) 诱导建立的, 它只是具有肿瘤特征而不是真正的肿瘤细胞, 此结论只能作为参考, 还需进一步的研究论证综上,NS 可能对食管上皮恶变细胞的癌变有促进作用, 可望成为食管癌研究和治疗的一个新的靶点, 对食管癌的基因治疗等临床应用具有重要作用但是 NS 的生物学功能和在肿瘤恶性增殖中的作用机制目前还不清楚, 仍需进一步的探索参考文献 : [1] 张思维, 张敏, 李光琳, 等.2003~2007 年中国食管癌发病与死亡分析 [J]. 中国肿瘤,2012,21(4): [2] TsaiR Y,McKayR D.A nucleolarmechanism controling celproliferationinstem celsandcancercels[j].genes Dev,2002,16(23): DOI: /gad [3] LoD,LuH.Nucleostemin:Anothernucleolar Twister of thep53mdm2loop[j].celcycle,2010,9(16): doi: /cc [4] YamashitaM,NitaE,NagamatsuG,etal.Nucleosteminis indispensableforthemaintenanceand geneticstabilityof hematopoieticstemcels[j].biochembiophysrescommun, 2013,441(1): DOI: /j.bbrc [5] 刘馨莲, 李淑荣, 孙静, 等. 细胞周期蛋白在食管癌中的表达及意义 [J]. 中国实验诊断学,2012,16(7): DOI: /j.isn [6]LiJ,YenC,LiawD,etal.PTEN,aputativeproteintyro sinephosphatasegenemutatedinhumanbrain,breast,and prostatecancer[j].science,1997,275(5308): [7] 李季林, 肖建, 于如同. 肿瘤抑制基因 PTEN 研究新进展 [J]. 现代肿瘤医学,2010,18(5): DOI: /j.isn [8] 章福彬, 朱斌, 唐郡, 等. 核干细胞因子在食管癌组织中的表达及意义 [J]. 现代生物医学进展,2013,13(20): ,3957. [9] 吴鑫, 胡琳, 田明妹, 等. 核干细胞因子的最新研究进展 [J]. 四川生理科学杂志,2013,35(3): DOI: /j.isn [10] 沈忠英, 沈健, 蔡维佳, 等. 人乳头状瘤病毒 18 型 E6E7 基因诱导胎儿食管永生化上皮的生物学特性 [J]. 中华实验和临床病毒学杂志,1999,13(3): DOI: /cma.j.isn [11] 李健, 齐义军, 王立东. 食管上皮永生化细胞系研究进展 [J]. 世界华人消化杂志,2005,13(11): DOI: /j.isn [12] 张功员, 尹磊, 李晟磊, 等. 食管鳞状细胞癌组织中核干细胞因子蛋白的表达 [J]. 郑州大学学报 : 医学版, 2007,42(6): DOI: /j.isn [13]QinQ,ChengH,LuJ,etal.Smalmoleculesurvivinin hibitorym155 enhancesradiosensitization in esophageal squamouscelcarcinomabytheabrogationofg 2 checkpoint andsuppresionofhomologousrecombinationrepair[j].j HematolOncol,2014,7:62.DOI: /s ( 收稿 : ; 修回 : ) ( 编辑汪勤俭 )

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot