342 ChinJGastroenterol,2017,Vol.22,No 6 结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一在美国, 虽然结直肠癌发病率正逐年降低, 但其导致的死亡率仍不可忽视 [1] 结直肠癌的发生进展是一个非常复杂的过程, 通常是在多种致肿瘤因素的共同作用下逐级转化发生 [2] 其中炎癌

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许隆
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1 341 TRIM55 在结直肠癌中的表达及其临床意义梁 1 倩 1 房静远张 2# 洁洪 1# 洁上海交通大学医学院附属仁济医院消化科上海市消化疾病研究所 1 (200001) 2 上海交通大学医学院附属仁济医院检验科背景 :TRIM55 为 TRIM 蛋白家族成员, 大部分 TRIM 蛋白含环指结构域, 可发挥 E3 泛素连接酶的作用, 与癌症的发生发展密切相关目的 : 探讨 TRIM55 在结直肠癌中的表达及其临床意义, 探究可能的作用机制方法 : 选取 2014 年 10 月 2015 年 12 月上海交通大学医学院附属仁济医院的 70 例结直肠癌组织及其相应癌旁组织, 以实时 PCR 法检测 TRIM55 表达将 TRIM55 小干扰 RNA(siRNA) 转染人结直肠癌细胞株 HCT116, 以 CCK 8 法检测细胞增殖, 蛋白质印迹法检测 TRIM55 SOCS1 蛋白表达结果 :49 例结直肠癌组织中 TRIM55 表达高于癌旁组织, 且 TRIM55 高表达与肿瘤分化程度 (P=0.032) AJCC 分期 (P=0.001) 和淋巴结转移相关 (P=0.001), 而与患者的性别年龄肿瘤大小浸润深度远处转移和脉管侵犯无关 (P>0.05) TRIM55siRNA 可有效下调 HCT116 细胞中 TRIM55mRNA 和蛋白表达 (P<0.01), 降低细胞增殖能力 (P<0.01), 并上调 SOCS1 蛋白表达 (P<0.01) 结论: E3 泛素连接酶 TRIM55 可能通过影响 SOCS1 的表达促进结直肠癌细胞增殖, 进而促进结直肠癌的疾病进程, 提示检测 TRIM55 表达有望为结直肠癌的诊断和治疗提供新思路关键词泛素化 ; TRIM55; 结直肠肿瘤 ; RNA, 小分子干扰 ; 细胞增殖 ; 细胞因子信号转导蛋白抑制因子 ExpresionandClinicalSignificanceofTRIM55inColorectalCancer LIANGQian 1,FANGJingyuan 1,ZHANG Jie 2,HONGJie 1. 1 DivisionofGastroenterologyandHepatology,RenJiHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolof Medicine;ShanghaiInstituteofDigestiveDisease,Shanghai(200001); 2 DepartmentofClinicalLaboratory,RenJi Hospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai Co correspondenceto:zhangjie, jane_zhanlin@sina.cn;hongjie, jiehong97@shsmu.edu.cn Background:TRIM55isamemberofTRIM family.mosttrim proteins,whichcanbedefinedase3ubiquitin ligasebecauseofthering fingerdomain,arecloselyrelatedwiththeinitiationandprogresionofcancer.aims:tostudy theexpresionandclinicalsignificanceoftrim55incolorectalcancer,andexplorethepotentialmechanismoftrim55in colorectalcancer. Methods: Seventycolorectalcancertisuesand corespondingparacanceroustisuestaken from colorectalcancerpatientsfromoctober2014todecember2015atshanghairenjihospitalwereenroled.real timepcr wasperformedtoexaminetheexpresionoftrim55.humancolorectalcancercellinehct116wastransfectedwith TRIM55smalinterferingRNA (sirna),celproliferationwasmeasuredbycck 8 asay,westernblotingwas implementedtodeterminetheproteinexpresionsoftrim55andsocs1.results:theexpresionoftrim55was significantlyincreasedin49colorectalcancertisuesthanincorespondingparacanceroustisues.increasedexpresionof TRIM55wascloselycorelatedwithtumordiferentiation(P=0.032),AJCCstaging(P=0.001)andlymphnode metastasis(p=0.001),butnotrelatedtogender,age,tumorsize,invasiondepth,distantmetastasisandvascular invasion(p>0.05).aftertransfectionwithtrim55sirna,mrnaandproteinexpresionsoftrim55weresignificantly decreased(p<0.01),proliferationofhct116celswassignificantlydecreased(p<0.01),andproteinexpresionof SOCS1wassignificantlyincreased(P<0.01).Conclusions:E3ubiquitinligaseTRIM55maypromotetheproliferationof colorectalcancercelsviainfluencingtheexpresionofsocs1,thuspromotingtheprogresionofcolorectalcancer.this indicatesthatdetectionoftrim55expresionmayprovideanewapproachfordiagnosisandtherapyofcolorectalcancer. Keywords Ubiquitination; TRIM55; ColorectalNeoplasms; RNA,SmalInterfering; CelProliferation; SuppresorofCytokineSignalingProteins DOI: /j.isn 本课题由临床专职科研队伍 ( ) 资助 # 本文共同通信作者, 张洁, jane_zhanlin@sina.cn; 洪洁, jiehong97@shsmu.edu.cn

2 342 ChinJGastroenterol,2017,Vol.22,No 6 结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一在美国, 虽然结直肠癌发病率正逐年降低, 但其导致的死亡率仍不可忽视 [1] 结直肠癌的发生进展是一个非常复杂的过程, 通常是在多种致肿瘤因素的共同作用下逐级转化发生 [2] 其中炎癌途径是结直肠癌发生和转归中的重要途径之一 [3] [4] 有报道表明, 细胞因子信号转导抑制因子 1(suppresorofcytokine signaling1,socs1) 作为一种炎症抑制因子, 其缺失和失活与结直肠癌 ( 尤其是炎症性肠病相关结直肠癌 ) 的发生密切相关 TRIM55 为 TRIM 蛋白家族成员,TRIM 家族因多含有环指结构域 (RING finger domain) 而发挥 E3 泛素连接酶的作用, 可对多种蛋白进行特异性识别并降解从而影响其表达水平 [5], 包括 SOCS1 [6] 本研究通过检测结直肠癌患者中 TRIM55 表达, 并以 TRIM 小干扰 RNA(siRNA) 转染人结直肠癌细胞株 HCT116, 检测细胞增殖情况以及 SOCS1 蛋白表达, 旨在探讨 TRIM55 在结直肠癌中的可能作用机制, 从而为结直肠癌的诊断和治疗提供一定的理论依据材料与方法一研究对象选取 2014 年 10 月 2015 年 12 月上海交通大学医学院附属仁济医院的 70 例结直肠癌患者, 诊断经术后病理检查证实同时选取距病变边缘 5cm 以上的癌旁组织作为对照其中男 37 例, 女 33 例 ; 年龄 28~82 岁, 平均 66 岁 ; 肿瘤大小 <30cm 3 者 50 例, 30cm 3 者 20 例 ; 中高分化 18 例, 低分化 52 例 ; 根据美国癌症联合委员会 (AJCC) 分期,Ⅰ +Ⅱ 期 32 例,Ⅲ +Ⅳ 期 38 例 ; 浸润局限于黏膜层或肌层者 14 例, 浆膜或全层者 56 例 ; 有淋巴结转移 38 例, 无淋巴结转移 32 例 ; 有远处转移 13 例, 无远处转移 57 例 ; 侵犯脉管 8 例, 无脉管侵犯 62 例入选者住院前未接受过手术放化疗或免疫抑制剂治疗入选者均取得知情同意, 本研究方案通过上海交通大学医学院附属仁济医院伦理委员会的审批二主要仪器和材料实时荧光定量 PCR 仪 (ABI 公司 );RNAisoPlus 总 RNA 提取试剂逆转录试剂盒和 Real TimePCR 试剂盒 ( 日本 TaKaRa 公司 ); 内参 GAPDH 引物和 TRIM55 特异性引物由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司合成 ; 人结直肠癌细胞株 HCT116(ATCC); RPMI1640 培养基 ( 美国 Gibco 公司 ); 胎牛血清 ( 杭州四季青生物工程材料有限公司 );sirna( 上海吉玛制药技术有限公司 ), 序列见表 1;DharmaFECT1 转染试剂 (GEHealthcare);CCK 8 试剂盒 ( 日本株式会社同仁化学研究所 );RIPA 蛋白裂解液 ( 上海碧云天生物技术有限公司 ); 小鼠 TRIM55 单克隆抗体 ( 英国 Abcam 公司 ) 小鼠 SOCS1 单克隆抗体 ( 美国 Milipore 公司 ) HRP 标记的内参 GAPDH 抗体 HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体 ( 康成生物工程有限公司 );ECL 发光试剂盒 ( 美国 ThermoFisher Scientific) 表 1 各基因 sirna 序列基因序列 (5 3 ) TRIM55siRNA 1 F:CACAACCUGUGUAGGAAAUTT R:AUUUCCUACACAGGUUGUGTT TRIM55siRNA 2 F:CCCAUCCUGUAGACAUGAATT R:UUCAUGUCUACAGGAUGGGTT GAPDHsiRNA F:UUCUCCGAACGUGUCACGUTT R:ACGUGACACGUUCGGAGAATT 三研究方法 1. 实时 PCR 法 : 结肠组织充分研磨后裂解细胞, 提取 RNA, 逆转录合成 cdna 实时 PCR 步骤参照试剂盒说明书进行以 2 - Ct 法计算样本目的基因 mrna 相对表达量每组设立 3 个复孔, 实验重复 3 次 2. 细胞培养和转染 : 将 HCT116 细胞培养于含 5% 胎牛血清的 RPMI1640 完全培养基中, 培养至对数生长期后, 以个 / 孔的密度接种于 6 孔板待细胞贴壁后进行转染转染的操作步骤参照 DharmaFECT1 转染试剂说明书, 以无血清的培养基清洗细胞后每孔加入无血清培养基 1mL, 然后加入 5μLsiRNA 于细胞培养箱中培养 6h 后更换含 5% 胎牛血清的完全 RPMI1640 培养基继续孵育 24~72h 3. 细胞增殖实验 :HCT116 细胞按 2500 个 / 孔的密度接种于 96 孔板, 每组处理设 6 个复孔细胞贴壁后行 sirna 转染加入 CCK 8 试剂 ( 以无血清培养基按照 1 10 的体积比稀释 ), 分别于培养 24h 48h 72h 96h 120h 后检测细胞增殖情况

3 343 使用酶标仪读取 450nm 波长处的吸光度 (A) 值实验重复 3 次 4. 蛋白质印迹法 : 将 HCT116 细胞转染 sirna 48~72h 后, 收集细胞, 以预冷的 PBS 洗涤, 加入蛋白裂解液裂解 10min, g 离心 10min, 取上清,BCA 法定量蛋白浓度取 50μg 总蛋白上样, 行 10% SDS PAGE 电泳分离后转移至 PVDF 膜, 经 5% 脱脂奶粉封闭 2h 分别加入 TRIM55 SOCS1 GAPDH 一抗 ( 工作浓度分别为 )4 孵育过夜 TBST 洗膜 5 次 5min, 加入二抗 ( 工作浓度 ) 常温孵育 1h ECL 发光法成像并进行灰度扫描实验重复 3 次四统计学分析应用 SPSS19.0 统计软件, 实验数据以 x±s 珋表示两样本之间均数的比较采用独立样本 t 检验, 计数资料的比较采用 χ 2 检验 P<0.05 为差异有统计学意义结果一结直肠癌患者中 TRIM55 表达及其与临床病理特征的关系在 70 例结直肠癌患者中,49 例 TRIM55 表达高于癌旁组织, 平均相对表达量为 2.26±1.22;21 例 TRIM55 表达低于癌旁组织, 平均相对表达量为 0.53±0.26 TRIM55 高表达与肿瘤分化程度 (P= 0.032) AJCC 分期 (P=0.001) 和局部淋巴结转移 (P=0.001) 相关, 而与患者的性别年龄肿瘤大小浸润深度远处转移和脉管侵犯等无关 (P> 0.05)( 表 2) 二 HCT116 细胞中 TRIM55mRNA 和蛋白表达实时 PCR 和蛋白质印迹法结果显示, 分别转染两条 TRIM55siRNA 的 HCT116 细胞中,TRIM55 mrna 表达均显著降低 ( 抑制率分别为 78.4% 和 87.2%,P<0.001)( 图 1A), 蛋白表达亦显著降低 ( 抑制率分别为 46.2% 和 60.5%,P<0.01)( 图 1B), 提示 sirna 可有效下调 HCT116 细胞中 TRIM55mRNA 和蛋白表达三 HCT116 细胞增殖情况与对照组相比, 两组 TRIM55siRNA 转染组的细胞增殖均受到明显抑制, 差异有统计学意义 (P< 0.01)( 图 2) 四 TRIM55 表达降低对 HCT116 细胞中 SOCS1 表达的影响蛋白质印迹法结果显示, 转染 72h 后, 两组 TRIM55siRNA 转染组细胞中 SOCS1 蛋白表达较对照组显著升高 (P<0.01)( 图 3) 说明 TRIM55 对 SOCS1 蛋白表达具有一定的调控作用表 2 结直肠癌患者中 TRIM55 表达与临床病理特征的关系 (n) TRIM55 表达临床病理特征例数 P 值低表达高表达性别男女年龄 ( 岁 ) < 肿瘤大小 <30cm cm 分化程度中高分化低分化 AJCC 分期 Ⅰ +Ⅱ 期 Ⅲ +Ⅳ 期浸润深度肌层或黏膜层浆膜或全层淋巴结转移无有远处转移无有脉管侵犯无有图 2 转染 sirna 后 HCT116 细胞增殖情况 (CCK 8 法 )

4 344 ChinJGastroenterol,2017,Vol.22,No 6 1Da=0.9921u A:TRIM55mRNA 表达 ( 实时 PCR 法 );B:TRIM55 蛋白表达 ( 蛋白质印迹法 ) 图 1 转染 sirna 后 HCT116 细胞中 TRIM55mRNA 和蛋白表达图 3 转染 sirna 后 HCT116 细胞中 SOCS1 蛋白表达 ( 蛋白质印迹法 ) 讨论既往诸多研究发现, 泛素化修饰是蛋白质翻译后修饰的一个常见方式, 在蛋白质降解和信号通路调控中发挥重要作用 [7] 泛素化作用由一系列级联反应完成, 其中包括三种重要的酶, 分别为 E1 泛素激活酶 E2 泛素结合酶和 E3 泛素连接酶 E1 泛素激活酶可利用 ATP 供能黏附于泛素分子的半胱氨酸残基上, 随后将泛素分子转移至 E2 泛素结合酶 E3 泛素连接酶的作用最为关键, 一方面可特异性识别靶蛋白, 另一方面定位于 E2 泛素结合酶以转移泛素分子, 从而形成泛素与底物蛋白的复合物被蛋白酶体水解 [8] TRIM 蛋白家族因多含有环指结构域而发挥 E3 泛素连接酶的作用, 可识别并降解多种蛋白, 从而引起其表达水平以及相关信号通路的改变 [5] 由于降解的靶蛋白不同,TRIM 蛋白既有促癌亦有抑癌的作用如 Smad 泛素化调节因子 2(Smurf2) 是一种 E3 泛素连接酶, 有研究发现 Smurf2 可依赖其泛素连接酶的活性参与细胞增殖凋亡迁移等过程, 从而与肿瘤的发生发展密切相关 [9] ;TRIM59 可使野生型 p53 泛素化并降解, 但对突变型 p53 无此作用, 阻碍了 p53 作为抑癌基因的功能, 从而促进胃癌的发生发展 [10] ; 在非小细胞肺癌中,TRIM71 可通过对 RNA 结合蛋白 Lin28B 的泛素化作用, 使其表达减少, 抑制下游 let 7 HMGA2 信号的激活, 从而发挥其抑癌基因的作用 [11] ;TRIM3 是一种定位于 11 号染色体的抑癌基因, 通过降解 p21 削弱细胞周期蛋白 D1 与细胞周期蛋白依赖性激酶 4(CDK4) 的聚积, 进而抑制肿瘤生长, 其表达降低可引起血小板源性生长因子诱导的胶质瘤发病率的增加 [12]

5 345 TRIM 蛋白调控肿瘤发生发展的作用途径各不相同, 包括调节自噬 [13] [14] 组蛋白和免疫应答反 [15] [15] 应等 Versteeg 等在人类已知的 75 种 TRIM 蛋白中进行 cdna 克隆和系统分析, 证实约一半的 TRIM 蛋白可从固有免疫信号通路的多个水平进行调控, 从而影响固有免疫反应 SOCS1 可负性调控细胞因子引起的信号通路激活, 发挥潜在的炎症抑制因子的作用, 并减缓肿瘤细胞的生长, 因此在多种肿瘤包括结直肠癌中起抑癌的作用 [4] TRIM 蛋白与 SOCS1 之间的相互作用降低了 SOCS1 的稳定性和表达水平, 可阻断 SOCS1 的抑癌功能 [6] 本研究检测了 70 例结直肠癌患者中 TRIM55 mrna 表达发现,49 例 TRIM55 表达高于癌旁组织, 且 TRIM55 高表达与肿瘤分化程度 AJCC 分期和淋巴结转移密切相关 (P<0.05) 提示 TRIM55 表达可能与结直肠癌患者的恶性程度以及病变累及范围有关本研究进一步将 TRIM55siRNA 转染人低分化结直肠癌细胞株 HCT116, 结果显示 TRIM55 mrna 和蛋白表达均明显下调,HCT116 细胞增殖受到明显抑制, 而 SOCS1 蛋白表达明显升高这一结果可能是由于 sirna 削弱了 TRIM55 对 SOCS1 的泛素化降解作用而在结直肠癌中,TRIM55 高表达使 SOCS1 的降解异常增加,SOCS1 水平降低, 使其对肿瘤细胞增殖的抑制作用受到破坏, 导致结直肠癌细胞的生物学特性发生了变化, 进而加速疾病进程综上所述, 结直肠癌患者的 TRIM55 表达水平升高, 且与肿瘤分化程度 AJCC 分期和淋巴结转移相关, 可能在促进结直肠癌的发生发展中起一定作用, 其发挥作用的潜在机制可能是降解 SOCS1 但 TRIM55 是否通过泛素化修饰的方式在结直肠癌的发生发展中发挥作用迄今仍未见相关报道, 有待进一步研究证实本研究缺乏体内实验结果, 后续可通过完善这一部分内容, 使 TRIM55 有望成为诊断和治疗结直肠癌的新靶点参考文献 1 SiegelRL,MilerKD,JemalA.Cancerstatistics,2015 [J].CACancerJClin,2015,65(1): Markowitz SD, BertagnoliMM. Molecular origins of cancer:molecularbasisofcolorectalcancer[j].nenglj Med,2009,361(25): ZhaoJ,BulekK,GulenMF,etal.Humancolontumors expresadominant negativeformofsigirrthatpromotes inflammationandcolitis asociatedcoloncancerinmice [J].Gastroenterology,2015,149(7): e8. 4 BakirtziK, Hatziapostolou M, KaragiannidesI, etal. NeurotensinsignalingactivatesmicroRNAs 21 and 155 andakt,promotestumorgrowthinmice,andisincreased inhumancolontumors[j].gastroenterology,2011,141 (5): e1. 5 HiranoA,FuYH,PtáčekLJ.Theintricatedanceofpost translationalmodificationsintherhythm oflife[j].nat StructMolBiol,2016,23(12): ToniatoE,ChenXP,LosmanJ,etal.TRIM8/GERP RING fingerproteininteractswithsocs 1[J].JBiol Chem,2002,277(40): FootN,HenshalT,KumarS.Ubiquitinationandthe regulationofmembraneproteins[j].physiolrev,2017, 97(1): ClagueMJ,HerideC,UrbéS.Thedemographicsofthe ubiquitinsystem[j].trendscelbiol,2015,25(7): 郭晓玲, 曹勤, 蔡瑜, 等.Smurf2 与肿瘤关系的研究进展 [J]. 胃肠病学,2014,19(1): ZhouZ,JiZ,WangY,etal.TRIM59isup regulatedin gastrictumors,promotingubiquitinationanddegradationof p53[j].gastroenterology,2014,147(5): YinJ, Kim TH, Park N, etal. TRIM71 suppreses tumorigenesis via modulation of Lin28B let 7 HMGA2 signaling[j].oncotarget,2016,7(48): LiuY, Raheja R, Yeh N, etal. TRIM3, a tumor suppresorlinkedtoregulationofp21(waf1/cip1.)[j]. Oncogene,2014,33(3): AntonioliM,DiRienzoM,PiacentiniM,etal.Emerging mechanismsininitiatingandterminatingautophagy[j]. TrendsBiochemSci,2017,42(1): PatelLR,BartonMC.TRIM ingliganddependencein castration resistantprostate cancer[j]. CancerCel, 2016,29(6): VersteegGA,Rajsbaum R,Sánchez AparicioMT,etal. TheE3 ligasetrim familyofproteinsregulatessignaling pathwaystriggeredbyinnateimmunepatern recognition receptors[j].immunity,2013,38(2): ( 收稿 ; 修回 )

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot