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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'& & 基础研究 靶向抑制结肠癌 细胞的体外实验研究 王 鑫 陈 玲 孙 飞 陆 航 辽宁医学院附属第一医院 急诊科 胃肠外科 辽宁锦州 摘要 目的 探讨慢病毒介导的 $%$&'& 转染人结肠癌细胞株 后对 $%$& 蛋白表达的影响 方法 设计并合成 $%$& 的 对 & 序列及 对阴性对照序列 与 ()#!#* +, 系统合成构建重组慢病毒载体 转染 -./0+ 细胞包装病毒并检测滴度 将 种重组慢病毒载体及阴性对照分别感染人结肠癌细胞 &+'1$& 检测 $%$&& 的表达情况 测定沉默效率 筛选沉默效率最高的一组 $%$&'& 作为后续实验的表达载体,++ 法检测转染 $%$&'& 对 细胞生长增殖的影响 细胞划痕实验检测转染 $%$&' & 对 细胞侵袭迁移能力的影响 ##*!) 检测转染 $%$&'& 对 细胞蛋白表达情况 结果 测序证实 对慢病毒载体及 对阴性对照载体均包装成功 滴度分别 " " 0 " 和 0 " 组慢病毒载体转染 细胞后 $%$&& 的表达量均较阴性对照组明显降低 其中 $%$&'&' 对 $%$& 的抑制率明显高于其他两组 $%$&'&' ' 转染 后 肿瘤细胞的增殖程度显著减少 与空白组相比有统计学差异 细胞在划痕 后 空白对照组和实验组的细胞迁移指数,2 分别为 0034 和 034 差异有统计学意义 划痕 后 对照组与实验组的,2 分别为 034 和 304 差异有统计学意义 $%$&'&' 转染 细胞后 与空病毒载体组 空白组相比 $%$& 蛋白表达量明显降低 具有统计学意义 结论 $%$& 被沉默后可有效抑制 肿瘤细胞的增殖与迁移 这为后续研究以 $%$&$%$ 生物学轴为靶点的肿瘤基因治疗打下良好基础 关键词 结直肠癌 $%$&$%$ 重组慢病毒载体 &( 中图分类号 & 文献标志码 文章编号 '0'' 0!"#$% &''()'#*' $&$+$'$&&%&,&,&,#, 5 %(! $-. (!6 78#( 7-9!6 :#9*#!.#*6#!:#9*#!59*(!#(!9)"*6#* #8(*()(9#-(9)(9!(!6,#(9)$)#6#;(!"$(!9 -.. # (') #"*####$+,#(*""& +""" -"').#"#.#&+-""##" #*/#/ $#!&*"&+#"#010# #"& +#""#*/#" ##*####$+&,"#""### *')/ (&/### ('),#" #*& +"#"#$+#( ')#/!& +"#"#$+#" *(') # / ###*& +"#"$+(') 收稿日期 (( 修回日期 (( 基金项目 辽宁省自然科学基金项目资助 '& $"/ '$##"#'& 通讯作者 陆航 副教授 副主任医师 &1(* -&#* 作者简介 王鑫 0( 男 汉族 主治医师 学士 & 研究方向 胃肠道肿瘤的基因治疗 &1(*,-&#* 网络出版时间 ((000 网络出版地址,,,&#&#*"&00&&0&00&&*!"#"!

2 期 王 鑫 陈 玲 孙 飞 等 $%$&'& 靶向抑制结肠癌 细胞的体外实验研究 #/ +/& $.##*"#"#*/ #"##,##,/& *& *&0 *"&0 *# & 1 *'),, ## &&/( ')(,,&& *#, "#"# (')(#$+##*",# && *"#"###*, 0&03 &2 " 0&3&2#,#"# &&*",###*,0&3&2 " &3&02#, #"# && 1,"#"# $+# #*",* #"#,#"#&& "*$+*#"# / #,# ""## /#/.#& /01 ### #*/#') 结直肠癌是目前我国最常见的恶性肿瘤之一 死亡率高于世界平均水平 早期发生的侵袭转移是影响结直肠癌患者预后及生存的主要因素 治疗效果和临床预 ' 后不是十分理想 随着基因治疗的发展 从分子水平来阻断侵袭转移的基础和环境是目前肿瘤治疗研究的前沿 因此 我们需要深入地了解结直肠癌的转移机 ' 制并寻找有效的诊断标志物和新的治疗位点 趋化因子 #(!# 是一类最先发现表达于 免疫细胞 控制其定向炎症区域迁移的细胞因子 研究显示 趋化因子及其受体在肿瘤的增殖 转移过 程中扮演着重要的角色 有研究发现 $%$ 趋化因子 $%$ #(!#)(69!$%$ 和 $%$ 趋化因子受体 $%$ #(!#*##* $%$& 之间的相互作用是肿瘤侵袭转移和增殖的关键生物学行为 然而 最近的研究表明 在前列腺癌或乳腺癌中发现了 $%$ 的另一个趋化因子受体 $%$&$%$ #(!#*##*$%$& 也 ' 可以提高肿瘤细胞的增殖和侵袭转移能力 在前期研究中 我们发现从人结直肠癌组织中可检测到大量的 $%$& 蛋白的表达 相比于正常组织及癌旁组织有显著的提高 由此可以推测 $%$& 可能在结直肠癌的发生发展过程中发挥重要的生物学作用 & 干扰 &(!#*#*#!#&( 技术联合慢病毒载体 )#!((*9)#* 为内源性功能基因研 0' 究和治疗提供了新的策略 本研究将构建人 $%$& 的慢病毒小发卡或短发卡 &9)9(*' (!&**9(*(!&& 沉默表达载体 检测转染 细胞后对其增殖与转移功能的影响 为后续研究以 $%$&$%$ 生物学轴为靶点的肿瘤基因治疗打下良好基础 材料与方法 实验试剂 ()#!#* +, 慢病毒载体系统 (#9(!# 试剂购自 2!(*6#! 公司 -./0+ 细胞株 人结肠癌细胞株 购自中科院细胞库 细胞培养基 胎牛血清购自 5( 公司 限制性核酸内切酶 : 连接酶 质粒小提试剂盒 &+'1$& 一步法试剂盒 凝胶回收试剂盒等购自 +9/9&9 公司 兔抗人 $%$& 单克隆抗体 二抗 内参照等购自 9!9$*" 公司 其他常规试剂由辽宁医学院附属第一医院中心实验室提供 引物设计与合成 根据 5#!9!, 显示的人 $%$& 序列设计 对 & 沉默序列引物及 对阴性对照序列 经美国国立生物技术信息中心 $2 的数据库进行序列检索 结果其他基因序列无同源性 引物的设计与合成由 +9/9&9 公司完成 表 表 引物序列 +9$%$&'&*(#*#"#!# 名称序列 << $%$&'&''8 +$$$5$++$+$+++5$+$5$ $%$&'&''& +$+$+++5$+$55$5+5 $%$&'&''8 +5+$+$$$555+$ $%$&'&''& +5$++$+$55++5$+5 $%$&'&''8 +5+$$+5$+++5$++$+$5$ $%$&'&''& +$$+5$+++5$++$+$55+5 #69(#'8 +5$5$5$ $5$+$+ #69(#'& +$555$5$5$ 重组慢病毒表达载体的构建与包装 构建如下反应体系合成 $%$&'&' "#* 上下游引物各 : 聚合酶 超纯水 合成双链 )(6 片段 根据慢!"#"!

3 西安交通大学学报 医学版 第 卷 病毒载体系统试剂盒说明 将 ()#!#* +, 载体线性化后纯化回收 与上述构建完成的 $%$&'&' ' 片段连接后转化大肠杆菌 :- 挑取阳性克隆后扩增提取 : 片段 线性化后利用 (' #9(!# 试剂转染 -./0+ 细胞进行慢病毒包装并进行滴度测定 同理构建另外两组 $%' $&'& 慢病毒载体及阴性对照 慢病毒表达载体的效率测定 常规培养人结肠癌细胞 将上述 组实验病毒液及 组对照病毒液分别以最佳感染指数,=2> 转染后 培养 待到细胞发生细胞病变效应 9( ##$1. 后分别提取各组细胞的总 & 按照 &+'1$& 一步法试剂盒说明书操作 6 琼脂糖凝胶电泳后 使用凝胶成像系统分析条带吸光度值 值 重复上述实验 次 选取沉默效率最高的一组病毒液作为转染 的实验组病毒液 转染慢病毒后 细胞增殖的检测 常规培养人结肠癌细胞 传至第 代对数生长期 于 0 孔板上接种 转染上述沉默效率最高的慢病毒液 实验组 同时选取空白对照 每孔加入,++ 溶液 6? 温箱孵育 后 弃上清 3 标准差 3 表示 组间比较采用单因素方差分析 以 为差异有统计学意义 结 果 慢病毒载体的构建及包装结果 构建成功的 组慢病毒载体 ()#!#*+,'$%$&' & 及 组阴性对照序列经测序检测显示无碱基突变 组序列与预期 : 序列相符 说明合成的 $%$&'& 沉默序列插入正确 : 重组成功 可进行后续实验 测序由 +9/9&9 公司完成 慢病毒包装系统转染 -./0+ 细胞后 荧光显微镜下可见绿色荧光表达 同时出现 $1. 现象 细胞触角回收 肿胀变圆 一部分细胞脱落 悬浮于视野中 图 图 病毒滴度测定为 $%$&'&' "$%$&'&' "$%' $&'&'0 " 阴性对照 0 " 均符合慢病毒 &( 实验要求 可进行后续转染实验 每孔加入 :,= 在酶标仪上以波长 0! 测定各孔光吸收值 绘制细胞增殖曲线 细胞划痕实验 将生长状态良好的第 代 细胞接种于 孔板中培养 用 枪头在培养板中划一直线 形成无细胞区域 再加入含沉默效率最高的慢病毒液 实验组 和不加慢病毒液的培养基 空白对照组 分别培养细胞 在孵育 分别采集图像 在图像中划痕的上 中 下 个位置 测量细胞 裸露 区域的宽度 并计算其平均值 用细胞迁移指数 (6*9(!(!#,2 表示细胞迁移的快慢 转染慢病毒后 细胞中 蛋白表达的检测 将沉默效率最高的一组慢病毒液作为实验组 与空病毒载体组 空白组 $ 分别转染第 代 细胞后培养 提取各组细胞总蛋白并定量 配制 6 分离胶与 6 浓缩胶 进行电泳 转膜后丽春红复染 洗脱 次孵育一抗 兔抗人单克隆抗体? 过夜 孵育二抗 羊抗兔多克隆抗体 室温 用 $21+ 染色工作液避光室温孵育 凝胶成像系统分析膜上目的条带和内参照条带 重复 次测 值 计算净吸光度值 统计学处理 采用 1*(! 软件包对所得结果进行统计学分析 计量资料用均数 图 慢病毒载体转染 20/3. 细胞后 病毒包装的观察 -./0+ #)"*)9#*#*#"!#*!9! )"*##!#(!#*#(*# 普通倒置显微镜观察转染效果 荧光倒置显微镜观察转染效果 慢病毒载体干扰效率的测定结果 &+'1$& 结果显示 细胞转染 组 $%$&'& 及 组阴性对照后 $ 个实验组的 $%$& & 表达量相对于对照组 : 组 明显减少 差异有统计学意义 其中 $%$&'&' 转染组 组 的 $%$&& 表达量明显低于其他 实验组 $ 组 差异同样具有统计学意义 说明 $%' $&'&' 组 组 对于结肠癌细胞 的 $%$&& 的抑制率高于另外 组 因此 我们将选择 $%$&'&' 作为后续实验的实验组 图 转染慢病毒后 细胞增殖的检测结果 两组 细胞分别在培养 0 后用,++ 法检测细胞密度 值 并根据酶标仪检测的 值绘制细胞增殖曲线 结果表明 空白对照组 组 细胞生长迅速 实验组 组 经慢病毒液转染!"#"!

4 期 王 鑫 陈 玲 孙 飞 等 $%$&'& 靶向抑制结肠癌 细胞的体外实验研究 后细胞增殖程度显著减少 与 组相比有统计学差异 说明慢病毒载体抑制 $%$& 基因表达后可显著抑制结肠癌细胞 的增殖 图 图 转染病毒后各时间段 细胞增殖生长曲线 8(6 #)*)(#*9(!9!6* "*#9#*(*" *9!#(! 转染慢病毒后 细胞迁移的检测结果 细胞在划痕 后 空白对照组和实验组的细胞迁移指数,2 分别为 0034 和 03 图.4 检测 % 的表达 8(6$%$&&#*#(!###&+'1$& $%$&'&'$%$&'&'$$%$&'&' :#69(#'$!*) 4 两者相比有统计学意义 划痕 后 空白对照组与实验组的,2 分别为 03 4 和 304 两者相比有统计学意义 提示 慢病毒液 $%$&'& 可以使 细胞的远处迁移指数降低 进一步降低结肠癌细胞的细胞迁移能力 图 图 对结肠癌细胞 迁移的影响 8(6.#!$%$&'&! #)(6*9(! )! 9!#*,2>46A666 是指划痕后立即采集图像 时划痕处 裸露 区测量的宽度 6 是指从划痕细胞培养 后采集图像时划痕处 裸露 区测量的宽度 转染慢病毒后 细胞 蛋白的表达结果 ##*!) 检测结果可见 空病毒载体组 与空白组 $$%$& 蛋白表达量明显高于实验 组 具有统计学意义 而 $ 两组之间相比无统计学差异 图!"#"!

5 西安交通大学学报 医学版 第 卷降低 相对于阴性对照组有明显的统计学意义 说明实验组转染 细胞成功 并成功抑制了该细胞中的 $%$& & 的表达 从 组实验组的 $%' $&& 表达量比较来看 $%$&'&' 组的抑制率比其他两组略高 差异具有统计学意义 说明 $%$&'&' 组的沉默效果最好 可用于后续转染实验 在对 增殖抑制方面 我们通过,++ 的方法发现转染病毒后的 0 这 个时间段内 空白组 组 癌细胞生长增殖迅速 呈现出对数上升的趋势 而将实验组 组 转染后肿瘤细胞增殖程度显著减少 与 组相比有统计学差异 说 图 '#&+' 检测 蛋白表达 8(6$%$&*#(!#*#(!### ##*!) 基因沉默实验组 空病毒载体组 $ 空白组 讨 论恶性肿瘤的生长和转移是一个极其复杂的过程 肿瘤细胞的异常增殖和远处侵袭是结直肠癌发生发展的关键步骤 其关键因子可以用来作为临床靶向治 疗的研究目标 趋化因子及其受体在多种肿瘤的增殖和远处转移中发挥了关键的作用 尤其是 $%' $'$%$&$%$& 生物学轴 与 $%$& 类似 $%$& 也是人类免疫缺陷病毒 "9!("!#' ((#!(*"-2@ 感染 $: B 淋巴细胞的协同受 体 目前的研究发现 配体活化的 $%$& 可以极大的提高肿瘤细胞的生长增殖 粘附和转移侵袭能 力 有研究表明 在高侵袭性的前列腺癌组织中 $%$& 表达上调 而在采用 $%$& 因子拮抗剂之 ' 后也可以抑制乳腺癌与肺癌的生长和转移 & 是具有紧密发卡环结构的 & 序列 常被应用于 &( 技术特异性沉默靶基因的表 达 本实验充分考虑了 & 转染成本低廉 转染持久性及稳定性好等特点 选择其构建慢病毒载体介导的 $%$&'& 进行基因沉默实验 在载体构建成功后 以载体中含有的增强型绿色荧光蛋白 #!9!#6*##!)"*##!#*#(!.581 作为示踪因子 在病毒包装后能够很方便的通过荧光显微镜检测包装效果 实验结果表明 组 $%$&'&' 慢病毒载体与阴性对照组在荧光显微镜下均有大量绿色荧光表达 表明携带有.581 的慢病毒表达载体包装成功 且转染效率均可达 4 以上 &+'1$& 检测结果说明 实验组的 种重组慢病毒载体 $%$&'& 转染至结肠癌 细胞后 不同程度上使细胞内 $%$& 的 & 表达量 明重组慢病毒载体 $%$&'&' 通过抑制 $%' $& 基因表达后可进一步抑制结肠癌细胞 的增殖 证明了 $%$& 基因在结肠癌的生长增殖过程中起到一定作用 肿瘤细胞的侵袭和迁移是肿瘤进展的一个十分 重要的环节 我们通过细胞划痕实验研究发现 重组慢病毒载体 $%$&'&' 能够使 细胞的,2 降低超过 4 能够抑制 细胞划痕的愈合的能力 即抑制结肠癌细胞的远处侵袭和迁移能力 这是对于重组慢病毒载体 $%$&'&' 对肿瘤细胞迁移能力影响的十分重要的结论 对于 $%$& 蛋白表达检测结果来说 ##*! ) 实验证实 实验组 转染至结肠癌细胞 后 可以使细胞中的 $%$& 蛋白表达量降低 相对于空病毒载体组 和空白组 $ 有明显的统计学意义 而空病毒载体组和空白组比较 $%$& 的蛋白表达量没有明显的变化 两者之间差别没有统计学的意义 结果证明 我们成功将 & 片段转染进 细胞 并成功抑制了细胞内部 $%$& 蛋白的表达 由此可以推断 $%$& 基因在结肠癌的增殖与侵袭转移的机制中可能起到重要的作用 而通过慢病毒载体抑制 $%$& 基因的表达对于我们下一步研究以 $%$&$%$ 生物学轴为靶点的结直肠癌基因治疗打下了良好的基础 为该病毒载体的抗肿瘤效应提供了新的证据 为结直肠癌的基因治疗提供了新的治疗选择 参考文献 34)3!5&### & 6$#700(0& $6)5) $5)'8+$) )6+316 &/ " *###*&5!( (& 下转第 页!"#"!

6 西安交通大学学报 医学版 第 卷 "#"# * ####&'( #* (& +)'9 3)8 &/### ## *##& )##$#0(& 周杰 章翔 蒋晓帆 等 & 白藜芦醇对大鼠脑创伤后血清 '( 和 3( 影响的实验研究 & 中华神经医学杂志 (& ))'$73$139!89)')& ","##*((( "#"#" &)#$ (0& '31 ')' ''5&( ", ##"*#*( ( &%#$ (& 王晓东 杨迎暴 苏薇薇 & 白黎芦醇对过氧化氢损伤脊髓神经元分泌一氧化氮的影响 & 中药材 (& 刘世清 梅红军 刘军 等 & 白藜芦醇对大鼠脊髓损伤早期 7#( "#"#" &)#$ (0& )1$8)43$)3'86 1&'#/ *#/ &! 7#*0((& 34)' 64)'9&'##( #*# *""/ *" *"*"&'#* 30(& 304)' 660&'##( #*# *""/ */ */*""&'( *#((& $)3$0'9! 4&( ##"##/#* # "*#*&%#$ ( & )8 084)')93&%#*#*( 和 7 表达的影响 & 中国临床康复 0(& *#" &' 00 ))'$73$139!89)')& (0& ","##*((( 编辑 韩维栋 上接第 页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编辑 卓选鹏!"#"!

2014,34(2) 王鑫等 :RNAi 沉默 CXCR7 对人结肠癌细胞 SW620 特异性靶向抑制的实验研究 15 趋化性细胞因子简称趋化因子 (chemokines), 是一类最先发现表达于免疫细胞 控制其定向炎症区域迁移的细胞因子 [6] 最近的研究显示, 趋化因子及其受体在肿瘤的增殖 转移

2014,34(2) 王鑫等 :RNAi 沉默 CXCR7 对人结肠癌细胞 SW620 特异性靶向抑制的实验研究 15 趋化性细胞因子简称趋化因子 (chemokines), 是一类最先发现表达于免疫细胞 控制其定向炎症区域迁移的细胞因子 [6] 最近的研究显示, 趋化因子及其受体在肿瘤的增殖 转移 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2014,34(2):14 20 DOI:10.13523/j.cb.20140203 RNAi 沉默 CXCR7 对人结肠癌细胞 SW620 特异性靶向抑制的实验研究 王鑫陈玲孙飞陆航 ( 辽宁医学院附属第一医院锦州 121000) 摘要目的 : 探讨慢病毒介导的 CXCR7 shrna 转染人结肠癌细胞株 SW620 后对 CXCR7 蛋白表达的影响

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