中国药理学通报３ＣＣＫ８法测定细胞增殖ＣｈＰｈｍｇＢｕ２６Ｊｕ３２７９６７取对数生长期３Ｓ２细胞按每孔５接种于９６孔板中常规培养基实验分组同２２各药物浓度组均设３个复８７２ｈ后每孔加孔和个空白孔分别作用２４４

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1 966 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Jul;32(7):966~70 网络出版时间 : :49 网络出版地址 :htp:// 水飞蓟素对人骨肉瘤 Saos 2 细胞的抑制作用及相关机制严晨 1,2, 邬亚华 3, 王子瑶 1,2, 殷嫦嫦 3 1, 殷明 ( 南昌大学 1. 第二附属医院 2. 研究生院医学部, 江西南昌 ;3. 九江学院, 江西九江 ) doi: /j.isn 文献标志码 :A 文章编号 : (2016) 中国图书分类号 :R284.1;R329.24;R329.25;R 摘要 : 目的研究水飞蓟素对人骨肉瘤 Saos 2 细胞增殖凋亡的影响, 并探讨其可能的作用机制方法设置对照组及不同浓度水飞蓟素组, 作用人骨肉瘤 Saos 2 细胞倒置相差显微镜观察细胞形态变化 ;CCK 8 法测定细胞增殖 ; 流式细胞仪检测细胞凋亡 ;Westernblot 检测 ERK1/2 p ERK1/2 及 cleavedcaspase 3 蛋白表达结果水飞蓟素抑制 Saos 2 细胞增殖, 呈时间及浓度依赖性 ; 水飞蓟素诱导 Saos 2 细胞凋亡, 呈浓度依赖性 ; 水飞蓟素降低 Saos 2 细胞 p ERK1/2 蛋白表达, 增加 Saos 2 细胞 cleavedcaspase 3 蛋白表达, 呈浓度依赖性, 而 ERK1/2 蛋白表达无明显变化结论水飞蓟素能够抑制人骨肉瘤 Saos 2 细胞增殖及诱导其凋亡, 其作用机制可能与抑制 ERK 信号通路及上调 caspase 3 蛋白表达有关关键词 : 水飞蓟素 ; 骨肉瘤 ; 增殖 ; 凋亡 ; 机制 ;ERK 信号通路 ;caspase 3 骨肉瘤 (osteosarcoma,os) 是最常见的原发性恶性骨肿瘤, 多发于儿童及青少年 [1] 目前,OS 的主要治疗策略为手术切除联合化疗近年来统计, 无转移 OS 患者的总生存率能达到 70%, 而出现肺转移或骨转移, 生存率只有 25% ~50% [2], 且大剂量使用化疗药物产生严重的毒副作用及耐药的频繁发生, 使得 OS 患者的生存率并没有得到明显提高, 因此,OS 的治疗需进一步探讨研究发现, 一些中药也具有抑制肿瘤细胞的作用, 且毒副作用小, 可作为传统化疗药物的辅助用药或联合使用, 以增加化疗药物的敏感性或减少其用量, 以更好的抗 OS 治疗水飞蓟素 (silymarin,sm) 是从植物水飞蓟中提取的一种活性成分, 为多酚类黄酮, 具有抗炎抗氧收稿日期 : , 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (No ) 作者简介 : 严晨 (1986-), 男, 硕士生, 研究方向 : 中药抗骨肿瘤, E mail:yanchen8623@163.com; 殷明 (1958-), 男, 教授, 主任医师, 博士生导师, 研究方向 : 脊柱与肿瘤, 通讯作者,E mail:yinming0791@ aliyun.com 化抗纤维化肝细胞再生等作用, 临床已运用其治疗肝脏疾病 [3] 近年来研究发现,SM 对乳腺癌皮肤癌前列腺癌宫颈癌结肠直肠癌卵巢癌肝癌膀胱癌肺癌具有抑制作用 [4-6], 但对 OS 的作用尚不清楚本实验研究 SM 对 OS 的作用, 并进一步探讨其可能的作用机制 1 材料 1.1 细胞系人骨肉瘤 Saos 2 细胞为本实验室库存 1.2 主要药品与试剂水飞蓟素 ( 山东西亚生化科技有限公司, 批号 );DMSO(Solarbio 公司, 美国, 批号 02A033); 胰酶 (Solarbio 公司, 美国, 批号 );α MEM(Hyclone 公司, 美国, 批号 NAP1372); 胎牛血清 (Hyclone 公司, 美国, 批号 : NYM1035);CCK 8 细胞增殖检测试剂盒 ( 上海经科化学科技有限公司, 批号 :JK 021);AnnexinV FITC /PI 凋亡检测试剂盒 ( 北京庄盟国际生物基因科技有限公司, 批号 :150509J); 总蛋白提取试剂盒 ( 北京普利莱基因技术有限公司, 批号 :P1250); 兔抗人 ERK1/2 单克隆抗体 (CelSignaling 公司, 美国, 批号 :14);p ERK1/2 单克隆抗体 (CelSignaling 公司, 美国, 批号 :15); 兔抗人 GAPDH(Proteintech 公司, 美国, 批号 : AP);cleavedcaspase 3 多克隆抗体 (Proteintech 公司, 美国, 批号 : AP); 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗 ( 北京康为世纪生物科技有限公司, 批号 :1215E) 2 方法 2.1 细胞培养人骨肉瘤 Saos 2 细胞从液氮中复苏后, 用 10% 胎牛血清的 α MEM 培养基, 置于 37 5% CO 2 的培养箱中培养, 每 3d 换液 1 次, 待细胞汇合 80% ~90% 后, 按 1 3 传代培养或进行相关实验 2.2 倒置相差显微镜观察细胞形态变化取对数生长期 Saos 2 细胞, 按每孔接种于 24 孔板中, 常规培养 24h 后, 按照实验分组更换含不同药物浓度的培养基, 实验分 6 组 :0μmol L -1 ( 对照组 ) μmol L -1, 作用 48h 后, 倒置相差显微镜观察细胞形态, 并拍照

中国药理学通报３ＣＣＫ８法测定细胞增殖ＣｈＰｈｍｇＢｕ２６Ｊｕ３２７９６７取对数生长期３Ｓ２细胞按每孔５

３７培养箱中孵育２ｈ酶标仪波长４５ｍ测定各孔吸光度ＯＤＡ值各组吸光度ＯＤＡ细胞Ａ空白细胞增殖抑制率ＦｇＭｐｈｇｂｖ

流式细胞仪检测细胞凋亡取对数生长期ＬＤ２μｍＬＥ６ μｍＬＦ２ μｍＬＳ２细胞按每孔５５接种于６孔板中常规２作用

ｇｂｕｆｆ轻轻重悬细胞重悬后先加入５μＬＡｘＶＦＩＴＣ再加入 μｌｐｉ轻轻混匀在室温下避光反应ｍ行流式细胞仪检测计算凋亡率５

４组对照组 μｍＬ低浓度组４ μｍＬ中浓度组２μｍＬ高浓度组２μｍＬ作用４８ｈ后常规消化收集各组细胞

ｐＥＲＫ２２ｖｄｐ３４过夜ＴＢＴＳ洗膜３次孵育二抗６ＴＢＴＳ洗膜３次暗室胶片曝光条带用ＩｍｇＪ软件进行灰度分析６

对照组细胞生长良好呈梭形或不规则形胞质透亮胞膜光整处理组部分细胞体积缩小变圆细胞内颗粒增多胞膜边缘毛糙折光度增强呈细胞凋亡样形态学改变

2 中国药理学通报３ＣＣＫ８法测定细胞增殖ＣｈＰｈｍｇＢｕ２６Ｊｕ３２７９６７取对数生长期３Ｓ２细胞按每孔５接种于９６孔板中常规培养基实验分组同２２各药物浓度组均设３个复８７２ｈ后每孔加孔和个空白孔分别作用２４４入 μｌｃｃｋ８试剂３７培养箱中孵育２ｈ酶标仪波长４５ｍ测定各孔吸光度ＯＤＡ值各组吸光度ＯＤＡ细胞Ａ空白细胞增殖抑制率ＦｇＭｐｈｇｂｖｆｓ２ｈｂＩＲＩＲＯＤ实验ＯＤ对照ｄｗｈｙｍｆ４８ｈＡＣｇｕｐ μｍＬＢ４ μｍＬＣ８ μｍ４流式细胞仪检测细胞凋亡取对数生长期ＬＤ２μｍＬＥ６ μｍＬＦ２ μｍＬＳ２细胞按每孔５５接种于６孔板中常规２作用４８ｈ后消化收集细培养基实验分组同２胞用ＰＢＳ重新悬浮细胞并计数各组取２５细５ｍ５ｍ离心后弃上清加胞悬浮液入５ μｌＢｄｇｂｕｆｆ轻轻重悬细胞重悬后先加入５μＬＡｘＶＦＩＴＣ再加入 μｌｐｉ轻轻混匀在室温下避光反应ｍ行流式细胞仪检测计算凋亡率５Ｗｂ检测细胞内ＥＲＫ２ｐＥＲＫ２及ｖｄｐ３蛋白表达取对数生长期５Ｓ２细胞按每孔５接种于６孔板中常规培养基实验分４组对照组 μｍＬ低浓度组４ μｍＬ中浓度组２μｍＬ高浓度组２μｍＬ作用４８ｈ后常规消化收集各组细胞按总蛋白抽提试剂盒操作说明提取各组细胞总蛋白行聚丙烯酰胺ＳＤＳＰＡＧＥ凝胶电泳转膜５ＢＳＡ封闭孵育一抗ＧＡＰＤＨ４ＥＲＫ２ｐＥＲＫ２２ｖｄｐ３４过夜ＴＢＴＳ洗膜３次孵育二抗６ＴＢＴＳ洗膜３次暗室胶片曝光条带用ＩｍｇＪ软件进行灰度分析６统计学处理采用ＳＰＳＳ９软件对数据进行统计学分析数据以ｘ±方式表示两组间采用检验及单因素方差分析３结果３细胞形态学观察显微镜下观察显示对照组细胞生长良好呈梭形或不规则形胞质透亮胞膜光整处理组部分细胞体积缩小变圆细胞内颗粒增多胞膜边缘毛糙折光度增强呈细胞凋亡样形态学改变处理组细胞数量减少细胞间隙增宽可Ｆｇ２Ａｐｐｆｓ２ｄｗｈｙｍ见少许细胞脱壁漂浮随着浓度的增大处理组上ｇ述形态学改变越明显Ｆ ± ｆ４８ｈｄｄｂｙｆｗｙｍｙｘ４Ｐ５ｖ

968 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Jul;32(7) 3.

IR/%(24h) IR/%(48h) IR/%(72h) Control 0 0 0 40μmol L -1 10.16±2.31 14.96±2.89 18.34±1.93 80μmol L -1 24.42±4.42 34.05±2.03 41.41±4.35 120μmol L -1 52.01±7.81 65.01±2.78 71.62±4.44 160μmol L -1 68.

3 水飞蓟素对骨肉瘤 Saos 2 细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示 : 水飞蓟素诱导细胞凋亡, 各组细胞凋亡率分别为 (2 08±0 12)% (8 15± 0 37)% (15 37±1 06)% (32 68±2 02)% (48 34±1 59)% (67 58±2 43)%, 处理组浓度越高, 凋亡率越大, 与对照组比差异有显著性 (P< 0 05), 见 Fig2 3.

[7-10], 水飞蓟素具有预防癌症发生及抗肿瘤作用, 毒副作用小, 还能增加多柔比星顺铂和卡铂的敏感性本研究 CCK 8 及流式检测结果显示, 水飞蓟素能够抑制 Saos 2 细胞增殖并诱导其凋亡, 并呈浓度依赖性丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen activatedprotein kinases,mapks) 是一类丝氨酸 / 酪氨酸蛋白激酶, 广泛存在于哺乳动物细胞内,MAPKs

3 968 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Jul;32(7) 3.2 水飞蓟素对骨肉瘤 Saos 2 细胞增殖的影响 CCK 8 结果显示 : 处理组均抑制骨肉瘤 Saos 2 细胞增殖, 药物浓度越大, 作用时间越长, 增殖抑制越明显, 与对照组相比差异有显著性 (P<0 05), 见 Tab 1 Tab1 Proliferationinhibitionrate ofsilymarinonsaos 2cels( x±s,n=4) Group IR/%(24h) IR/%(48h) IR/%(72h) Control μmol L ± ± ± μmol L ± ± ± μmol L ± ± ± μmol L ± ± ± μmol L ± ± ±2.80 P<0 05vscontrol 3.3 水飞蓟素对骨肉瘤 Saos 2 细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示 : 水飞蓟素诱导细胞凋亡, 各组细胞凋亡率分别为 (2 08±0 12)% (8 15± 0 37)% (15 37±1 06)% (32 68±2 02)% (48 34±1 59)% (67 58±2 43)%, 处理组浓度越高, 凋亡率越大, 与对照组比差异有显著性 (P< 0 05), 见 Fig2 3.4 水飞蓟素对骨肉瘤 Saos 2 细胞 ERK1/2 p ERK1/2 及 cleavedcaspase 3 蛋白表达的影响 Westernblot 结果显示 : 水飞蓟素降低 Saos 2 细胞内 p ERK1/2 蛋白表达, 增加 cleavedcaspase 3 蛋白表达, 与对照组相比差异有显著性 (P<0 05), 而 ERK1/2 蛋白表达无明显变化 (Fig3) 4 讨论研究证实 [7-10], 水飞蓟素具有预防癌症发生及抗肿瘤作用, 毒副作用小, 还能增加多柔比星顺铂和卡铂的敏感性本研究 CCK 8 及流式检测结果显示, 水飞蓟素能够抑制 Saos 2 细胞增殖并诱导其凋亡, 并呈浓度依赖性丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen activatedprotein kinases,mapks) 是一类丝氨酸 / 酪氨酸蛋白激酶, 广泛存在于哺乳动物细胞内,MAPKs 信号通路为细胞内重要信号转导通路, 参与调控细胞的存活生长增殖分化及凋亡等多项生理过程 [11] 非磷酸化的 MAPKs 为静息状态, 而磷酸化的 MAPKs 为激活状态, 当 MAPKs 信号通路受到上游激酶作用下, 发生磷酸化后而被激活, 进一步激活下游转录因子, 启动相关基因及蛋白表达, 发挥生物学效应研究发现, 多种恶性肿瘤中 MAPKs 信号通路过表达或过激活, 如 : 肝癌肾癌胰腺癌食管癌 [12-16] MAPKs 主要包括 3 个亚家族 :ERK(extracelularsignal regulated kinase) 家族 JNK(C JUN N terminalkinase) 家族 p38 家族, 其中 ERK 与细胞的生长增殖密切相关有研究报道, 水飞蓟素可通过 MAPKs 信号转导通路促进肺腺癌 A549 细胞凋亡, 其中 ERK1/2 磷酸化明 Fig3 Cleavedcaspase 3,ERK1/2,p ERK1/2proteinexpresionof Saos 2celstreatedwithsilymarinfor48hdetectedbyWesternblot( x±s,n=4) P<0 05vscontrol

4 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Jul;32(7) 969 显受到抑制 [17] [18] 徐良志等研究发现, 大黄素通过抑制 ERK 信号通路, 抑制骨肉瘤细胞增殖, 导致细胞凋亡 caspase 家族是一组半胱氨酸蛋白酶, 在介导细胞凋亡过程中起到重要的作用细胞凋亡途径有多种, 但绝大多数途径末端都是通过 caspase 的级联激活, 最终激活 caspase 3, 形成具有活性的 cleavedcaspase 3 片段, 进一步产生一系列级联反应, 导致细胞凋亡 [19] [20] 施剑明等研究发现, 槲皮素顺铂能增加骨肉瘤 MG 63 细胞 cleavedcaspase 3 蛋白表达, 抑制细胞增殖及促进其凋亡本研究中, 水飞蓟素作用骨肉瘤 Saos 2 细胞 48h 后,p ERK1/2 蛋白表达降低,cleavedcaspase 3 蛋白表达增加, 呈浓度依赖性, 而 ERK1/2 蛋白表达无明显变化, 表明水飞蓟素能够抑制 ERK 磷酸化, 阻滞 ERK 信号传导通路, 同时上调 caspase 3 蛋白表达综上所述, 水飞蓟素能够抑制 Saos 2 细胞增殖及诱导其凋亡, 可能与抑制 ERK 信号通路及上调 caspase 3 蛋白表达有关本研究为水飞蓟素抗骨肉瘤及其作用靶点提供一定的实验参考 ( 致谢 : 本实验在九江学院医学转化实验室完成, 感谢实验室全体成员对本实验的支持与帮助!) 参考文献 : [2] LiuY,HeJ,ChenX,etal.Theproapoptoticefectofformonone tininhumanosteosarcomacels:involvemtofinactivationoferk andaktpathways[j].celphysiolbiochem,2014,34(3): [3] SalerR,MeierR,BrignoliR.Theuseofsilymarininthetreat mentofliverdiseases[j].drugs,2001,61(14) [4] AgarwalR,AgarwalC,IchikawaH,etal.Anticancerpotentialof silymarin:frombenchtobedside[j].anticancerres,2006,26 (6B): [1] MiwaS,SugimotoN,YamamotoN,etal.Cafeineinducesapop tosisofosteosarcomacelsbyinhibitingakt/mtor/s6k,nf κb andmapkpathways[j].anticancerres,2012,32(9): [5] SinghRP,AgarwalR.Prostatecancerchemopreventionbysilibi nin:benchtobedside[j].molcarcinog,2006,45(6): [6] SinghRP,AgarwalR.Acancerchemopreventiveagentsilibinin, targetsmitogenicandsurvivalsignalinginprostatecancer[j]. MutatRes,2004,555(1-2): [7] SaxenaA,SaxenaAK,SinghJ,etal.Naturalantioxidantssyner gisticalyenhancetheanticancerpotentialofap9 cd,anovellig nancompositionfrom CedrusdeodarainhumanleukemiaHL 60 cels[j].chembiolinteract,2010,188(3): [8] DeepG,GangarSC,OberliesNH,etal.IsosilybinAinduces apoptosisinhumanprostatecancercelsviatagetingakt,nf κb, andandrogenreceptorsignaling[j].molcarcinog,2010,49 (10): [9] KaurM,VelmuruganB,TyagiA,etal.Silibininsuppreses growthofhumancolorectalcarcinomasw480incultureandxeno graftthroughdown regulationofbeta catenin dependentsignaling [J].Neoplasia,2010,12(5): [10]CheungCW,GibbonsN,JohnsonDW,NicolDL.Silibinin a promisingnew treatmentforcancer[j].anticanceragentsmed Chem,2010,10(3): [11] 钟良瑞, 魏克民. 三叶青黄酮对肺癌 A549 细胞生长抑制与 MAPKs 通路关系的研究 [J]. 中国药理学通报,2014,30(1): [11]ZhongLR,WeiKM.Radixtetrastigmahemsleyaniflavonesup preseshumanlungcarcinomaa549 celbyregulatingmapks pathway[j].chinpharmacolbul,2014,30(1): [12] YoungA,LyonsJ.Rassignalingandtherapies[J].AdvCancer Res,2009,102:1-17. [13] WangC,MaasT,KruppM,etal.Asystemsbiologyperspective oncholangiocelularcarcinomadevelopment:focusonmapk sig nalingandtheextracelularenvironment[j].jhepatol,2009,50 (6): [14]DingY,BoguslawskiEA,BerghuisBD,etal.Mitogen activated proteinkinasekinasesignalingpromotesgrowthandvascularization offibrosarcoma[j].molcancerther,2008,7(3): [15]PengCL,GuoW,JiT,etal.Sorafenibinducesgrowthinhibi tionandapoptosisinhumansynovialsarcomacelsviainhibiting theraf/mek/erk signalingpathway[j].cancerbiolther, 2009,8(18): [16]KeswaniRN,ChumsangsriA,MustafiR,etal.Sorafenibinhib itsmapk mediatedproliferationinabaret sesophagealadeno carcinomacelline[j].disesophagus,2008,21(6): [17] 李文海, 梁军, 王春梅, 等. 水飞蓟素可通过 MAPK 信号转导通路促进肺腺癌 A549 细胞凋亡 [J]. 第四军医大学学报, 2008,29(5): [17]LiW H,LiangJ,WangCM,etal.Apoptosisoflungadenocarci namacellinea549promotedbysilymarinthroughmapksignal transductionpathway[j].jfourthmilmeduniv,2008,29(5): [18] 徐良志, 陈昆仑. 大黄素对骨肉瘤细胞增殖的抑制及相关机制 [J]. 山东大学医学版,2014,52(6): [18] XuLZ,ChenKL.Inhibitoryefectanditsmechanismofemodin ontheproliferationofhumanosteosarcomaceline[j].jshan DongUniv(HeaSci),2014,52(6): [19] 刘金娟, 杨成流, 陈永强, 等. 鱼腥草地下茎提取物诱导胃癌细胞 SGC 7901 凋亡机制的研究 [J]. 中国药理学通报,2014, 30(2): [19]LiuJJ,YangCL,ChenYQ,etal.MechanismofSGC 7901ap optosisinducedbyhoutuyniacordatathunbsubteraneousstem extraction[j].chinpharmacolbul,2014,30(2): [20] 施剑明, 殷嫦嫦, 孙维君, 等. 槲皮素联合顺铂对人骨肉瘤 MG63 细胞增殖及凋亡的影响 [J]. 中国药理学通报,2014, 30(10): [20] ShiJM,YinCC,SunW J,etal.Efectofquercetincombined withcisplatinonproliferationandopoptosisofhumanosteosarcoma celmg63[j].chinpharmacolbul,2014,30(10):

5 Inhibitoryefectofsilymarinonhuman osteosarcomasaos 2celsanditsmechanism YANChen 1,2,WUYa hua 3,WANGZi yao 1,2,YINChang chang 3,YINMin 1 (1.TheSecondAfiliatedHospitaltoNanchangUniversity,2.MedicalGraduateSchool ofnanchanguniversity,nanchang ,China;3.JiujiangColege,JiujiangJiangxi ,China) Abstract:Aim Tostudytheefectofsilymarinon proliferationandapoptosisofhumanosteosarcomasaos 2celsandtoexploreitsposiblemechanisms.Meth ods Controlgroupanddiferentconcentrationgroups ofsilymarinwereset,andsaos 2celsweretreated withsilymarin.celuarmorphologicchangeswereob servedbyinvertedphasecontrastmicroscope.prolifer ationofcelswastestedcck 8asay.Apoptosisrateof celswasanalyzed byflow cytometry.erk1/2 p ERK1/2andcleavedcaspase 3proteinexpresionwere measuredbywesternblot.results Silymarininhibi tedtheproliferationofsaos 2celsinatime dependent and concentration dependentmanner. Silymarin in ducedtheapoptosisofsaos 2celsinaconcentration dependentmanner. Silymarin decreased p ERK1/2 protein expresion and increased cleaved caspase 3 proteinexpresioninaconcentration dependentman ner,whileerk1/2proteinexpresionhadnoobvious change.conculsions Silymarincaninhibittheprolif erationofhumanosteosarcomasaos 2celsandinduce apoptosisofthem,andthemechanism mayberelated toinhibitionoferksignalingpathwayandupregulated caspase 3proteinexpresion. Key words:silymarin; osteosarcoma; proliferation; apoptosis; mechanism; ERK signaling pathway; caspase 3