中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Oct;32(10) 1453 MCF 7 在含 10% FBS 的 RPMI1640 培养基,37, 5% CO 2 培养箱培养 细胞传代 3 次以上, 在对数生长期进行实验 细胞转染将细胞悬液均匀铺于

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1 1452 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Oct;32(10):1452~7 网络出版时间 : :14 网络出版地址 :htp:// 吞噬细胞运动蛋白 1 在 IL 8 诱导的乳腺癌细胞的侵袭和转移中发挥重要作用 张长杰 1, 徐新伟 1, 李洪利 2, 刘雨清 1 3, 尹崇高 ( 潍坊医学院 1. 病理学教研室 2. 医学研究实验中心 3. 护理学院, 山东潍坊 ) doi: /j.isn 文献标志码 :A 文章编号 : (2016) 中国图书分类号 :R341;R392 12;R73 37;R737 9 摘要 : 目的探讨吞噬细胞运动蛋白 1(engulfmentandcel motility1,elmo1) 在 IL 8 诱导的乳腺癌细胞侵袭和转移过程中的作用 方法采用趋化运动实验检测不同浓度 IL 8 刺激下乳腺癌细胞的趋化运动能力 ; 采用 Westernblot 检测乳腺癌细胞中 ELMO1 的表达情况 ; 利用小 RNA 干扰技术, 瞬时转染乳腺癌细胞 MDA MB 231, 用过表达质粒上调乳腺癌细胞 MCF 7 中 ELMO1 的表达 ; 应用趋化运动实验和 Tran swel 侵袭实验检测各组转染细胞的趋化和侵袭能力 结果趋化运动实验结果显示, 在 IL 8 刺激下, 乳腺癌细胞 MDA MB 231 和 MCF 7 的运动能力明显增强, 具有剂量依赖性 ;Westernblot 结果显示 ELMO1 在 sielmo1/mda MB 231 细胞中的表达明显降低, 而在 MCF 7/ELMO1 细胞中的表达明显增高 ; 趋化运动实验结果显示在 IL 8 刺激下,SiELMO1/ MDA MB 231 细胞组的趋化运动能力明显降低,MCF 7/EL MO1 细胞组的趋化运动能力明显增强 ;Transwel 侵袭实验结果显示在 IL 8 刺激下, 敲除 ELMO1 明显降低 MDA MB 231 细胞的侵袭能力, 过表达 ELMO1 明显增强 MCF 7 细胞的侵袭能力 结论 IL 8 能促进 MDA MB 231 和 MCF 7 细胞的趋化运动和侵袭能力, 而 ELMO1 在 IL 8 诱导的乳腺癌细胞趋化和侵袭作用中发挥重要作用 关键词 : 乳腺癌 ;IL 8;ELMO1; 侵袭 ; 转移 ; 趋化运动乳腺癌 (breastcancer,bc) 是世界范围内严重危害女性健康的恶性肿瘤, 具有高转移率和高复发率, 肿瘤细胞从原发病灶脱落, 浸润周围组织及发生远处转移是乳腺癌难以治愈的关键 [1] 白细胞介收稿日期 : , 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金青年基金项目 (No ); 山东省自然科学基金 (NoZR2014HL077,ZR2015HL065); 山东省高等学校科技计划 (NoJ12LK03,J13LK03) 作者简介 : 张长杰 (1991-), 男, 硕士, 研究方向 : 肿瘤病理学,E mail: @163.com; 刘雨清 (1962-), 女, 硕士, 教授, 研究方向 : 肿瘤病理学, 通讯作者,E mail:yuqingliu89@hotmail.com; 尹崇高 (1979-), 男, 硕士, 副教授, 研究方向 : 乳腺肿瘤, 通讯作者,E mail:ycglihongli@163.com 素 8(interleukin 8,IL 8) 主要由单核细胞和内皮细胞分泌, 能激活细胞表面趋化因子受体的多个细胞内下游信号通路, 其分泌在正常细胞中受到严格控制 [2] [3],Zuccari 等利用免疫组织化学技术检测 72 例乳腺癌标本, 结果发现 IL 8 在乳腺癌中的表达高于正常乳腺组织 IL 8 表达增多具有促进血管生成和肿瘤形成的功能, 参与肿瘤的发生 发展和转移过程 吞噬细胞运动蛋白 1(engulfmentandcelmotili ty1,elmo1) 是进化上非常保守的一种蛋白质, 主要介导细胞的吞噬 移动和形态改变,ELMO 蛋白在肌动蛋白细胞骨架和微管网络中发挥重要作用, 调节细胞运动能力 [4] 在乳腺癌细胞水平上, 利用基因沉默技术降低 ELMO1 蛋白的表达能够抑制乳腺癌细胞迁移 趋化运动和侵袭能力 [5] 众多研究表明 IL 8 和 ELMO1 均与乳腺癌细胞的侵袭和转移密切相关, 而目前对于 ELMO1 在 IL 8 诱导的乳腺癌侵袭和转移中的作用尚未见报道 因此, 本实验利用小 RNA 干扰技术和过表达质粒分别下调和上调乳腺癌细胞中 ELMO1 蛋白的表达, 通过体外侵袭实验和趋化运动实验检测转染后 MDA MB 231 细胞和 MCF 7 细胞在 IL 8 诱导下的侵袭和运动能力的变化, 从而探讨 IL 8 及 ELMO1 在乳腺癌侵袭和转移中的作用及可能的分子机制 1 材料与方法 1.1 材料 主要试剂 β actin 购自北京中杉金桥生物技术有限公司 ; 兔抗 ELMO1 单抗购自武汉三鹰生物技术有限公司 ;RPMI1640 培养基购自上海拜力生物科技有限公司 ; 胎牛血清购自赛默飞世尔生物化学制品 ( 北京 ) 有限公司 ; 胰蛋白酶购自北京索莱宝公司 ; 彩色预染蛋白 P0068 购自上海碧云天公司 ; 无内毒素质粒中量提取试剂盒购自康为世纪 ;Lipo fectamine2000 脂质体转染试剂购自 Invitrogen 公司, 侵袭试验所用小室购自康宁公司, 基质胶 (Ma trigel) 购自碧迪医疗器械 ( 上海 ) 有限公司 1.2 方法 细胞培养乳腺癌细胞 MDA MB 231 和

2 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Oct;32(10) 1453 MCF 7 在含 10% FBS 的 RPMI1640 培养基,37, 5% CO 2 培养箱培养 细胞传代 3 次以上, 在对数生长期进行实验 细胞转染将细胞悬液均匀铺于 6 孔板中培养过夜, 细胞长到约 70%, 按照 Lipofectamine 2000 的使用说明书进行操作 用于转染的 ELMO1 特异性小 RNA 干扰质粒及过表达质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司构建 Westernblot 将培养的细胞裂解提取蛋白, 制备 SDS PAGE 凝胶, 用移液器加入等量所提各组蛋白, 电泳 转膜 封闭, 加入一抗 ELMO1(1 500) β actin(1 1000) 孵育过夜, 洗膜, 二抗 (1 5000) 孵育后显影, 曝光 趋化运动实验将对照细胞和经过处理的细胞分别重悬于 RPMI1640 培养液中, 细胞计数 ( L -1 ) 在趋化小室下层中加入趋化因子 IL 8, 含 10% FBS 的 RPMI1640 培养基 500μL, 将细胞悬液 200μL 加入上层中, 然后将趋化小室放入 37,5% CO 2 培养箱, 培养 24h 后, 将滤膜上层细胞用棉签擦去, 下室固定 洗涤并染色 高倍镜 (400 ) 下观察, 随机计数 3 个高倍镜视野下穿过人工基膜的细胞数, 每个实验重复 3 次, 取平均数作为实验结果 Transwel 细胞侵袭实验按文献操作 [6], 应用 8μm 滤膜 transwel 小室, 铺一层人工基质胶 (matrigel) 室温下干燥 将胰酶消化后重悬的各组细胞悬液 ( L -1 )200μL 分别加入小室上室中 下室加入 500μL 含 10% FBS 的 RPMI1640 培养基, 加入或不加入 100μg L -1 IL 8 37,5% CO 2 培养 24h 弃去培养基, 用棉签擦尽上室面的人工基质胶和细胞, 下室面固定染色 每孔随机取 5 个高倍镜 (400 ) 视野, 计数下室面的细胞数即为穿透人工基底膜的细胞数, 每个实验重复 3 次, 取平均数作为实验结果 1.3 统计学分析实验数据以 x±s 珋表示, 数据资料用 PASW 软件进行处理, 计量资料用独立样本 t 检验或单因素方差分析, 计数资料用卡方检验 P <0 05, 表示差异无统计学意义 2 结果 2.1 IL 8 刺激影响乳腺癌细胞 MDA MB 231 和 MCF 7 的趋化运动能力用 μg L -1 4 种不同剂量的 IL 8 刺激乳腺癌细胞 MDA MB 231 和 MCF 724h, 结果显示 : 在未用 IL 8 干预的情况下, 乳腺癌细胞 MDA MB 231 和 MCF 7 趋化运动能力较弱,IL 8 刺激后,2 种不同细胞的趋化运动能力 明显增加, 具有剂量依赖性 (Fig1) Fig1 ComparisonofIL 8inducedchemotaxis ofdiferentbreastcancercellines IL 8inducedtherobustchemotaxisofdiferentbreastcancercel lines(mda MB 231andMCF 7).Columnsmeanoftriplicatemeasure ments;bars,standarddeviation 2.2 人乳腺癌细胞 MDA MB 231 MCF 7 和正常乳腺上皮细胞 MCF 10A 中 ELMO1 蛋白的表达用 Westernblot 检测人正常乳腺上皮细胞 MCF 10A 和人乳腺癌细胞 MDA MB 231 和 MCF 7 中 ELMO1 的表达, 结果显示 :ELMO1 蛋白在人乳腺癌细胞 MDA MB 231 中高表达, 在正常乳腺上皮细胞 MCF 10A 和人乳腺癌细胞 MCF 7 中低表达 (Fig2) Fig2 ExpresionofELMO1inMCF 10Acels, MDA MB 231celsandMCF 7cels(Valuesrepresentgrayvalue) 2.3 转染后各组细胞中 ELMO1 蛋白的表达瞬时转染干扰质粒 72h 后,Westernblot 结果显示在 sielmo1/mda MB 231 细胞中 ELMO1 的表达明显低于 Scr/MDA MB 231 细胞和 MDA MB 231 细胞中的表达 转染过表达质粒 72h 后,Westernblot 结果显示在 MCF 7/ELMO1 细胞中 ELMO1 的表达明显高于 Scr/MCF 7 细胞中的表达 (Fig3) 2.4 ELMO1 对 IL 8 诱导的乳腺癌细胞 MDA MB 231 和 MCF 7 趋化运动能力的影响为了检测 ELMO1 表达改变对 IL 8 诱导的乳腺癌细胞迁移能力的影响, 我们进行了细胞趋化运动实验, 结果显示 : 在 IL 8(100μg L -1 ) 刺激下,siELMO1/MDA MB 231 细胞趋化运动能力与 MDA MB 231 细胞和

3 1454 中国药理学通报 Ch Ph m g Bu 0 1 6O 1 0 异有统计学意义 MCF ELMO1细胞的趋化运动 能力与 MCF 7细胞和 S MCF 7细胞相比明显增 强 P 0 01 差异有统计学意义 F g4 5 ELMO1对 I 8诱 导 的 乳 腺 癌 细 胞 7侵袭能力的影响 1和 MCF 肿瘤细胞向 细胞外基质的侵袭与细胞的迁移能力密切相关 肿 瘤细胞迁移能力的降低通常会导致细胞的侵袭能力 的降低 以上研究证明 I 8和 ELMO1可以调节乳 腺癌细胞的趋化运动能力 因此 我们通过基质胶 g 模拟体内细胞外基质 用 T w 小室 m 来检测乳腺癌细胞的侵袭能力 用 10 0μg L 1的 F g Ex p felmo1 f d V u p g yv u byw b A Ex p felmo1p 1 S I 8作为趋化因子吸引乳腺癌细胞穿透基质胶和滤 膜 结果显示 在 I 8 100μg L 1 刺激下 E 1 d ELMO1 1 B Ex p felmo1p MO1 1组穿过人工基底膜进入下室的 MCF 7 MCF C dmcf ELMO1 细胞 数 量 比 S 1组 明 显 减 少 P g5 MCF ELMO1 0 05 差异有统计学意义 F S 1细胞相比明显降低 P 0 0 1 差 组 穿 过 人 工 基 底 膜 进 入 下 室 的 细 胞 数 量 比 S F g4 Th h m x b yf hg up f d 1 dmcf 7 G m 4 0 0 A C mp f h m p w hi 8 mu 1 S 1 ds ELMO1 1 Th h m x d x S ELMO1 1d d mp dw hs 1 P 0 0 1 B C mp f h m p w hi 8 mu MCF 7 MCF C dmcf ELMO1 Th h m x d x MCF ELMO1 d mp dw hmcf C P 0 01 C S 1 4h D S ELMO1 1 4h E S 1 4 8h F S ELMO1 1 48h G MCF C 4h H MCF ELMO1 4h I MCF C 48h J MCF ELMO1 4 8h

4 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Oct;32(10) 1455 MCF 7 组明显增多 (P<0 05), 差异有统计学意义 (Fig5) Fig5 Invasionabilityofeachgrouptransfected MDA MB 231celsandMCF 7cels A:QuantificationIL 8inducedpenetratedcelswasperformedin Scr/MDA MB 231andSiELMO1/MDA MB 231celsbytranswelinva sionasay.thenumberofinvasivecelsinsielmo1/mda MB 231de creasedcomparedwithscr/mda MB 231. P<0 05(two wayano VA);B:QuantificationIL 8inducedpenetratedcelswasperformedin MCF 7/ConandMCF 7/ELMO1celsbytranswelinvasionasay.The numberofinvasivecelsinmcf 7/ELMO1 increasedcomparedwith MCF 7/Con. P<0 05(two wayanova) 3 讨论 尽管乳腺癌的治疗已经取得重大进展, 但转移仍是乳腺癌患者死亡的主要原因 [7], 因此抑制肿瘤细胞侵袭转移, 研究其转移机制, 设计靶向阻断药物对乳腺癌的进一步治疗至关重要 IL 8 具有促进肿瘤发生和血管生成的功能, 在许多人类癌症中表达增高, 对肿瘤的发生 发展和转移起重要作用 [8] [9] Deng 等构建含 IL 8 基因的重组腺病毒载体, 观察对乳腺癌细胞 BT549 增殖 细胞周期和迁移的影响 过表达 IL 8 促进 BT549 细胞迁移, 抑制细胞周期在 S 期的 DNA 复制, 而对 [10] BT549 细胞的增殖没有明显影响 Kim 等发现, 用 IL 8 处理后, 三阴性乳腺癌 ( 雌激素受体 ER 孕激素受体 PR 原癌基因 Her 2 均为阴性的乳腺癌 ) 细胞的侵袭性明显增强 本研究通过趋化运动实验检测 IL 8 对乳腺癌细胞运动能力的影响, 结果显示 : 在 IL 8 刺激下, 乳腺癌细胞 MDA MB 231 和 MCF 7 的运动能力增强, 具有剂量依赖性 结果提示 IL 8 与乳腺癌的侵袭转移相关 已有研究表明,ELMO1 可以促进乳腺癌细胞迁移 趋化运动和侵袭的能力, 基质细胞衍生因子 1 诱导的乳腺癌细胞肌动蛋白聚合和侵袭转移需要 ELMO1 的参与 [5] ELMO1 蛋白可以和胞质分裂作用因子 180(dedicatorofcytokinesis180,DOCK180) 形成复合体, 从而以鸟嘌呤核苷酸交换因子的角色发挥作用, 通过 G 蛋白偶联受体介导的通路来调控 Rac 蛋白从而促进肌动蛋白的聚合, 调控细胞迁移 趋化运动 侵袭和转移能力 [11-13] 本实验 Western blot 检测结果显示,ELMO1 蛋白在乳腺癌细胞 MDA MB 231 中的表达明显高于乳腺癌细胞 MCF 7 和人正常乳腺上皮细胞 MCF 10A 中的表达, 侵袭性强的 MDA MB 231 细胞中 ELMO1 蛋白表达高于侵袭性低的 MCF 7 细胞中表达 ; 降低 ELMO1 的表达, 抑制了 MDA MB 231 细胞的运动和侵袭能力, 上调 ELMO1 的表达增强了 MCF 7 细胞的运动和侵袭能力 结果提示 ELMO1 能够促进乳腺癌细胞的侵袭和转移 IL 8 依次激活 PI3K Akt 和 NF κb 通路, 增强非嗜荷尔蒙乳腺癌细胞的侵袭能力 [8] NF κb 通路参与了 PKC 信号诱导的乳腺癌中 IL 8 表达, 促进了乳腺癌细胞的迁移 [14] 本课题组前期研究发现 IL 8 激活 ELMO1 NF κb Snail 信号通路促进胶质瘤细胞的侵袭转移, 降低 ELMO1 的表达, 抑制了 IL 8 诱导的胶质瘤细胞迁移 [15] 但 IL 8 和 ELMO1 在乳腺癌侵袭转移中的关系尚不清楚, 我们因此提出假设,IL 8 通过 ELMO1 促进乳腺癌细胞的侵袭和转移, 本实验为研究 IL 8 和 ELMO1 在乳腺癌侵袭和转移中的相互关系, 采用小 RNA 干扰技术沉默乳腺癌细胞 MDA MB 231 中内源性 ELMO1 基因, 用过表达质粒上调乳腺癌细胞 MCF 7 中的内源性 EL MO1 基因,Westernblot 检测 SiELMO1/MDA MB 231 细胞组 ELMO1 蛋白的表达降低,MCF 7/EL MO1 细胞组 ELMO1 蛋白的表达增高 趋化运动和 Transwel 检测结果显示, 降低 ELMO1 的表达抑制了 IL 8 诱导的 MDA MB 231 细胞的运动和侵袭能力, 上调 ELMO1 的表达增强了 IL 8 诱导的 MCF 7

5 1456 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Oct;32(10) 细胞的运动和侵袭能力 以上结果提示,IL 8 促进乳腺癌侵袭和转移是通过 ELMO1 实现的 综上所述, 本实验研究证实 ELMO1 在乳腺癌细胞 MDA MB 231 中高表达,IL 8 通过 ELMO1 促进乳腺癌细胞的侵袭和转移 因此, 通过减少 EL MO1 的表达降低 IL 8 对乳腺癌的影响, 可以成为抑制乳腺癌侵袭转移的新的治疗方向 参考文献 : [1] 田红艳, 陈萍萍, 李笑, 等.Gab2 通过 PI3K/Akt/ARK5/ MMP 途径影响乳腺癌的侵袭和转移 [J]. 中国药理学通报, 2015,31(7): [1] TianHY,ChenPP,LiX,etal.Gab2efectstheinvasionand metastasisofbreastcarcinomathroughpi3k/akt/ark5/mmpsig nalpathway[j].chinpharmacolbul,2015,31(7): [2] SnousiK,MahfoudhW,BouaouinaN,etal.Combinedefectsof IL 8andCXCR2genepolymorphismsonbreastcancersuscepti bilityandaggresivenes[j].bmccancer,2010,10:283. [3] ZuccariDA,LeonelC,CastroR,etal.Animmunohistochemical studyofinterleukin 8(IL 8)inbreastcancer[J].ActaHisto chem,2012,114(6): [4] MargaronY,FradetN,CoteJF.ELMOrecruitsactincros link ingfamily7(acf7)atthecelmembraneformicrotubulecapture andstabilizationofcelularprotrusions[j].jbiolchem,2013, 288(2): [5] LiH,YangL,FuH,etal.AsociationbetweenGɑi2andEL MO1/Dock180connectschemokinesignalingwithRacactivation andmetastasis[j].natcommun,2013,4:1706. [6] SongJ,WangX,ZhuJ,etal.Rapamycincausesgrowtharest andinhibitionofinvasioninhumanchondrosarcomacels[j].j BUON,2016,21(1): [7] BilR,ChristoforiG.TherelevanceofEMTinbreastcancerme tastasis:corelationorcausality?[j].febslet,2015,589 (14): [8] ShaoN,LuZ,ZhangY,etal.Interleukin 8upregulatesintergrin β3 expresion and promotesestrogen receptor negative breast cancercelinvasionbyactivaingthepi3k/akt/nf κb?pathway [J].CancerLet,2015,364(2): [9] DengF,WangJ,FanM,etal.OverexpresionofIL 8promotes migrationofbt549breastcancercels[j].xibaoyufenzimi anyixuezazhi,2016,32(5): [10]KimS,LeeJ,JeonM,etal.MEK dependentil 8inductionreg ulatestheinvasivenesoftriple negativebreastcancercels[j]. TumourBiol,2016,37(4): [11] PatelM,PeletierA,CoteJF.OpeninguponELMOregulation: NewinsightsintothecontrolofRacsignalingbytheDOCK180/ ELMOcomplex[J].SmalGTPases,2011,2(5): [12] SevajolM,ReiserJB,ChouquetA,etal.TheC terminal polyproline containingregionofelmocontributestoanincrease inthelife timeoftheelmo DOCK complex[j].biochimie, 2012,94(3): [13] PatelM,ChiangTC,TranV,etal.TheArffamilyGTPase Arl4AcomplexeswithELMOproteinstopromoteactincytoskele tonremodelingandrevealsaversatileras bindingdomaininthe ELMOproteinsfamily[J].JBiolChem,2011,286(45): [14]ChouW Y,ChuangK H,SunD,etal.InhibitionofPKC in ducedcox 2andIL 8expresioninhumanbreastcancercelsby glucosamine[j].jcelphysiol,2015,230(9): [15]ZhangB,ShiL,LuS,etal.AutocrineIL 8promotesF actinpol ymerizationandmediatemesenchymaltransitionviaelmo1 NF κb Snailsignalinginglioma[J].CancerBiolTher,2015,16(6): ImportantroleofELMO1ininvasionand migrationofbreastcancercelsinducedbyil 8 ZHANGChang jie 1,XUXin wei 1,LIHong li 2,LIUYu qing 1,YINChong gao 3 (1.DeptofPathology,2.MedicineResearchCenter, 3.CologeofNursing,WeifangMedicalUniversity,WeifangShandong ,China) Abstract:Aim Toexploretherelationshipbetween IL 8andELMO1inbreastcarcinomaandthemecha nismsofil 8inducedinvasionandmetastasis.Meth ods UndertheIL 8stimulation,chemotaxisasay wasexaminedtodetectthechemotaxisabilityofbreast cancercellinemda MB 231andMCF 7.ELMO1 proteinlevelsinbreastcancercellinesweredetected usingwesternblot.mda MB 231celsweretransfect edwithsmalrna interferenceplasmidsinorderto downregulateelmo1expresion,andoverexpresion plasmidswereusedtoupregulatetheexpresionofel MO1 in MCF 7 cels. Matrigelinvasion asayand chemotaxisasaywereusedtodetecttheinvitroinva sionandchemotaxisabilityofbreastcancercelswith IL 8stimulation.Results IL 8inducedchemotaxisof thediferentbreastcancercellinesinadose depend entmanner.aftertransienttransfection,westernblot resultsshowedthatelmo1proteinlevelsobservably

6 decreasedinsielmo1/mda MB 231celscompared withscr/mda MB 231cels,whiletheexpresionof ELMO1proteinlevelssignificantlyincreasedinMCF 7/ELMO1celscomparedwiththeMCF 7/Concels; withil 8stimulation,SiELMO1/MDA MB 231cels showedsignificantlydecreasedchemotaxisabilitycom paredwithscr/mda MB 231cels.MCF 7/ELMO1 celsshowedsignificantlyincreasedchemotaxisability comparedwithmcf 7/Concels;theinvasionasay showedunderthestimulationofil 8,andtheinvasion abilitywassignificantlyreducedinsielmo1/mda MB 231celscomparedwithScr/MDA MB 231cels (P<0 05).Theinvasionabilitywassignificantlyen hancedinmcf 7/ELMO1celscomparedwithMCF 7 cels(p<0 05).Conclusion IL 8promotesthein vasionandmigrationofbreastcancercelsmda MB 231andMCF 7,andELMO1playsanimportantrole inil 8inducedchemotaxisandinvasion. Keywords:breastcancer;interleukin 8;engulfment andcelmotilityprotein1(elmo1);migration;me tastasis;chemotacticmovement

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

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