第 3 期罗旋, 等. 脂多糖对甲状腺上皮细胞增殖吞噬及胞内活性氧产生的影响 223 ulationoftheproliferation,phagocytosisandthelevelofintracelularrosoftfcs,suggestingthatlps mayplayanimpor

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阿宣
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1 第 28 卷第 3 期 2018 年 5 月江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.28 No.3 May2018 脂多糖对甲状腺上皮细胞增殖吞噬及胞内活性氧产生的影响罗旋, 牟笑, 郑婷婷, 董昕, 刘宝翠, 毛朝明 ( 江苏大学附属医院核医学科, 江苏镇江 ) [ 摘要 ] 目的 : 研究脂多糖 (lipopolysaccharides,lps) 对甲状腺上皮细胞 (thyroidfolicularcels,tfcs) 的增殖凋亡吞噬和胞内活性氧产生的影响, 探讨脂多糖对 TFCs 的病理损伤作用方法 : 用 ng ml -1 的脂多糖作用 TFCs 系 Nthy ori3 1 细胞 48h 及 100ng ml -1 的脂多糖作用 Nthy ori3 1 细胞 24h 和 48h,MTT 法检测各组细胞的增殖 ; 流式细胞术检测 100ng ml -1 脂多糖作用 Nthy ori3 1 细胞 48h 时的凋亡率荧光微球摄入法检测 ng ml -1 脂多糖作用 12h 后 Nthy ori3 1 细胞的吞噬功能 ; 荧光探针 DCFH DA 法检测 ng ml -1 脂多糖作用 4h 后 Nthy ori3 1 细胞胞内活性氧水平结果 : 与未处理组比较,100ng ml -1 脂多糖明显促进 Nthy ori3 1 细胞的增殖和提高胞内活性氧的水平 (P<0.01),20ng ml -1 和 100ng ml -1 脂多糖促进 Nthy ori3 1 细胞的吞噬功能 (P<0.01 和 P<0.05), 而 100ng ml -1 脂多糖对 Nthy ori3 1 细胞凋亡的影响无统计学意义 (P>0.05) 结论 : 脂多糖通过促进 TFCs 增殖上调吞噬功能和提高胞内活性氧水平, 发挥对 TFCs 的病理损伤作用, 提示脂多糖对桥本甲状腺炎的发生可能有重要作用 [ 关键词 ] 甲状腺上皮细胞 ; 吞噬 ; 脂多糖 ; 活性氧 [ 中图分类号 ] R581.4 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2018) DOI: /j.isn y [ 引用格式 ] 罗旋, 牟笑, 郑婷婷, 等. 脂多糖对甲状腺上皮细胞增殖吞噬及胞内活性氧产生的影响 [J]. 江苏大学学报 ( 医学版 ),2018,28(3): EfectsofLPSontheproliferation,phagocytosisandROS productioninthyroidfolicularcelsinvitro LUOXuan,MOUXiao,ZHENGTing ting,dongxin,liubao cui,maochao ming (DepartmentofNuclearMedicine,theAfiliatedHospitalofJiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212001,China) [Abstract] Objective:Toinvestigatetheefectoflipopolysaccharide(LPS)ontheproliferation,apop tosis,phagocytosisandreactiveoxygenspecies(ros)productioninthyroidfolicularcels(tfcs)in vitro,andtodeterminethepathologicdamageoftfcsinresponsetolps.methods:nthy ori3 1cels wereincubatedwithgradientconcentrationsof0,10,20,100,150ng ml -1 LPSfor48handwith 100ng ml -1 for24hor48h,mttasaywasusedtomeasurecelproliferation.nthy ori3 1cels weretreatedwith100ng ml -1 LPSfor48h,andflowcytometrywasusedtomeasurecelapoptosis. Nthy ori3 1celswereincubatedwithgradientconcentrationsof0,10,20,100ng ml -1 LPSfor12 h,andnileredfluorescentfluospheresbeadsuptakemethodwasusedtomeasurephagocytosisofcels. Nthy ori3 1celsweretreatedwithgradientconcentrationsof0,10,20,100ng ml -1 LPSfor4h, andfluorescentprobedcfh DAwasusedtomeasureROSlevelofcels.Results:Comparedwithcon trols,100ng ml -1 LPSpromotedtheproliferationandsignificantlyincreasedthelevelofROSofNthy ori3 1cels(P<0.01).Inaddition,20ng ml -1 and100ng ml -1 LPSpromotedthephagocytic functionofnthy ori3 1cels(P<0.01).However,100ng ml -1 LPSdidnotincreasetheapoptosisof Nthy ori3 1cels(P>0.05).Conclusion:LPSpromotedthepathologicdamageofTFCsthroughup reg [ 基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 ( ) [ 作者简介 ] 罗旋 (1989 ), 女, 硕士研究生 ; 毛朝明 ( 通讯作者 ), 副教授, 主任技师, 硕士生导师,E mail:jq1001@ujs.edu.cn

2 第 3 期罗旋, 等. 脂多糖对甲状腺上皮细胞增殖吞噬及胞内活性氧产生的影响 223 ulationoftheproliferation,phagocytosisandthelevelofintracelularrosoftfcs,suggestingthatlps mayplayanimportantroleinthedevelopmentofhashimoto sthyroiditis. [Keywords] thyroidfolicularcels;phagocytosis;lipopolysaccharide;reactiveoxygenspecies 桥本甲状腺炎是一种常见的器官特异性自身免疫性疾病, 主要特点是甲状腺特异性 T 淋巴细胞和其他免疫细胞大量浸润甲状腺组织, 以及甲状腺上皮细胞 (thyroidfolicularcels,tfcs) 的破坏, 最终导致甲状腺功能减退 [1] 近年来研究表明, 该病的发生与遗传吸烟过量碘的摄入及感染等有密切的关系 [2-6] 脂多糖是革兰阴性细菌细胞壁的主要致病成分, 可以诱发多种炎性反应已有实验证明脂多糖可以破坏 T B 淋巴细胞对鼠甲状腺免疫蛋白的耐受进而促进桥本甲状腺炎的发生 [7-8], 但是确切的机制尚不清楚本研究分析脂多糖对 TFCs 的增殖凋亡吞噬及胞内活性氧产生的影响, 探讨脂多糖在桥本甲状腺炎发病中的作用 1 材料与方法 1.1 材料 TFCs 系 Nthy ori3 1 细胞购于 ECACC 细胞中心胎牛血清 RPMI 1640 培养基 (Gibco 公司 ) 脂多糖 (Sigma 公司 ), 荧光微球 (nileredfluorescent FluoSpheres beads) 为 BD 公司产品,MTT( 上海碧云天生物公司 ),AnnexinVAlexaFluor647/PI 凋亡检测试剂盒 ( 南京福麦斯生物公司 ) 1.2 方法细胞培养 Nthy ori3 1 细胞用含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基 ( 含 100μg L -1 链霉素 100IU L -1 青霉素 ), 置于 37 5% CO 2 的培养箱培养 MTT 法检测 Nthy ori3 1 细胞增殖活性将处于对数生长期的 Nthy ori3 1 细胞以每孔个接种于 96 孔板中, 每组设 5 个复孔, 每孔加入 200μL 含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基 ( 含 100μg L -1 链霉素 100IU ml -1 青霉素 ), 置于 5% CO 2 培养箱培养第 2 天, 浓度梯度组分别加入 ng ml -1 的脂多糖处理 Nthy ori 3 1 细胞 48h; 时间梯度组加入 100ng ml -1 的脂多糖分别处理 Nthy ori3 1 细胞 24h 和 48h 处理结束后, 弃去上清液, 每孔加入终浓度为 0.5mg L -1 的 MTT 培养基 100μL, 置于 5% CO 2 培养箱孵育 4h 弃去上清液, 每孔加入 100μLDMSO 振荡 5~10min, 使结晶充分溶解用酶联免疫分析仪 (EXL800) 测定 490nm 波长各孔光密度 (D) 值每组实验重复 3 次, 计算细胞增殖率, 细胞增殖率 (%)=D 实验组 /D 对照组 100% 流式细胞术检测 Nthy ori3 1 细胞的凋亡根据细胞增殖的实验结果, 选择 100ng ml -1 的脂多糖处理 Nthy ori3 1 细胞 48h, 无 EDTA 的胰酶消化收集细胞,250 g, 离心 5min 用 100μL 缓存液悬浮细胞, 加入 5μLAnnexinVAlexaFluor647 和 10 μl20μg ml -1 的 PI 溶液, 混匀室温避光孵育 15 min 孵育结束后, 加 400μLPBS 混匀, 流式细胞仪检测分析荧光微球摄入实验评估 Nthy ori3 1 细胞的吞噬功能实验前 1 天将 Nthy ori3 1 细胞以个 / 孔接种于 6 孔板中, 每孔加入 2mL 含 0.5% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基 ( 含 100μg L -1 链霉素 100IU ml -1 青霉素 ), 再分别加入 ng ml -1 脂多糖, 随后将 6 孔板置于 5% CO 2 培养箱培养 12h 后, 每孔加入荧光微球 4μL( 终浓度为个 /ml), 置于 5% CO 2 培养箱孵育 4h 后,PBS 洗 3 遍, 收集细胞, 流式细胞仪检测荧光强度荧光探针 DCFH DA 法检测 Nthy ori3 1 胞内活性氧的水平将 Nthy ori3 1 细胞以个 / 孔接种于 6 孔板中, 每孔加入 2mL 含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基 ( 含 100μg L -1 链霉素 100IU ml -1 青霉素 ), 将 6 孔板置于 5%CO 2 培养箱培养过夜第 2 天, 分别加入 ng ml -1 脂多糖,4h 后每孔加入终浓度为 10μmol L -1 的 DCFH DA 无血清 RPMI 1640 培养基 1mL,37 培养箱孵育 20min 用无血清 RPMI 1640 培养基洗涤细胞 3 次收集细胞, 立即用流式细胞仪检测 1.3 统计学分析应用 GraphPadPrism6.0 软件进行统计学分析, 数据用均数 ± 标准差 ( x±s) 珋表示, 多组比较采用单因素方差分析, 两两比较采用 Dunnet t 检验, 两组比较采用配对 t 检验,P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 脂多糖促进 Nthy ori3 1 细胞的增殖用 ng ml -1 脂多糖分别作

3 江苏大学学报医学版２２４用Ｎｔ１细胞４８后ＭＴＴ检测结果显示与ｎｇｍｌ脂多糖对照组比较各处理组Ｎｔ第２８卷胞凋亡率降低但差异无统计学意义ｔ１６９７Ｐ５图２１细胞的增殖率明显增加Ｆ１１４３Ｐ１图１Ａ在１ｎｇｍｌ脂多糖作用时增殖明显ｔ５１１５Ｐ１且在１ｎｇｍｌ浓度范围内呈现一定的剂量依赖性用１ｎｇｍｌ脂多糖分别作用Ｎｔ１细胞２４和４８后与对照组相比细胞增殖明显Ｆ１６２５Ｐ１图１Ｂ其中以４８时尤甚ｔ７１Ｐ１２２脂多糖对Ｎｔ１细胞凋亡无明显影响用１ｎｇｍｌ脂多糖作用Ｎｔ１细胞４８后流式细胞术检测结果显示与ｎｇｍｌ脂多糖对照组比较１ｎｇｍｌ脂多糖处理组细Ａ脂多糖作用细胞４８Ｂ１ｎｇｍｌ脂多糖处理细胞２４和４８ａＰ１与ｎｇｍｌ组比较ｂＰ５ｃＰ１与组比较图１ＭＴＴ法检测脂多糖处理后Ｎｔ１细胞的增殖率图２流式细胞术检测脂多糖对Ｎｔ１细胞凋亡的影响２３脂多糖促进Ｎｔ１细胞的吞噬功能荧光微球摄入实验结果表明用１２１１细ｎｇｍｌ脂多糖分别作用１２后Ｎｔ胞的吞噬率明显高于ｎｇｍｌ脂多糖对照组Ｆ１２１Ｐ１图３在脂多糖２ｎｇｍｌ时达到最高峰ｔ２９４４Ｐ１提示脂多糖能促进Ｎｔ１细胞的吞噬且呈一定的剂量依赖性ａＰ１ｂＰ５与ｎｇｍｌ脂多糖比较图３荧光微球摄入实验评价脂多糖对Ｎｔ１细胞吞噬功能的影响

4 第 3 期罗旋, 等. 脂多糖对甲状腺上皮细胞增殖吞噬及胞内活性氧产生的影响脂多糖促进 Nthy ori3 1 细胞活性氧的产生用活性氧检测探针 DCFH DA 的平均荧光强度 (MFI) 反映 Nthy ori3 1 胞内活性氧的水平结果如图 4 所示, ng ml -1 脂多糖作用 4h 后,Nthy ori3 1 细胞胞内活性氧水平明显高于 0 ng ml -1 脂多糖对照组 (F=21.67,P<0.01), 其中以 100ng ml -1 脂多糖时最为明显 (t=10.65, P<0.01), 显示胞内活性氧水平明显上升 a:p<0.01, 与 0ng ml -1 脂多糖比较图 4 脂多糖对 Nthy ori3 1 细胞胞内活性氧水平的影响 3 讨论桥本甲状腺炎是一种多因素诱导的自身免疫紊乱性疾病, 机体针对自身抗原发生免疫应答, 大量的淋巴细胞浸润甲状腺组织, 导致甲状腺功能受损, 甲状腺肿大纤维化最终导致甲状腺功能减退 [9-10] TFCs 是构成甲状腺组织的主要细胞, 感染和过量碘的摄入可以诱导 TFCs 表达 MHCⅡ, 使其变成抗原提呈细胞, 促进桥本甲状腺炎的发生发展 [11-12] 研究表明脂多糖可以促进 na vecd4 + T 细胞向针对甲状腺抗原的特异性 Th17 细胞分化, 导致 TFCs 的免疫损伤, 从而参与桥本甲状腺炎的发病过程 [13-14] 本研究通过体外实验研究脂多糖对 TFCs 的增殖吞噬和胞内活性氧产生能力的影响, 探讨脂多糖在桥本甲状腺炎发病过程中的作用细胞增殖在一定程度上是细胞分化为多种功能表型的前提和基础在桥本甲状腺炎的发病过程中,TFCs 增殖能力的变化与发病密切相关我们的实验证明在 100ng ml -1 浓度范围内脂多糖能够促进 TFCs 的增殖, 对 TFCs 的凋亡无显著影响这与脂多糖对免疫细胞等的促凋亡作用是不一致的已有报道 [15], 脂多糖可以活化肝癌细胞表面的 TLR4 受体信号通路, 促进肝癌细胞的生存和增殖出现两种相反结论的原因可能与不同的细胞类型和不同的脂多糖作用浓度等因素相关高等动物的吞噬细胞通过吞噬作用, 摄取和消灭感染的细菌, 病毒以及损伤衰老的细胞, 是机体免受外来感染的第一道防线 [16-17] 脂多糖可以增强单核巨噬细胞的吞噬能力 [18-19], 然而脂多糖对正常上皮细胞的吞噬功能的影响却少有研究本研究用荧光微球摄入法结合流式细胞术评价脂多糖对 TFCs 吞噬功能的影响, 结果表明脂多糖能够增强 TFCs 的吞噬功能, 提示在炎症介质介导下 TFCs 参与了炎症局灶部位的炎症反应然而脂多糖促进 TFCs 吞噬功能的机制尚需进一步探讨活性氧是超氧阴离子过氧化氢羟自由基一氧化氮等一类具有很高生物活性的含氧化合物的总称, 参与细胞的增殖凋亡免疫及抗微生物等过程 [20-21] 大量研究表明脂多糖能诱导巨噬细胞及上皮细胞产生大量的活性氧等炎性介质, 进而加重局部炎性反应 [22] 我们的研究结果显示,100ng/ ml 脂多糖作用 4h 能明显提高 TFCs 胞内活性氧的水平, 从而加剧细胞的自身损伤, 有助于桥本甲状腺炎的炎症反应和疾病发展综上所述, 脂多糖通过促进 TFCs 增殖上调 TFCs 的吞噬活性和提高胞内活性氧水平从而促进桥本甲状腺炎的炎症反应过程, 显示了脂多糖在桥本甲状腺炎发生发展中的重要致病作用 [ 参考文献 ] [1] WeetmanAP.Autoimmunethyroiddisease:propagation andprogresion[j].eurjendocrinol,2003,148(1): 1-9. [2] CarléA,BülowPedersenI,KnudsenN,etal.Smoking cesationisfolowedbyasharpbuttransientriseinthe incidenceofovertautoimmunehypothyroidism apopu

5 226 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 28 卷 lation based,case controlstudy[j].clinendocrinol (Oxf),2012,77(5): [3] LuoY,KawashimaA,IshidoY,etal.Iodineexcesas anenvironmentalriskfactorforautoimmunethyroiddis ease[j].intjmolsci,2014,15(7): [4] McLeodDS,CaturegliP,CooperDS,etal.Variation inratesofautoimmunethyroiddiseasebyrace/ethnicity inusmilitarypersonnel[j].jama,2014,311(15): [5] XuC,WuF,MaoC,etal.Excesiodinepromotesap optosisofthyroidfolicularepithelialcelsbyinducing autophagysuppresionandisasociatedwithhashimoto thyroiditisdisease[j].jautoimmun,2016,75: [6] CaseliE,ZateliMC,RizoR,etal.Virologicand immunologicevidencesupportinganasociationbetween HHV 6andHashimoto sthyroiditis[j].plospathog, 2012,8(10):e [7] EsquivelPS,RoseNR,KongYC,etal.Inductionof autoimmunityin good and poorrespondermicewith mousethyroglobulinandlipopolysaccharide[j].jexp Med,1977,145(5): [8] FlynnJC,MerouehC,SnowerDP,etal.Depletionof CD4 + CD25 + regulatorytcelsexacerbatessodium io dide inducedexperimentalautoimmunethyroiditisinhu manleucocyteantigendr3transgenicclasⅡ knock out non obesediabeticmice[j].clinexpimmunol,2007, 147(3): [9] AntoneliA,FerariSM,CoradoA,etal.Autoim munethyroiddisorders[j].autoimmunrev,2015,14 (2): [10] StasiG,DeMariaR.Autoimmunethyroiddisease: newmodelsofceldeathinautoimmunity[j].natrev Immunol,2002,2(3): [11] ZhengT,XuC,MaoC,etal.Increasedinterleukin 23 inhashimoto sthyroiditisdiseaseinducesautophagy suppresionandreactiveoxygenspeciesaccumulation [J].FrontImmunol,2018,9:96. [12] KosticI,TofoletoB,FontaniniE,etal.Influenceof iodideexcesandinterferon γonhumanprimarythyroid celproliferation,thyroglobulinsecretion,andintracel lularadhesionmolecule 1andhumanleukocyteantigen DRexpresion[J].Thyroid,2009,19(3): [13] KristensenB,HegedusL,MadsenHO,etal.Altered balancebetweenself reactivethelper(th)17celsand Th10celsandbetweenful lengthforkheadboxprotein 3(FoxP3) andfoxp3splicevariantsinhashimoto s thyroiditis[j].clinexpimmunol,2015,180(1): [14] McAleerJP,LiuB,LiZ,etal.PotentintestinalTh17 primingthroughperipherallipopolysaccharide basedim munization[j].jleukocbiol,2010,88(1): [15] WangL,ZhuR,HuangZ,etal.Lipopolysaccharide inducedtol likereceptor4signalingincancercelspro motescelsurvivalandproliferationinhepatocelular carcinoma[j].digdissci,2013,58(8): [16] ThomasCA,LiY,KodamaT,etal.Protectionfromle thalgram positiveinfectionbymacrophagescavengerre ceptor dependentphagocytosis[j].jexpmed,2000, 191(1): [17] BiWJ,LiDX,XuYH,etal.ScavengerreceptorB protectsshrimpfrombacteriabyenhancingphagocytosis andregulatingexpresionofantimicrobialpeptides[j]. DevCompImmunol,2015,51(1): [18] KobayashiY,InagawaH,KohchiC,etal.Lipopo lysaccharidesderivedfrompantoeaagglomeranscanpro motethephagocyticactivityofamyloidβinmousemi croglialcels[j].anticancerres,2017,37(7): [19] ZhouJ,TaiG,LiuH,etal.ActivinAdown regulates thephagocytosisoflipopolysaccharide activatedmouse peritonealmacrophagesinvitroandinvivo[j].celim munol,2009,255(1/2): [20] KiselyovK,Jennigs JJr,RbaibiY,etal.Autoph agy,mitochondriaandceldeathinlysosomalstorage diseases[j].autophagy,2007,3(3): [21] InoueM,SatoEF,NishikawaM,etal.Mitochondrial generationofreactiveoxygenspeciesanditsroleinaero biclife[j].curmedchem,2003,10(23): [22] FanJ,FreyRS,MalikAB,etal.TLR4signalingin ducestlr2expresioninendothelialcelsvianeutro philnadph oxidase[j].jclininvest,2003,112 (8): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 何承志

9.1.乳房炎

9.1.乳房炎 1. 1 3 4 5 -- -- 1 3 2 3,, 3 4 2. : 1 2 3 4 6~12h 2 1~2d (1) 15~18 7~15b 70% 2%~5% 2 3 2. 1 2 3. 3-7d 3-4 ( ) 1 2 3% 2 3 2% 1% 2 3 3 5 10mg 10% 4. (1) (2) (3) (4) (5) (1) (2) 3

第 3 期 罗旋, 等. 脂多糖对甲状腺上皮细胞增殖 吞噬及胞内活性氧产生的影响 223 ulationoftheproliferation,phagocytosisandthelevelofintracelularrosoftfcs,suggestingthatlps mayplayanimpor

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