# $ 234# #& 列腺癌组织和细胞中的表达观察在前列腺癌细胞株中过表达 %% 对前列腺癌细胞凋亡的影响并研究此过程细胞中一些凋亡相关蛋白的表达情况材料与方法材料 %% 和随机对照序列广州市锐博生物科技有限公司人前列腺永生化上皮细胞 6, 以及人前列腺癌细胞系 6<3%/ 和中国武

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缎魄莫
5 years ago
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1 现代泌尿外科杂志 #& 年月第 # 卷第期 #/ 基础研究微小核糖核酸对前列腺癌细胞凋亡的影响李森茂李昂胡嘏余羉王少刚叶章群华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科湖北武汉 %&&& #%#$$$&# #& # <+33*+ %&&& *## %%%%# ### # +#+#% %# %%##%### %#% # + ### ## ### %#+##+## 2#$# %%##+#%#4#%#&%&&//&/&& # #&&/# %%+#+%/,+# 2#&$&&$#&#%&&&%&&&%&& ## &B&/## +%/#%# %B#&/$#$&# &## ### #%#&&/%##&&/2#$## # # %## +##+##%%+%/# ##&&/ 3%%%## # #$%# # +, - # ## 摘要目的探究微小 --%% 在前列腺癌中的表达及其对前列腺癌细胞凋亡的影响方法对前列腺细胞系作不同处理阴性对照组转染随机序列和实验组转染 %% 采用实时荧光定量聚合酶链反应 6 检测前列腺癌组织及细胞中 %% 的表达流式细胞术测定不同转染组细胞凋亡情况检测各处理组细胞中凋亡相关蛋白 # 及 * 的表达结果 6 结果显示 %% 信使 - 水平在前列腺癌组织与癌旁组织比较表达下降 &%&&//&/&& 差异有统计学意义 &&/%% 信使 - 水平在前列腺癌细胞系 6 和 <3%/ 中较 6, 细胞中表达也明显下调 &$&&$#&#%&&&%&& 差异有统计学意义 &B&/ 流式细胞术检测细胞凋亡显示对照组和实验组中 6 细胞的凋亡率分别为 %#&/$#$ 与对照组相比差异有统计学意义 *%#&&/<3%/ 细胞的凋亡率分别为 &#&# 与对照组相比差异有统计学意义 *%##&&/ 检测结果验证了不同处理组 6 和 <3%/ 细胞中 # 蛋白表达下降而及 * 表达上调差异具有统计学意义 &&/ 结论 %% 可能通过下调 # 蛋白的表达发挥诱导前列腺癌细胞凋亡的作用关键词微小 - 前列腺癌凋亡中图分类号文献标志码 - &$&&##&&&/ 微小 -- 是一种进化上保守的内源性的小非编码 - 主要通过靶向结合 3 调收稿日期 #&&&/ 修回日期 #&&## 基金项目国家自然科学基金 &#####& #& 年度湖北省卫生计生委面上项目 2#&& 通信作者李昂住院医师,#$ 作者简介李森茂男汉族硕士在读研究方向泌尿及生殖系肿瘤,$#$ 节 - 的稳定性和蛋白的翻译来发挥作用在过去的十几年里很多体内和体外的实验研究已经证 # 明 - 在肿瘤的发生发展中起关键作用有些 - 已被提出作为癌症治疗的新型潜在靶标目前为止有研究表明 %% 在多种肿瘤中呈现较低表达包括肝癌胃癌等能够抑制肿瘤细胞增 %/ 殖侵袭和转移本实验旨在探究 %% 在前

2 # $ 234# #& 列腺癌组织和细胞中的表达观察在前列腺癌细胞株中过表达 %% 对前列腺癌细胞凋亡的影响并研究此过程细胞中一些凋亡相关蛋白的表达情况材料与方法材料 %% 和随机对照序列广州市锐博生物科技有限公司人前列腺永生化上皮细胞 6, 以及人前列腺癌细胞系 6<3%/ 和中国武汉典型培养物保藏中心胎牛血清, 无血清培养基 6 :$%& 培养基 ; 无血清培养基美国 7: 公司 + --@ 转染试剂溴化丙啶 6: 美国 :* 公司 6 引物合成 - -6 ; 广州复能基因公司 - 蛋白浓度测定试剂盒上海碧云天生物技术有限公司一抗鼠抗淋巴细胞瘤白血病 # 基因 # 一抗兔抗 # 天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶美国 -+ 公司激活型天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶 * 美国公司一抗鼠抗肌动蛋白辣根过氧化物酶标记的二抗羊抗小鼠 :7 辣根过氧化物酶标记的二抗羊抗兔 :7 武汉博士德公司超敏, 发光试剂盒美国公司聚偏二氟乙烯 *+64< 膜 - 酶 - 美国公司凯基细胞凋亡检测试剂盒江苏凯基生物股份有限公司活细胞荧光实时法检测试剂盒江苏凯基生物股份有限公司组织样本及细胞培养前列腺癌组织标本及相应癌旁组织标本均取于本院泌尿外科进行前列腺癌根治切除术患者的术后组织切取标本均获得医院伦理委员会同意并且提前向患者本人签署知情同意组织手术切除后经具较高资格医师指导下分辨出癌组织和癌旁组织并分别切取较小直径组织块数秒内装入预先做好标记的冻存管随即放入液氮速冻置于 9& 超低温冰箱存留备用人前列腺永生化上皮细胞 6, 于含 &&/ 牛垂体提取物 *6, 及 / 人重组表皮生长因子 +,7 的 ; 无血清培养基中培养人前列腺癌细胞系 6<3%/ 细胞用含 & 胎牛血清的 6 :$%& 培养基在 / # 孵育箱中培养序列的选择和细胞转染是一组已知的缺少人类基因重要同源性的 - 正义链 /J J 反义链 /J J%% 的序列为 J /J 取对数生长期的细胞接种于 $ 孔细胞培养板转染时细胞融合度约为 $& 根据对前列腺癌细胞的不同处理分为 # 组阴性对照组转染实验组转染 %% 接种板 # 后采用转染试剂 + --@ 进行转染实验保证 - 或 - 的终浓度为 /#% 后观察细胞状态并及时更换含血清培养基总的提取和 * 分析将转染 # 后收集的细胞以及在液氮中研磨成粉末的组织置于 B/ 的离心管中利用法提取细胞和组织中总 - 然后分析细胞和组织中 %% 的表达水平 <- 合成参照广州复能基因 - -6 ; 试剂盒说明操作反应条件为预变性 / & 个循环 6 扩增共 %& 个循环每个循环包括变性 / & 退火 $& #& 延伸 # #& 荧光实时定量 6 仪进行上述实时定量 6 反应及检测 3$- 作为内参结果数据采用 # 9 方法分析流式细胞术检测细胞凋亡转染 # 后离心收集细胞弃培养基用冷 6 洗涤细胞两次 #&&& 离心时间 / 收集细胞用 #&& 缓冲液悬浮细胞然后分别加入 / - 4 : 和 /6: 轻轻混匀后于 # 避光条件下孵育 & 在内用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况总蛋白的提取和 -##&: 实验转染后 # 收集细胞用于蛋白表达的分析用磷酸盐缓冲液 +6 洗 # 遍弃上清加入含有蛋白酶抑制剂 ++ 6 的 :6- 裂解液置于冰上 % 裂解 & #&&& 离心 / 收集上清用 - 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度每个样本加 #/ 蛋白至 <6-7, 胶进行电泳使用 64< 膜转膜后用含 / 牛血清白蛋白的溶液室温封闭后分别与一抗鼠抗 #&&& 兔抗 &&& 兔抗 &&& 兔抗 * &&& 鼠抗 -/&&% 孵育过夜第 # 天采用羊抗鼠的二抗 /&&& 羊抗兔的二抗 /&&& 孵育使用, 曝光显影 *$# 活细胞荧光时实法检测细胞凋亡情况转染细胞 # 后用新鲜的培养基轻轻洗涤细

3 现代泌尿外科杂志年 < 月第 < 卷第 < 期 :K 胞 < 次%最后加入 %N 新鲜培养基%加入 *N # <K 检测液% <K M 避光孵育<%= 1%然后荧光分别为$ 7@:V GG&$ ;G:V <;&#%=9 77; 在前列腺癌组织中的表达明显降低%与癌旁组织中表显微镜下观察并拍照计数分析结果* 达相比较%差异有统计学意义$ # G&* 检测前列腺上皮细胞株 9_TD : 和 TS< `Q:7G N1# 前列 $, P 统计学方法采用 FTFF:@, 统计软件处理实验数据*所有实验结果均以 V# 表示%采用单因素腺癌细胞系中 %=9 77; 信使 9HE 的相对表达量分方差分析检验多组间的差异%采用$ 检验比较两组间别为 $ ;6KV 6&$ 7V K&$ 7;<V 差异*以 # G 为差异有统计学意义* f@;&$ 正常前列腺上皮细胞 9_TD : 中 %=9 77; 信使 9HE 的表达相比较%前列结果 F $;1&M ++]/ 在前列腺癌组织及细胞系中的表达 %=9 77; 在 ; 对前列腺癌组 9Z lts9 结果显示% 腺癌细胞系中 %=9 77; 信使 9HE 的表达量明显降低%差异有统计学意义$ # G&*结果表明%在前列腺癌组织和细胞系中% %=9 77;均呈较低表达%我们选织和癌旁组织中%其信使 9HE 的相对表达量平均值择 TS< `Q:7G 细胞继续后面实验研究$图 :&* 图 $ 前列腺癌组织及细胞系中 ;1&M ++]/;&H 相对表达情况与正常组织相比较% # G%& &# :# E 9Z 77; 的相对表达量%横坐标字母 E#X lts9 检测前列腺组织中 %=9 & 分别表示一对正常组织和癌组织# ] 9Z 77;相对内参 Q6 的表达量均值#与 9_TD : 细胞 lts9 检测前列腺组织中 %=9 相比较%& &# :%& & &# :# S 9Z 77;的相对表达量* lts9 检测各细胞中 %=9, 流式细胞术检测各组细胞凋亡结果显示%转染 %=9 77;%=%= K 后%对照组和实验组中 TS< G&#`Q:7G 细胞的凋亡率分别为 $ <,K;V # fk&e $ K:&e %两组比较差异有统计学细胞的凋亡率分别为 $ KG6&e $ :, 6;:V 意义$ Bj7@< % # G&*两组结果说明了 %=9 77; 具有促进前列腺癌细胞凋亡的作用$图 &* %两组比较差异有统计学意义$ Bj7< <% 图 ;1&M ++]/对 JB* 和 G$+, 细胞凋亡的影响与对照组比较% # G% # :# E流式细胞术检测 TS< 细胞凋亡# ] TS< 细胞凋亡率# S流式细胞术检测 `Q:7G & && 细胞凋亡# ` `Q:7G 细胞凋亡率* F *B/ *+ 活细胞荧光时实法检测细胞凋亡情 6/ 况结果显示%在转染 %=9 77;%=%= K 后%与 *+, &, /&, 1#2 &*, # # $%& $ *%134,

有统计学意义$ # G&$图 7&* 图 +;1&M ++]/对凋亡相关蛋白的影响与对照组比较%&# G%& & # :#E_ 1b 法检测 TS< 细胞中蛋白表达# ] TS< 细胞中 ] # < S B/ # < 和 ]- 蛋白相对表达柱状图# S_ 1b 法检测 `Q:7G 细胞中蛋白表达# ` `Q:7G 细胞中 ] # < S B/ # < 和

4 R, <H, < J, PJ/Q % :@ 对照组相比较%实验组中 TS< 和 `Q:7G 细胞在荧光显微镜下%绿色荧光强度明显较强%说明实验组中细胞凋亡的程度较严重%即说明了 %=9 77; 具有促进前列腺癌细胞的凋亡的作用$图 <&* 图 * 采用 B/ *+ 活细胞荧光时实法检测 JB* 和 G$+, 不同处理组细胞的凋亡情况 6/ $绿色荧光的强弱表示凋亡的程度%m:& F +E 9 4X 3 : 9检测各组细胞中凋亡相关蛋白的表达与对照组相比较%实验组在转染 %=9 77; 中% ] 蛋白表达下降%而 ]- # < S B/ # < 表达上调* 实验组和对照组比较%差异具 %=%= K 后%前列腺癌细胞株 TS< 和 `Q:7G 细胞有统计学意义$ # G&$图 7&* 图 +;1&M ++]/对凋亡相关蛋白的影响与对照组比较%&# G%& & # :#E_ 1b 法检测 TS< 细胞中蛋白表达# ] TS< 细胞中 ] # < S B/ # < 和 ]- 蛋白相对表达柱状图# S_ 1b 法检测 `Q:7G 细胞中蛋白表达# ` `Q:7G 细胞中 ] # < S B/ # < 和 ]- 蛋白相对表达柱状图* 发引起关注 6*研究表明%多种 %=9HE 在前列腺癌中有比较重要的作用%但是大部分与前列腺癌密切相 * 讨论近年来%随着经济的发展和医疗技术水平的提关的 %=9HE 还不是很明确* 本研究首先通过分析高%前列腺癌的发生率在我国呈现逐渐增长趋势%愈检测 ; 对前列腺癌组织及癌旁组织中 %=9HE 表达 *+, &, /&, 1#2 &*, # # $%& $ *%134,

5 现代泌尿外科杂志 #& 年月第 # 卷第期差异发现 %% 在癌组织中明显降低与文献报道的结果较一致我们进一步检测了几种常见前列腺癌细胞株和人正常前列腺上皮细胞中 %% 的表达结果证明了在前列腺癌细胞系中 %% 也呈较低表达大量研究证实 - 参与肿瘤细胞的增殖分化凋亡等重要生物学过程有些 - 的表达在前列腺癌中降低却对靶基因的转录后水平有较强的调节能力参与肿瘤的发生发展过程 - 等早年已经报道了 %% 能够通过靶向 <- 抑制前列腺癌细胞生长近年又有研究表明 %% 也能够增强前列腺癌对放疗的敏感性提高放疗治疗效果最近有研究证实了 %% 能够调节前列腺癌的转移对早期诊断有一定 & 的价值但是 %% 对前列腺癌凋亡的机制研究目前还没有报道本研究通过转染技术而过表达前列腺癌细胞株 6 和 <3%/ 中 %% 研究其对肿瘤细胞凋亡的影响结果表明 %% 明显促进细胞凋亡同时检测各组细胞中凋亡相关蛋白的表达发现 # 蛋白表达下降较显著而蛋白的表达却上调了 # 是线粒体凋亡途径的关键调节因子能够通过抑制细胞色素从线粒体膜间隔释放到细胞质中而发挥其抗凋亡功能有软件预测 # 很有 # 可能是 %% 的一个靶向结合基因而 - 能够与靶基因 -3 结合在转录后水平调节基因表达研究证实 %% 通过靶向作用 # 基因能够促进骨肉瘤细胞的凋亡同时也能够调节胃癌细胞的增殖和对化疗药物的敏感 % 性有资料显示在多种肿瘤细胞的凋亡过程中 /$ 发现有的活化是一个半胱氨酸蛋白酶家族在细胞凋亡的过程中起着关键性的作用位于级联反应下游如等能被上游的始动子激活作用于特异性底物使细胞发生生化及形态学改变导致细胞凋亡目前也已经发现一系列与有关而诱导凋亡的方法来治疗肿瘤可望在恶性肿瘤的治疗方面取得新的突破因此我们推测 %% 的异常表达可能与前列腺癌具有相关性可能是通过下调靶基因 # 的表达而引起蛋白的改变同时激活了蛋白的表达最终引起了前列腺癌细胞的凋亡当然 %% 可能也有很多其他的靶基因通过改变这些个基因的表达引起细胞凋亡这也是今后继续研究的方向和切入点 # 参考文献 -, <6- +2#&&$##/# #3;- :7 <;: #&/%$/$$ =-<, -- *+-*2 #&####&### %:@:=-7 -%%+,# 26#&///#&#&%# /,6:3@@32%% + 2#&//&$ $:, ;<:,7,: **#&$2-2#&$$$% ## =,,:72=<,: + - 2#&&## -,26-,6; <%% <-2 #&&#%%#% - -=- *+ 2#&$$#%$ &, :3, + %% 6=*2: 2#&/#%/%%% ;6*+ #++ 2 #//&## #2,:7-2--4: #&&%#$,2=32,@-%% #2#&/$&#### %32-7 -, -%%+ *< #7&2<<#&%/#$%/ /=-7,7 + $ 2#&$%%% %% $-, < < #&&# %%%&/ : :<- - * , #&&&#/$#%#% 编辑王玮

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生物技术通报相关载体及试剂动物组织及细胞培养总的提取及反转录内蒙古白绒山羊基因的分子克隆生物信息学分析生物技术通报鲍文蕾杨娇馥李彬刘俊娥王潇郭旭东王志钢侯鑫刘东军旨在克隆内蒙古白绒山羊血管内皮生长因子基因并分析其基本表达模式采用技术克隆基因将得到的基因序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析利用半定量