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褰竿宗
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1 :4 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 215, 37(5): DOI: /cjcb HepaCAM 通过 Wnt/β-catenin 信号通路抑制膀胱癌细胞 T24 的增殖万雪莲马菲菲马红莹吕长坤 * ( 商丘医学高等专科学校医学检验技术教研室, 商丘 4167) 摘要该研究探讨了肝细胞黏附分子 (hepatocyte cell adhesion molecule, HepaCAM) 对膀胱癌细胞 T24 增殖的影响及其对 Wnt/β-catenin 信号通路的调控作用 T24 细胞做空白处理空载腺病毒 (Ad-GFP) 处理和 HepaCAM 过表达腺病毒 (Ad-GFP-HepaCAM) 处理, CCK-8 法检测 HepaCAM 对细胞增殖的影响, qrt-pcr 和 Western blot 法检测 HepaCAM 对 β-catenin c-myc 和 cyclind1 的 mrna 和蛋白表达水平的影响采用 Wnt/β-catenin 信号通路激活剂 LiCl 处理 T24 细胞, MTT 法检测细胞增殖能力, Western blot 检测 GSK3β(try216) 磷酸化水平及 β-catenin c-myc 和 cyclind1 蛋白水平, 克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力结果显示, 过表达 HepaCAM 后, 能够抑制 T24 细胞的生长, 下调 β-catenin c-myc 及 cyclind1 的 mrna 和蛋白的表达水平 5, 1, 2 μmol/l 的 LiCl 作用细胞 2 h 后, 均可促进 T24 细胞的增殖 1 μmol/l 的 LiCl 作用 2 h 后能够降低 GSK3β 的磷酸化水平, 促进 Wnt 信号通路的活化 1 μmol/l 的 LiCl 与 Ad-GFP-HepaCAM 联合处理细胞后, 能够逆转 HepaCAM 对 β-catenin c-myc 及 cyclind1 蛋白水平和细胞增殖的抑制作用该研究表明, HepaCAM 可通过 Wnt/β-catenin 信号通路抑制膀胱癌细胞 T24 的增殖关键词 HepaCAM; Wnt/β-catenin; 膀胱癌细胞 ; T24 HepaCAM Inhibits Proliferation through a Wnt/β-catenin Pathway in Human Bladder Cancer Cell T24 Abstract 收稿日期 : 接受日期 : * 通讯作者 Tel: , lvliang566@163.com Received: October 14, 214 Accepted: February 14, 215 *Corresponding author. Tel: , lvliang566@163.com Wan xuelian, Ma feifei, Ma hongying, Lü Changkun* (Department of Laboratory Medicine, Shangqiu Medical College, Shangqiu, 4761) To investigate the effect of HepaCAM on proliferation and Wnt/β-catenin pathway in bladder cancer cell T24, T24 cells were done with blank treatment, Ad-GFP treatment and Ad-GFP-HepaCAM treatment, respectively. Then, CCK-8 assay was used to measure the effect of HepaCAM on the ability of cellular proliferation, the effects of HepaCAM on protein and mrna expressions of β-catenin, c-myc and cyclind1 were evaluated by Western blot and qrt-pcr. In addition, T24 cells were treated with Wnt/β-catenin activator LiCl. MTT was used to detect cell growth, the phosphorylation level of GSK3β (try216) and the protein level of β-catenin, c-myc and cyclind1 were examined by Western blot, the ability of cell colony was assessed by colony formation assay. Our research indicated that overexpression of HepaCAM could suppress cell growth and down-regulate the expression of β-catenin, c-myc and cyclind1 at mrna and protein levels. Meanwhile, after T24 cells were treated with 5, 1 and 2 μmol/l of LiCl for 2 h, cells proliferation were promoted and 1μmol/L LiCl could decrease the phosphorylation level of GSK3β, leading to activation of Wnt/β-catenin pathway. Moreover, combination treatment of

2 2 研究论文 1 μmol/l of LiCl and Ad-GFP-HepaCAM could reverse the inhibition effect of HepaCAM on protein expression levels of β-catenin, c-myc and cyclind1 and cells growth. In conclusion, our study showed that expression of HepaCAM suppressed proliferation through a Wnt/β-catenin signaling pathway in bladder cancer cell T24. Keywords HepaCAM; Wnt/β-catenin; bladder cancer cells; T24 膀胱癌是泌尿道最常见的恶性肿瘤, 其主要发生于男性据 Siegel 等 [1] 统计, 美国 213 年有例新增病例及死亡病例 [1] 另外, 肿瘤的发生与基因的改变密切相关, 主要是癌基因和抑癌基因的改变因此, 研究膀胱癌肿瘤中基因的改变及产生效应的分子机制将有助于探明膀胱癌的病理发病机制肝细胞黏附分子 (hepatocyte cell adhesion molecule, HepaCAM) 是 25 年由 Sha li Shen 等研究者新发现的可编码免疫球蛋白类细胞黏附分子的新基因 [2] 研究证实, HepaCAM 低表达于多种肿瘤组织, 如乳腺癌膀胱癌等 [3-4] ; 另外, 在膀胱癌细胞中过表达 HepaCAM 基因, 能够抑制癌细胞增殖能力 [5], 但是对于其涉及的分子机制尚未完全阐明 Wnt 信号参与细胞增殖分化和干细胞自我更新能力的调节, 其中, 异常活化的经典 Wnt/β-catenin 信号参与多种肿瘤的病理过程 ( 包括膀胱癌 ), 能够促进肿瘤细胞增殖抑制凋亡促进迁移和侵袭 [6-7] 因此, 本课题拟从体外实验进一步研究 HepaCAM 对膀胱癌肿瘤细胞的生长影响并探究其对 Wnt/ β-catenin 信号通路的调节作用, 旨在探明膀胱癌的病理发病机制, 进一步为膀胱癌的治疗提供一个新的治疗靶点 1 材料与方法 1.1 材料与试剂人膀胱癌细胞 T24 细胞购自武汉大学细胞库 Ad-GFP 空载病毒 Ad-GFP-HepaCAM 过表达腺病毒载体为前期构建并保存于 8 C CCK-8 试剂购自碧云天公司 ; LiCl MTT 试剂购自 Sigma 公司 ; RNA 提取试剂盒 Trizol RT-PCR 试剂盒和 Q-PCR 试剂盒购自大连宝生物工程 ; PCR 引物购自 Invitrogen 公司 ; 细胞培养基 RPMI164 和小牛血清购自 Gibco 公司 ; 兔抗人多克隆抗体 β-catenin GSK3β(try216) 购自美国 Cell Signaling Technology 公司 ; 鼠抗人 c- Myc 兔抗人 cyclind1 和 GAPDH 抗体购自美国 Santa Cruz Biotechnology 公司 1.2 细胞培养和病毒感染膀胱癌细胞株 T24 培养于含 1% 小牛血清的 RPMI164 培养基中, 置于 37 C 5% CO 2 的培养箱中培养待细胞融合度达 7%~8% 时, 分别加入适量 Ad-GFP 及 Ad-GFP-HepaCAM 腺病毒, 设立空白组 (Blank 组 ) Ad-GFP 空载组 (Ad-GFP 组 ) 和 Ad-GFP- HepaCAM 感染组 (Ad-GFP-HepaCAM 组 ), 置于 37 C 5% CO 2 的培养箱中培养, 48, 72 h 后分别提取 RNA 和蛋白, 用于后续试验 1.3 CCK-8 检测细胞增殖常规培养 T24 细胞, 取对数生长期的细胞, 经.25% 胰蛋白酶消化制成细胞悬液, 调整细胞密度, 接种于 96 孔板中 ( 每孔 5 个细胞 ) 并补充培养液至 1 μl, 于 37 C 5% CO 2 恒温培养箱中培养 12 h 后, 分别予以空白处理 Ad-GFP 处理和 Ad-GFP- HepaCAM 处理, 每组设 6 个复孔, 同时接种 3 个 96 孔板分别于处理后 24, 48, 72, 96 h, 每孔加入 1 μl 的 CCK-8 溶液 ( 空白孔也加入 ), 于 37 C 孵箱内孵育 2 h 后再用酶标仪测吸光度 (D 45 ) 根据各孔吸光度绘制细胞生长曲线 1.4 qrt-pcr 检测 β-catenin c-myc 和 cyclind1 的 mrna 表达水平采用 TRiol 法抽提总 RNA, 用反转录试剂盒将所抽提的 RNA 反转录为 cdna, 以 cdna 为模板, qpcr 检测 β-catenin c-myc 和 cyclind1 的 mrna 表达水平每组设置 3 个复孔, 以 β-actin 作为内参, 以 2 ΔΔCt 法计算基因表达引物序列见表 1, 反应条件为 : 首先, 95 C 预变性 3 s; 然后, 95 C 1 s, 56 C 2 s, 72 C 4 s, +Plate Read, 39 个循环 ; 最后, 熔解曲线 65 C~95 C 5 s, +Plate Read 1.5 Western blot 检测蛋白表达水平采用常规方法提取细胞总蛋白, 并用 BCA 法测定蛋白浓度, 经 SDS-PAGE 电泳后, 湿转移至 PVDF 膜, 用 5% 脱脂奶粉在室温下封闭 2 h; 加入一抗, 4 C 孵育过夜 ; TBST 洗膜, 加入 5% 脱脂奶粉稀释的 HRP 标记的二抗, 37 C 孵育 1 h; TBST 洗膜, ECL 暗室化学发光显影 Quantity One 分析软件进行灰度定量

3 万雪莲等 : HepaCAM 通过 Wnt/β-catenin 信号通路抑制膀胱癌细胞 T24 的增殖 3 表 1 引物序列及 PCR 反应条件 Table 1 primer sequences and PCR condition 基因名引物系列退火温度 ( C) 循环数产物长度 (bp) Gene name Primer sequence TM ( C) Cycles Product length (bp) β-catenin 5 -GCT TGG AAT GAG ACT GCT GA CTG GCC ATA TCC ACC AGA GT-3 c-myc 5 -CCT ACC CTC TCA ACG ACA GC CTC TGA CCT TTT GCA AGG AG-3 cyclind1 5 -CCT GTC GCT GGA GCC CGT G TCC GCC TCT GGC ATT TTG G-3 β-actin 5 -TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3 分析, 并将目的蛋白与内参 GAPDH 的积分光密度的比值作为目的蛋白的相对表达量 1.6 MTT 法检测 LiCl 对细胞增殖能力的影响取对数期生长的 T24 细胞, 经.25% 胰蛋白酶消化后制成细胞悬液, 调整细胞密度为 /ml, 接种于 96 孔板中 (2 / 孔 ), 补充培养液至 2 μl 细胞分为空白处理组及 5, 1, 2 μmol/l 的 LiCl 处理组, 每组设 6 个复孔, 同时接种 3 个 96 孔板, 于 37 C 5% CO 2 的恒温培养箱中培养培养后 2 h 弃上清, 每孔加入 2 μl MTT(5 g/l) 继续培养 4 h 后, 小心吸去上清, 加入 DMSO 15 μl, 振荡孵育 1 min, 用全自动酶标仪在 492 nm 处检测各孔的光密度 (D 值 ), 绘制细胞的生长曲线 1.7 克隆形成实验检测细胞的增殖能力取对数生长期的 T24 细胞, 接种于 6 孔板中, 细胞密度为 4/ 孔培养 24 h 后, 先予以空白处理 Ad-GFP 处理和 Ad-GFP-HepaCAM 处理各 24 h, 后给予 1 μmol/l LiCl 处理, 每组设置 3 个复孔, 于 37 C 5% CO 2 的恒温培养箱中培养 15 d 然后用甲醇固定,.1% 结晶紫染色于显微镜下克隆计数, 以 1 个细胞及以上作为 1 个克隆, 比较各处理组克隆数的差异 1.8 统计分析采用 SPSS 17. 统计软件进行统计学分析, 结果以平均值 ± 标准误表示, 组间均数比较采用单因素分析 (ANOVA), 两两比较采用 SNK 法, P<.5 为差异具有统计学意义 2 结果 2.1 HepaCAM 基因对 T24 细胞增殖的影响如图 1 所示, CCK-8 的结果表明, 与空白组和空载组比较, T24 细胞过表达 HepaCAM 基因后, 能 CCK-8 assay (D45) 够明显抑制 T24 的增殖能力, 差异具有统计学意义 (P<.1) 空白组与空载组比较, 无统计学差异 2.2 HepaCAM 对 β-catenin c-myc 和 cyclind1 的 mrna 和蛋白表达水平的影响 qrt-pcr 和 Western blot 的结果显示, 过表达 HepaCAM 后, 能够在 mrna 和蛋白水平上下调 β-catenin 及下游靶分子 c-myc 和 cyclind1 的表达, 与空白组空载组之间的差异有统计学意义 (P<.1) ( 图 2 A 和图 2B) 2.3 LiCl 对 T24 细胞生长能力及 GSK3β 磷酸化水平的影响 T24 P<.1, HepaCAM 组与空白组空载组比较 P<.1, HepaCAM group vs blank group and GFP group. 图 1 CCK-8 检测 HepaCAM 对 T24 细胞的增殖影响 Fig.1 The effect of HepaCAM on the proliferation of T24 cells by CCK-8 assay Blank control GFP GFP-HepaCAM 如图 3 所示, 5, 1, 2 μmol/l LiCL 处理 T24 细胞后, 均能促进细胞的生长, 且 2 μmol/l 作用浓度时, 细胞的生长能力与 1 μmol/l 浓度的差异不大 (P>.5) 因此, 选用 1 μmol/l LiCL 处理 T24 细胞 2 h 时促增殖作用最佳同时, Western blot 结果显示, 与空白组比较, 1 μmol/llicl 处理 T24 细胞 2 h 能够降低 GSK3β 磷酸化水平, 有统计学差异 (P<.5) Time (d)

4 研究论文 (A) Relative mrna expression (/β-actin) 1.5 1.

1, 与对照组比较 ; B: β-catenin c-myc 和 cyclind1 的蛋白表达水平, GAPDH 为内参 A: the mrna expression levels of β-catenin, c-myc and cyclind1, P<.

4 4 研究论文 (A) Relative mrna expression (/β-actin) β-catenin T24 c-myc Control GFP GFP-HepaCAM cyclind1 (B) β-catenin c-myc cyclind1 GAPDH Blank GFP GFP-HepaCAM A: β-catenin c-myc 和 cyclind1 的 mrna 表达水平, P<.1, 与对照组比较 ; B: β-catenin c-myc 和 cyclind1 的蛋白表达水平, GAPDH 为内参 A: the mrna expression levels of β-catenin, c-myc and cyclind1, P<.1 vs control group; B: the protein expression levels of β-catenin, c-myc and cyclind1. GAPDH was used as a control. 图 2 Western blot 和 QPCR 检测 HepaCAM 对 β-catenin c-myc 和 cyclind1 的 mrna 和蛋白表达的影响 Fig.2 Effects of HepaCAM on the mrna and protein expression levels of β-catenin, c-myc and cyclind1 by Western blot and qrt-pcr (A) Viable cell rate (1%) μmol/l 1 μmol/l 2 μmol/l P>.5 (B) p-gsk3β(tyr216) total-gsk3β GAPDH Blank 1 μmol/l LiCl 2 h A: T24 细胞的生长能力 ; B: 磷酸化 GSK3β(tyr216) 和总 GSK3β 的蛋白表达水平, GAPDH 作为内参 A: the growth ability of T24 cells; B: the protein levels of p-gsk3β(tyr216) and total-gsk3β. GAPDH was used as a control. 图 3 MTT 检测 LiCl 对 T24 细胞生长能力及 GSK3β 磷酸化水平的影响 Fig.3 The effects of LiCl on the proliferation ability and phosphorylation GSK3β of T24 cells 2.4 HepaCAM 联合 LiCl 处理对 β-catenin c-myc 和 cyclind1 蛋白表达的影响如图 4 所示, Western blot 结果表明, 与 Ad-Hepa- CAM 处理组比较, Ad-HepaCAM 联合 LiCl 处理能够逆转 HepaCAM 对 β-catenin 及下游靶分子 c-myc 和 cyclind1 表达的抑制作用, 差异有统计学意义 (P<.5) 2.5 HepaCAM 联合 LiCl 处理对 T24 细胞克隆能力的影响如图 5 所示, 克隆形成实验结果显示, 与单独 Ad-HepaCAM 处理组比较, Ad-HepaCAM 联合 LiCl 处理能够逆转 HepaCAM 对 T24 细胞克隆形成能力的抑制作用, 差异有统计学意义 (P<.5) 3 讨论 HepaCAM 为新发现的免疫球蛋白超家族, 能够调节细胞的黏附增殖凋亡迁移和分化研究证实, HepaCAM 低表达于多种肿瘤, 如乳腺癌 [3] 肝癌 [2] 膀胱癌 [4] 等进一步研究发现, 在乳腺癌中, HepaCAM 可通过 P53/P21 依赖的方式诱导细胞的衰亡 [3] ; 在膀胱癌中, HepaCAM 的启动子区存在高甲基化 [8] ; 另外, 5- 氮 -2- 脱氧胞苷 (5-aza-CdR) 或干扰素 -γ 能够诱导 HepaCAM 的再表达, 进而抑制肿瘤细胞的增殖 [9] 以上研究表明, HepaCAM 为潜在的致癌基因另有报道, 在肾癌中, HepaCAM 能够诱导细胞阻滞于 G 1 期及促进 c-myc 的降解 ; HepaCAM 能够下调 AMPK/mTOR 下游靶分子 c-myc 和 cyclind1 的表

万雪莲等 : HepaCAM 通过 Wnt/β-catenin 信号通路抑制膀胱癌细胞 T24 的增殖 5 达, 通过依赖 AMPK/mTOR 通路的方式抑制膀胱癌 [5] 细胞的增殖经典 Wnt/β-catenin 信号通路参与多种肿瘤恶性生物学行为的调节, 经证实其异常活化于膀胱癌, 且 [7] 参与膀胱癌的病理过程同时, β-catenin 为 Wnt/ β-catenin

cyclind1 c-myc GAPDH 图 4 Western blot 检测不同处理后 β-catenin, c-myc, cyclind1 的蛋白表达水平 Fig.

5 万雪莲等 : HepaCAM 通过 Wnt/β-catenin 信号通路抑制膀胱癌细胞 T24 的增殖 5 达, 通过依赖 AMPK/mTOR 通路的方式抑制膀胱癌 [5] 细胞的增殖经典 Wnt/β-catenin 信号通路参与多种肿瘤恶性生物学行为的调节, 经证实其异常活化于膀胱癌, 且 [7] 参与膀胱癌的病理过程同时, β-catenin 为 Wnt/ β-catenin 信号的关键分子, 其能够通过入核与 LEF/ TCF 转录因子结合, 从而启动下游靶分子 c-myc 和 cyclind1 等的表达因此, 我们猜想, HepaCAM 否够调节 β-catenin 及下游增殖相关靶分子 c-myc 和 cyclind1 的表达, 进而调节膀胱癌细胞的增殖 Blank Ad-GFP LiCl Ad-hep Ad-hep+LiCl β-catenin cyclind1 c-myc GAPDH 图 4 Western blot 检测不同处理后 β-catenin, c-myc, cyclind1 的蛋白表达水平 Fig.4 The proteins levels of β-catenin, c-myc and cyclind1 by Western blot after different treatment Blank Ad-GFP Ad-HepaCAM Ad-HepaCAM+LiCl Relative colony formation ability 1 *P<.5, Ad-HepaCAM 联合 LiCl 组与 Ad-HepaCAM 组比较 Blank Ad-GFP Ad-HepaCAM Ad-HepaCAM+LiCl *P<.5, Ad-HepaCAM and LiCl group vs Ad-HepaCAM group. 图 5 克隆形成实验检测 T24 细胞的增殖能力 Fig.5 The proliferation ability of T24 cells by colony-formation assay * 本课题通过 Ad-GFP-HepaCAM 腺病毒感染过表达 T24 细胞中的 HepaCAM 基因, 进一步证实 HepaCAM 能够抑制癌细胞的增殖能力, 同课题组前期的结果一致同时, 过表达 HepaCAM 能够下调 β-catenin c-myc 和 cyclind1 的 mrna 和蛋白水平的表达另外, 我们采用 Wnt 通路的特异性激活剂 LiCl 联合 Ad-GFP-HepaCAM 病毒处理细胞, 结果证实, Ad-GFP-HepaCAM 联合 LiCl 能够逆转 Ad-GFP- HepaCAM 对 β-catenin c-myc 和 cyclind1 表达及细胞增殖的抑制作用以上研究表明, HepaCAM 可通过 Wnt/β-catenin 信号通路抑制膀胱癌细胞的增殖另外, 研究证实, HepaCAM 可通过依赖 AMPK/ mtor 方式抑制膀胱癌细胞的增殖, 那么两条信号通路 Wnt/β-catenin 和 AMPK/mTOR 之间是否通过 HepaCAM 介导存在相互的关系需要进一步探究综上所述, 该研究首次揭示了 HepaCAM 对 Wnt/ β-catenin 信号通路的调节作用, 通过 Wnt/β-catenin 通路调节膀胱癌细胞的增殖, 进一步探明了膀胱癌的病理发病机制, 为膀胱癌的治疗提供了新的靶点参考文献 (References) 1 Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics 213. CA Cancer J Clin 213; 63(1): Chung Moh M, Hoon Lee L, Shen S. Cloning and characterization of HepaCAM, a novel Ig-like cell adhesion molecule suppressed in human hepatocellular carcinoma. J Hepatol 25; 42(6): Moh MC, Zhang T, Lee LH, Shen S. Expression of HepaCAM

6 6 研究论文 is downregulated in cancers and induces senescence-like growth arrest via a p53/p21-dependent pathway in human breast cancer cells. Carcinogenesis 28; 29(12): He Y, Wu X, Luo C, Wang L, Lin J. Functional significance of the HepaCAM gene in bladder cancer. BMC Cancer 21; 1: Wang Q, Luo C, Wu X, Du H, Song X, Fan Y. HepaCAM and p-mtor are closely correlated in transitional cell carcinoma of bladder and expression of HepaCAM inhibits proliferation via an AMPK/mTOR-dependent pathwain human bladder cancer cells. J Urol 213; 19(5): Karim RZ, Tse GM, Putti TC, Scolyer RA, Lee S. The significance of the Wnt pathway in the pathology of human cancers. Pathology 24; 36(2): Urakami S, Shiina H, Enokida H, Kawakami T, Tokizane T, Ogishima T, et al. Epigenetic inactivation of Wnt inhibitory factor-1 plays an important role in bladder cancer through aberrant canonical Wnt/β-catenin signaling pathway. Clin Cancer Res 26; 12(2): Pan C, Wu X, Luo C, Yang S, Pu J, Wang C, Shen S. Exon 2 methylation inhibits HepaCAM expression in transitional cell carcinoma of the bladder. Urol Int 21; 85(3): Xu B, He Y, Wu X, Luo C, Liu A, Zhang J. Exploration of the correlations between interferon-γ in patient serum and HepaCAM in bladder transitional cell carcinoma, and the interferon-γ mechanism inhibiting BIU-87 proliferation. J Urol 212; 188(4):

684 研究论文 L of LiCl and Ad-GFP-HepaCAM could reverse the inhibition effect of HepaCAM on protein expression levels of β-catenin, c-myc and cyclind1 as

684 研究论文 L of LiCl and Ad-GFP-HepaCAM could reverse the inhibition effect of HepaCAM on protein expression levels of β-catenin, c-myc and cyclind1 as Chinese Journal of Cell Biology 215, 37(5): 683 688 DOI: 1.11844/cjcb.215.5.31 HepaCAM 通过 Wnt/β-catenin 信号通路抑制膀胱癌细胞 T24 的增殖万雪莲马菲菲马红莹吕长坤 * ( 商丘医学高等专科学校医学检验技术教研室, 商丘 4761) 摘要该研究探讨了肝细胞黏附分子 (hepatocyte cell