203,33(8) 朱小三等 :ECHS 经线粒体途径调控 HepG2 细胞凋亡的羊抗兔 IgG 和羊抗鼠 IgG 购自北京博奥森生物技术有限公司, 原位细胞凋亡试剂盒购自美国 Roche 公司, 顺铂购自大连 TaKaRa 公司, 流式细胞仪购自美国 BD 公司, 碘化丙锭 (PI) 和膜联蛋白

Size: px

Start display at page:

Download "203,33(8) 朱小三等 :ECHS 经线粒体途径调控 HepG2 细胞凋亡的羊抗兔 IgG 和羊抗鼠 IgG 购自北京博奥森生物技术有限公司, 原位细胞凋亡试剂盒购自美国 Roche 公司, 顺铂购自大连 TaKaRa 公司, 流式细胞仪购自美国 BD 公司, 碘化丙锭 (PI) 和膜联蛋白"

须钭
5 years ago
Views:

1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,203,33(8):0 4 ECHS 经线粒体途径调控 HepG2 细胞凋亡,2 朱小三戴益琛陈章兴谢军培曾伟林园园 3 赵本华 ( 厦门大学附属成功医院厦门南昌大学研究生院医学部南昌 ) (3 厦门大学公共卫生学院厦门 36005) 摘要目的 : 观察烯脂酰辅酶 A 水合酶短链 (enoyl CoA hydrataseshortchain,echs) 对 HepG2 细胞凋亡的影响方法 : 构建 ECHS 基因的干扰质粒, 转染 HepG2 细胞后通过嘌呤霉素筛选稳定干扰 ECHS 的细胞株 (HepG2 siechs), 利用 Westernblot 验证其干扰效率 ; 利用流式细胞仪及 TUNEL 方法检测 ECHS 干扰后 HepG2 细胞凋亡情况, 再采用 Westernblot 检测凋亡相关蛋白表达水平结果 : 成功构建了 ECHS 的干扰质粒 ;Westernblot 验证了 ECHS 干扰后 HepG2 细胞株中 ECHS 表达低于空白对照组 ( 未转染 HepG2 细胞 ) 及阴性对照组 ( 空载体 pu6 转染 HepG2 细胞 )(P<0.05); 流式细胞仪术显示 HepG2 siechs 组细胞株凋亡率 (4.98±.07)%, 阴性对照组 (0.55±0.9)%, 两者差异有统计学意义 (P<0.05);TUNEL 实验显示 HepG2 siechs 组细胞株凋亡率 (6.3±0.2)%, 阴性对照组 (2.89±0.2)%, 两者差异有统计学意义 (P<0.05); 与阴性对照组比较,ECHS 干扰后 p53 促凋亡蛋白 Bax 及 Bid 均表达增加结论 :ECHS 通过线粒体途径拮抗 HepG2 细胞凋亡关键词 ECHS 线粒体途径 HepG2 细胞凋亡中图分类号 Q89 肝细胞癌 (hepatocelularcarcinoma,hcc) 是当今第五大最流行恶性肿瘤, 占肿瘤致死病因的第三位, 仅次于胃癌和食管癌 [] HCC 常见病因有病毒性肝炎黄曲霉菌感染化学物质接触及遗传因素等 [2] 研究表明 30% ~40%HCC 患者无 HBV 或 HCV 慢性感染, 提示可能存在其它导致肝细胞癌的诱发因素, 进一步研究发现这部分患者存在脂肪肝或脂质代谢方面等疾病, 在美国日本和我国台湾地区肥胖患者发生 HCC 几率较非肥胖患者高.5~2.0 倍 [3] 因此,HCC 发生与脂肪代谢可能相关 ECHS 基因定位人 0q26.2~ q26.3, 编码的蛋白质定位于线粒体中,ECHS 蛋白被归为水解酶 / 异构酶超家族, 催化 2 反式烯脂酰辅酶 A 水化为 L 3 羟脂酰辅酶 A [4], 是参与催化脂肪酸分解代谢 β 氧化通路第二步的关键酶研究表明 ECHS 表达收稿日期 : 修回日期 : 南京军区医学科技创新课题 (0MA070) 厦门市科技计划医疗卫生创新项目 (3502Z ) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :dyichen@sina.com 异常可能与 HCC 胃癌大肠癌乳腺癌恶性黑色素瘤及前列腺癌等发生关系密切 [5 6] [7] Xiao 等研究发现 ECHS 作为 HBs 结合蛋白促进 HepG2 细胞凋亡, 本研究探讨 ECHS 是否同样促进无病毒感染的 HepG2 细胞凋亡材料与方法. 材料与试剂 HepG2 细胞株购自中国科学院上海细胞库 ; 胎牛血清青霉素链霉素和嘌呤霉素购自美国 Gibco 公司, DMEM 培养液购自美国 Hyclone 公司,pU6 空载体购自美国 Invitrogen 公司, 脂质体 LipofectAMINE TM 2000 购自美国 Invitrogen 公司,RIPA 细胞裂解液购自江苏碧云天生物技术研究所,BCA 蛋白定量检测试剂盒和电化学发光试剂盒购自美国 Pierce 公司, 兔抗人 ECHS 单克隆抗体购自英国 Abcam 公司, 兔抗人 Bax Bid p53 及 p p53 单克隆抗体购自 CST 公司, 兔抗人 Tubulin 单克隆抗体购自美国 SantaCruz 公司, 辣根过氧化物酶标记

203,33(8) 朱小三等 :ECHS 经线粒体途径调控 HepG2 细胞凋亡的羊抗兔 IgG 和羊抗鼠 IgG 购自北京博奥森生物技术有限公司, 原位细胞凋亡试剂盒购自美国 Roche 公司, 顺铂购自大连 TaKaRa 公司, 流式细胞仪购自美国 BD 公司, 碘化丙锭 (PI) 和膜联蛋白 V(AnnexinV) 双染荧光标记凋亡检测试剂盒购自美国 Roche 公司.

2 203,33(8) 朱小三等 :ECHS 经线粒体途径调控 HepG2 细胞凋亡的羊抗兔 IgG 和羊抗鼠 IgG 购自北京博奥森生物技术有限公司, 原位细胞凋亡试剂盒购自美国 Roche 公司, 顺铂购自大连 TaKaRa 公司, 流式细胞仪购自美国 BD 公司, 碘化丙锭 (PI) 和膜联蛋白 V(AnnexinV) 双染荧光标记凋亡检测试剂盒购自美国 Roche 公司.2 细胞培养 HepG2 细胞株购自中国科学院上海细胞库, 置于含 0% 灭活新生牛血清的 DMEM 完全培养液中, 于 37 5%CO 2 培养箱中培养,2~3d 传代次, 全部实验中所用到细胞均处于对数生长期.3 建立稳定干扰 ECHS 细胞株根据 ECHS 基因序列 ( 序列号 :NM06772) 设计 2 条 sirna,echs sirna 号序列的正义链 :5 GCUAUG AAACGAUAUGGGCUU 3 ; 反义链 : 5 GCCCAUAUCGUUUCAUAGCUU 3 2 号序列正义链 : 5 GCCTCGGGTGCTAACTTTAAG 3 ; 反义链 : 5 CTTAAAGTTAGCACCCGAGGC 3 将 HepG2 细胞接种在含 00ml/L 胎牛血清的 DMEM 培养液的 6 孔板内, 置于 37 培养箱恒温培养, 并保证细胞转染效率待细胞达到 85% ~90% 的融合, 按照 ECHS 干扰质粒 : 脂质体比例为 4μg 0μl 加入 Lipofectamine TM 2000 及质粒复合物转染细胞,4~6h 后换上新鲜的培养液实验设干扰 ECHS 质粒组 (ECHS sirna ECHS sirna2) 空白对照组 ( 未转染 HepG2 细胞 ) 及阴性对照组 ( 空载体 pu6 转染 HepG2 细胞 ) 用含嘌呤霉素浓度为 0μg/ml 完全培养基筛选, 培养转染重组质粒及对照组的细胞周后可形成单克隆细胞细胞系,2 周后筛选出 ECHS 干扰细胞株, 分别提取细胞蛋白验证其干扰效果, 选取其中干扰效果最为明显的细胞株进行后续试验.4 流式细胞仪检测 HepG2 细胞凋亡将干扰组及阴性对照组 HepG2 细胞分别铺于 2 孔板, 每种细胞 3 个复孔,24h 后加入 5μg/ml 顺铂培养, 诱导细胞凋亡 24h 后收集漂浮以及贴壁的细胞到 0ml 的离心管中, 每样本细胞数约为 (~5) 0 6 /ml 500~000r/min 离心 5min, 弃去培养液用孵育缓冲液洗涤次,500~000r/min 离心 5min 用 00μl 的 PBS 溶液重悬细胞, 加入 5μlAnnexinV 和 5μlPI 冰上避光孵育 0~5min, 按 AunexinV FITC 和 Pl 双染试剂盒说明书操作,500~000r/min 离心 5min 沉淀细胞孵育缓冲液洗次, 用 ml 的孵育缓冲液重悬细胞用于流式细胞仪分析, 实验结果重复 3 次.5 TUNEL 检测 HepG2 凋亡及定量分析样品上加 50μlTUNEL 检测液,37 避光孵育 60 min PBS 洗涤 3 次用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察, 激发光 450~500nm, 发射光 55~565 nm( 绿色荧光 ) 每份样品随机选取 5 个视野, 计算细胞凋亡率 : 凋亡率 = 凋亡细胞数 / 总细胞数 00%, 实验结果重复 3 次.6 Westernblot 检测 ECHS 与凋亡相关蛋白表达 RIPA 缓冲液裂解 HepG2 细胞, 提取胞质蛋白并定量, 以 20μg/ 孔的蛋白在 0% SDS PAGE 凝胶电泳 45min, 转移至硝酸纤维素膜, 用含 5% 脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液封闭,4 过夜, 然后加入相应单克隆抗体孵育 h, 再与相应过氧化物酶标记的二抗孵育 h, 经增强型化学发光 (ECL) 系统显色, 通过凝胶分析系统测定蛋白条带密度.7 统计学方法采用 SPSS7.0 软件对实验的结果数据进行统计分析, 应用方差分析数据, 组间比较采用 SNK 方法, 检验水准取 α=0.05,p<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2. 稳定转染 HepG2 细胞株中 ECHS 蛋白表达水平由广州市锐博生物科技有限公司合成的 ECHS 干扰质粒, 拼接 pu6 后转染至 HepG2 细胞 Westernblot 结果显示,Anti myc tag 单抗可特异识别 ECHS 重组质粒转染的 HepG2 细胞中的蛋白, 表现在约 3kDa 处出现了一条特异性条带 ( 图 ), 与预期的基因编码蛋白大小相似, 而阴性对照组在相应位置未显示出条带, 提示 ECHS 质粒在 HepG2 细胞中验证表达成功图 pu6 ECHS myc 重组质粒验证 Fig. Verificationofrecombinantplasmid ofpu6 ECHS myc Negativecontrol:HepG2celsweretransfectedwithpU6vector Westernblot 检测空白对照组阴性对照组及 ECHSsiRNA ECHSsiRNA2 干扰组中 ECHS 蛋白

2 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No.8203 情况,ECHSsiRNA ECHSsiRNA2 组 ECHS 蛋白表达均受到抑制, 以 ECHSsiRNA2 组最为明显 ( 图 2), 因此在后续实验中均采用 ECHSsiRNA2 组细胞株, 空白对照组阴性对照组中 ECHS 蛋白表达无显著差异 (P>0.

2 TheexpresionlevelsofECHSinHepG2 celsdetectedbywesternbloting Blankcontrol:HepG2celswithouttransfection;Negativecontrol: HepG2celsweretransfectedwithpU6vector;ECHSsiRNAand

05,vsblankcontrolornegativecontrol 图 4 流式细胞术检测 ECHS 对 HepG2 细胞株凋亡的变化 Fig.

05,vsnegative control 图 3 两组 ECHS 蛋白表达水平比较 Fig.

3 2 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No.8203 情况,ECHSsiRNA ECHSsiRNA2 组 ECHS 蛋白表达均受到抑制, 以 ECHSsiRNA2 组最为明显 ( 图 2), 因此在后续实验中均采用 ECHSsiRNA2 组细胞株, 空白对照组阴性对照组中 ECHS 蛋白表达无显著差异 (P>0.05)( 图 3) 图 2 Westernblot 检测 HepG2 细胞中 ECHS 表达 Fig.2 TheexpresionlevelsofECHSinHepG2 celsdetectedbywesternbloting Blankcontrol:HepG2celswithouttransfection;Negativecontrol: HepG2celsweretransfectedwithpU6vector;ECHSsiRNAand ECHSsiRNA2:HepG2 celsweretransfectedwithrecombinant plasmidsofpgpu6/gfp/sirna ECHS andpgpu6/gfp/sirna ECHS 2.P<0.05,vsblankcontrolornegativecontrol 图 4 流式细胞术检测 ECHS 对 HepG2 细胞株凋亡的变化 Fig.4 ApoptosisofHepG2celswas detectedbyflowcytometry ECHSsiRNA: HepG2 celsweretransfected with recombinant plasmidsofpgpu6/gfp/sirna ECHS.P<0.05,vsnegative control 图 3 两组 ECHS 蛋白表达水平比较 Fig.3 Comparisonofexpresionof ECHSintwogroups Blankcontrol:HepG2celswithouttransfection;Negativecontrol: HepG2celsweretransfectedwithpU6vector 2.2 流式细胞仪检测 ECHS 对 HepG2 细胞凋亡的影响流式细胞术显示 ECHS 基因的干扰后 HepG2 细胞株凋亡率 (4.98±.07)%, 阴性对照组 (0.55± 0.9)%, 两者差异有统计学意义 (P<0.05), 如图 TUNEL 检测 HepG2 凋亡及定量分析 ECHS 基因干扰后 HepG2 细胞株凋亡率 (6.03± 0.7)%, 阴性对照组 (2.89±0.2)%, 两者差异有统计学意义 (P<0.05), 如图 5 图 5 TUNEL 检测 ECHS 对 HepG2 细胞株凋亡的变化 Fig.5 ApoptosisofHepG2celswas detectedbytunelasay ECHSsiRNA: HepG2 celsweretransfected with recombinant plasmidsofpgpu6/gfp/sirna ECHS.P<0.05,vsnegative control 2.4 Westernblot 检测 ECHS 对相关凋亡蛋白表达的影响 ECHS 干扰后 p53 较阴性对照组表达增加, 且活化状态 p53 表达亦增加 ; 促凋亡蛋白 Bid Bax 表达增加 ( 图 6), 两者差异有统计学意义 (P<0.05)

4 203,33(8) 朱小三等 :ECHS 经线粒体途径调控 HepG2 细胞凋亡 3 图 6 Westernblot 检测 HepG2 细胞株中 p53 Bid Bax 蛋白表达 Fig.6 Expresionsofp53,BidandBaxinHepG2 celsweredetectedviawesternblot ECHSsiRNA: HepG2 celsweretransfected with recombinant plasmidsofpgpu6/gfp/sirna ECHS 3 讨论 HCC 是全球范围内生存率较低的恶性肿瘤之一, 其起病隐匿发病机制不明确复发转移率高创新治疗药物少等, 均是该病发病率及死亡率逐年增加的重要原因 [] 因此, 对肝细胞癌发病机制及诊治新技术的研究意义重大 ECHS 基因结构具有高度保守性, 含 8 个外显子和 7 个内含子, 第 8 个外显子分别含有 5 非翻译区 3 非翻译区, 在启动子上游第位是两个极为重要的转录启动点,ECHS 基因的 5 侧翼序列为 GC 富集区, 编码的蛋白质定位于线粒体及溶酶体胞质中, 在天然状态下 ECHS 以六聚体的形式存在, 与其它水解酶和异构酶在基因序列上具有相当高的一致性 ( 如 Δ2, Δ3 烯酰辅酶 A 异构酶和 4 氯苯甲酰辅酶 A 去卤酶等 ), 因此, 将其归为水解酶 / 异构酶超家族 [4] 目前 ECHS 在 HCC 合并病毒性肝炎中的作用机制备受关 [8] 注 Yokoyama 等报道在肝细胞肝癌合并 HCV 感染 [7] 的患者中 ECHS 表达下调 Xiao 等研究发现 ECHS 作为 HBsAg 重要结合蛋白线粒体途径介导 [9] HepG2 细胞凋亡 Zhou 等利用酵母双杂交研究发现 ECHS 通过与 HBs 相互结合影响宿主细胞增殖凋亡 [4] Gong 等研究发现 HBs 通过与 ECHS 蛋白相互结合并调控其表达参与肝细胞癌发生发展为阐述 ECHS 在乙肝表面抗原阴性的 HepG2 细胞凋亡中的作用机制, 本实验成功构建稳定干扰 ECHS 的稳转 HepG2 细胞系 (HepG2 siechs 细胞 ), 再从蛋白水平验证 ECHS 干扰程度图 2 显示较空白对照组及阴性对照组而言, 干扰组 HepG2 细胞中 ECHS 表达明显减少, 且 ECHSsiRNA2 组干扰效果更为明显图 3 显示 ECHS 在空白对照组及阴性对照组 HepG2 细胞株中表达无显著差异, 提示载体转染过程中未影响自身 ECHS 表达为进一步探索 ECHS 对 HepG2 细胞凋亡的影响, 采用流式细胞仪及 TUNEL 方法对干扰组及阴性对照组 HepG2 细胞凋亡检测图 4 5 均显示较阴性对照组,ECHSsiRNA 组细胞凋亡率明显增高细胞凋亡失衡是 HCC 形成的重要诱因之一, 这与凋亡相关基因表达异常密切相关, 如促凋亡基因 (Fas Bax ICE p53 等 ) 突变或表达缺失, 双向调控基因 (c myc Bclx) 表达异常, 抑制凋亡基因 ( 如 EIB IAP BcL 2 等 ) 表达上调 [0 ] 为探究 ECHS 抗 HCC 凋亡现象的分子机制, 采用 Westernblot 检测 p53 及相关促凋亡蛋白 Bid Bax 在 HepG2 细胞中的表达图 6 显示 ECHS 干扰后 HepG2 细胞中 p53 p p53 表达亦增加, 同时干扰后 HepG2 促凋亡蛋白 Bid Bax 表达增加, 这可能为 [7] ECHS 拮抗 HepG2 细胞凋亡的机制之一 Xiao 等研究报道 ECHS 作为 HBs 结合蛋白促进 HepG2 细胞凋亡本实验显示 ECHS 在无乙型肝炎病毒感染的 HepG2 细胞中发挥抗凋亡作用这两种现象的生物学机制需进一步研究综上所述,ECHS 通过线粒体途径拮抗 HepG2 凋亡, 其对肝细胞癌演进可能发挥重要作用参考文献 []JemalA,BrayF,CenterM M,etal.Globalcancerstatistics. CACancerJClin,20,6: [2]WangY,LiJ,ChenJ,etal.From cirhosistohepatocelular carcinomain hcv infected patients: Genesinvolved in tumor progresion.eurrevmedpharmacolsci,202,6: [3]TanakaM,MasakiY,TanakaK,etal.Reductionoffatyacid oxidationandresponsestohypoxiacorelatewiththeprogresionof de diferentiationinhcc.molmedreport,203,7(2): [4]GongX,ZhuY,DongJ,etal.SmalhepatitisBsurfaceantigen interacts with and modulates enoyl coenzyme A hydratase

5 4 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No.8203 expresioninhepatomacels.archvirol,203,58(5): [5] Jansen U, DavisE M, Le Beau M M, etal. Human mitochondrialenoyl coa hydratase gene (echs): Structural organizationand asignmenttochromosome0q26.2 q26.3. Genomics,997,40: [6]LiuX,FengR,DuL.Theroleofenoyl coahydrataseshortchain andperoxiredoxin3inpp2 inducedapoptosisinhumanbreast cancermcf 7cels.FEBSLet,200,584: [7]XiaoCX,YangXN,HuangQW,etal.ECHSactsasanovel HBsAg binding protein enhancing apoptosis through the mitochondrialpathwayinhepg2cels.cancerlet,203,330 (): [8] YokoyamaY,KuramitsuY,TakashimaM,etsl.Proteomic profilingofproteinsdecreasedinhepatocelularcarcinomafrom patientsinfectedwithhepatitiscvirus.proteomics,2004,4: [9] ZhouFL,RenK,LuY P,etal.Screeningofhepatocyte proteinsbindingtowholesproteinofhepatitisbvirusbyyeast two hybridsystem.zhonghuaganzangbingzazhi,2008,6: [0] Zheng Y, Yin L, Chen H, etal. mir 376a suppreses proliferationandinducesapoptosisinhepatocelularcarcinoma. FEBS LETT,202,586: []FarhanBasit,RobinHumphreys,SimoneFulda.RIPProtein dependentasemblyofacytosolicceldeathcomplexisrequired forinhibitorofapoptosis(iap)inhibitor mediatedsensitizationto lexatumumab induced apoptosis. J BiolChem, 202, 287: ECHSInvolvedinAntagonisingApoptosisinHepG2Cels viathemitochondrialpathway ZHUXiao san,2 DAIYi chen CHENZhang xing XIEJun pei ZENGWei LINYuan yuan ZHAOBen hua 3 (DepartmentofGastroenterology,ChenggongHospital,XiamenUniversity,Xiamen 36003,China) (2MedicaldepartmentofGraduateColegeofNanchangUniversity,Nanchang ,China) (3DepartmentofEpidemiologyandHealthStatisticsofPreventiveMedicine,XiamenUniversity,Xiamen 36005,China) Abstract Objective:Toinvestigatetheimpactofenoyl CoA hydrataseshortchain(echs) on apoptosisofhepg2cels.methods:theechsinterferenceplasmidswereconstructedandtransfectedinto HepG2cels.Thestableinterferencecellineswerescreenedviapuromycin.Interferenceeficacywasdetected bywesternblot.flowcytometryandtunelasaysstudiedtheapoptosisofhepg2cels.apoptosis related proteinsweredetectedbywesternblot.results:thehepg2celswithstableechsgeneinterferencewere succesfulyestablished.theexpresionlevelofechsproteininhepg2celsaftertransfectionwithechs sirnawassignificantlylowerthanthatintheblankcontrolcels(hepg2celswithouttransfection)andthe negativecontrolcels(hepg2celstransfectedwithpu6vector)(p< 0.05).ApoptosisratiooftheECHS sirnagroupwassignificanthigherthanthatofnegativecontrolgroupbybothflowcytometryandtunelasays (P<0.05).Expresionsofp53,BaxandBidinECHSsiRNAgroupwerehigherthanthoseinnegativecontrol group.conclusion:echsmayantagonisetheapoptosisofhepg2celsviathemitochondrialpathway. Keywords ECHS Mitochondrialpathway HepG2cels Apoptosis

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽