期 余钧辉 孙学军 郑见宝 等 %&' 通过 )# ",#-# 信号通路促进结肠癌细胞的增殖 结直肠癌是目前最为常见的恶性肿瘤之一 其全球范围的综合发病率在恶性肿瘤中男性排名第 女性排名第 近年来随着生活水平的提高 饮食习惯的改变 结直肠癌的发病率在我国呈逐年增长的趋势 年 我国结直肠癌新发病例数

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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'& & 基础研究 通过 信号通路促进结肠癌细胞的增殖 余钧辉 孙学军 郑见宝 王 炜 杨 魁 魏光兵 西安交通大学第一附属医院普通外科 陕西西安 $ 摘要 目的 探讨 %&' 对结肠癌细胞增殖的影响 并初步探讨其分子机制 方法 用生长曲线实验和 %% 法检测 %&'# 对结肠癌细胞 (% 增殖的影响 流式细胞仪检测 %&' 对结肠癌细胞周期的影响 ) *+# 检测 %&' 对 ",#-#"" 及 ""-#. 的影响 观察 /01 阻断 )# ",#-# 信号通路对 %&' 促进结肠癌细胞增殖及 )# ",#-# 信号通路相关蛋白的影响 结果 %&'# 组结肠癌细胞 (% 增殖明显增快 均 期细胞明显减少 期细胞明显增多 期细胞比例没有统计学差异 %&' 可促进结肠癌细胞中 ",#-#"" 及 ""-#. 蛋白的表达 均 /01 减弱了 %&' 对结肠癌细胞增殖的作用 均 而且 ",#-#"" 及 ""-#. 的蛋白表达降低 均 结论 %&' 可能通过激活 )# ",#-# 信号通路促进结肠癌细胞的增殖 从而参与结肠癌的发生发展 关键词 结直肠癌 %&' 增殖 )# ",#-# 信号通路中图分类号 文献标志码 0 $!!"#$$##! %&'" "& 2#-& /#3(4&2-,#,)0& ) -0& 5-)46,#7-#7.,+ #8 #+,+7+ '-+*08--,!(*-,8 /-9,#2-,#7#-:+*-/-9,#$;-#, (#'( ### #")(#&*###*#"'+& #')(,"( ## "! )# & -##"#"( # &.## #"##/"#"( 0 (&0("#0#) (#1( %')) ####")" 0#) &) ')( *##" &)#"#" &"$)##" &&)## #"##/ #"'"*#&&%"#( #)( &)## #"##/ & '"*#& ' ("###"")# ##( # 0#) "))####& )*+ #### ' ) 0#) 收稿日期 修回日期 基金项目 国家自然科学基金资助项目 &$ 陕西省社会发展科技攻关项目 &$'$' 陕西省科技统筹创新工程计划资助项目 &5%; +! &,-#,&,+,"-#" '#!,-#8;-#, &$ "-#",#!%"#7+"8,,#-+:-#" &$'$' ;+!-#,-:,#!6##:,-:,#+"*8 "-#",#!%"#7+ 7+,-#,,#-+:-#" &5%; 通信作者 魏光兵 主治医师 4,--7,#7-#7$" 优先出版 #*"#-#"*!,-$$$!"#

2 期 余钧辉 孙学军 郑见宝 等 %&' 通过 )# ",#-# 信号通路促进结肠癌细胞的增殖 结直肠癌是目前最为常见的恶性肿瘤之一 其全球范围的综合发病率在恶性肿瘤中男性排名第 女性排名第 近年来随着生活水平的提高 饮食习惯的改变 结直肠癌的发病率在我国呈逐年增长的趋势 年 我国结直肠癌新发病例数 万 死亡病例数 $ 万 分别位居恶性肿瘤发病率和肿瘤 相关死亡率的第 位和第 位 然而 结直肠癌的发病机制仍未完全阐明 目前的研究发现炎症微环 境与肿瘤的发生及进展密切相关 %&' 是肿瘤 炎症微环境中重要的促炎症细胞因子 目前研究表明 炎症中升高的 %&' 可促进结直肠癌细胞的 侵袭和转移 关于 %&' 对结直肠癌细胞增殖的影响目前鲜有报道 高度保守的 )# ",#-# 信号通路在动物胚胎的早期发育 器官形成 组织再生和其他生理过程中 具有重要的作用 且 )# ",#-# 信号通路异常地激活及表达对肿瘤的发生及发展都起到至关重 $ 要的作用 肠上皮炎症损伤中 %&' 与异常激 活的 )# ",#-# 信号通路密切相关 本实验拟研究 %&' 对结肠癌细胞增殖的影响 并探讨其可能的作用机制, 材料与方法,, 主要试剂和仪器 %&' 购自美国.* * 公司 6$ 培养基购自美国 ;+#-#7 公司 胎牛血清购自法国 -* 公司 /01 购自美国 " 公司 %% 购自美国 -7, 公司 ",#-# """"-#. 及 0.( 均购自美国,#,;+< 公司,- 方法,-, 细胞培养及 %&' 处理 人结肠癌细胞株 (% 为本实验室长期保存 采用 6$ 培养基 含 胎牛血清 于 = ;> 培养箱中培养 每天观察并更换细胞培养液 次 待细胞长满约?? 时用 7 胰蛋白酶消化传代 取生长状态良好的对数生长期细胞用于实验 实验分为实验组 %&'# 和对照组 ;#+,-- %% 法 将人结肠癌细胞株 (% 个孔接种于 $ 孔板中 实验分组同上 每组设 个复孔 未接种细胞的孔中加入 6$ 培养基作为调零孔 接种后 $ 各检测 次 每孔加入 %% 继续在培养箱中孵育 用酶标仪检测其 # 处吸光度值 0 实验重复 次,-. 细胞生长曲线法 将人结肠癌细胞株 (% 个 孔接种于 $ 孔板中 实验分组同上 每组设 个复孔 接种后 $ 分别细胞计 数 实验重复 次,-/ 流式细胞仪检测细胞周期 接种前 换为无血清培养 后再换成含 胎牛血清的 6$ 培养基 个 孔接种人结肠癌细胞株 (% 于 $ 孔板中 实验分组同上 用胰酶消化收集各组细胞并用预冷 洗涤 次 +-# -# 次 弃上清加入 A= 预冷的 冰乙醇 固定细胞置于 = 冰箱过夜 检测前离心 +-#-# 洗涤 次 加入 并将细胞吹悬 用含 7&,* 和 7 碘化丙啶 6= 处理细胞 -# 过 目尼龙网 送流式细胞仪检测 实验重复 次,-0 ) *+# 个 孔接种人结肠癌细胞株 (% 于 $ 孔板中 实验分组同上 后收集各组细胞提取细胞总蛋白并用 ;0 法检测总蛋白浓度 每组样本取 进行.0 垂直电泳 湿转法将胶中蛋白水平转移至 1.' 膜上 7 脱脂牛奶在 = 摇床上封闭 先后分别加入 %% 稀释后的一抗 = 过夜 二抗 经 4; 显影凝胶成像系统扫描采用相关图像分析软件 -+,!,#- ># ;0 进行条带灰度分析 0.( 作为参照蛋白 实验重复 次,. 统计学方法 采用 统计学分析软件 实验数据以均数 B 标准差 B 表示 两组间比较采用两样本 检验 多组间比较采用单因素方差分析 >#, 0&>10 两两比较采用.## 检验 为差异有统计学意义 - 结 果 -1, 对结肠癌细胞增殖的影响 本研究采用细胞生长曲线和 %% 法 研究 %&' 对结肠癌细胞 (% 增殖的影响 如图 0 所示 相比对照组细胞 实验组细胞 %&'# 的生长速度在 没有统计学差异 均 而在 $ 明显增快 均 差异有统计学意义 结果提示 %&' 具有促进结肠癌细胞增殖的作用 -1- 对结肠癌细胞周期的影响 为了进一步研究 %&' 促进结肠癌细胞增殖的作用机制 本实验采用流式细胞仪检测 %&' 对结肠癌细胞周期的影响 如图 0 相比对照组细胞 实验组细胞 # 中 期细胞明显减少 期细胞明显增多 期细胞比例没有统计学差异 研究结果表明 %&' 促进结肠癌细胞增殖的作用可能通过加速细胞周期 转化有关!"#

3 $ 西安交通大学学报 医学版 第 卷 对结肠癌细胞中 ",#-#"" 及 ""-#. 表达的影响 相比对照组 实验组细胞 %&'# 中 ",#-#"" 及 ""-#. 的蛋白表达明显升高 差异具有统计学意义 均 图 0 研究结果表明 %&' 可能通过激活 )# ",#-# 信号通路从而促进结肠癌细胞的增殖 -1/. 通过抑制 信号通路减弱 对结肠癌细胞增殖的作用 为了进一步研究 )# ",#-# 信号通路在促进结肠癌细胞增殖的作用 本研究采用 /01 阻断 )# ",#-# 信号通路后 观察 %&' 对结肠癌细胞增殖及 )# ",#-# 信号通路相关蛋白的作用 如图 0 所示 细胞生长曲线和 %% 法显示相比 %&' 组细胞 %&'C/01 组结肠癌细胞增殖在 均没有统计学差异 而在 $ 明显增快 均 表明 /01 减弱了 %&' 对结肠癌细胞增殖的促进作用 与上述功能性研究一致 ) *+# 图, 对结肠癌细胞增殖的影响 '-7 48"8+, #- %&' #+-8+,-#8"#",#"+" * 0 生长曲线实验 %% 实验 -1. 通过 信号通路促进结肠癌细胞的增殖 本研究采用 ) *+# 检测对 %&' 结果显示 相比 %&' 组细胞 %&'C/01 组结肠癌细胞中 ",#-#"" 及 ""-#. 的蛋白表达上调明显抑制 差异具有统计学意义 均 图 0 表明 /01 减弱了 %&' 对细胞 ", #-#"" 及 ""-#. 等蛋白的促进作用 上述研究结果进一步表明 %&' 可能通过 )# ",#-# 信号通路促进结肠癌细胞的增殖 图 - 对结肠癌细胞 - 细胞周期的影响 '-748"8+, #-%&'#" ""!-*+--#8"#",#"+" * 0 流式细胞仪检测 细胞周期分布. 讨 论近年来 我国结直肠癌的发病率持续地增长 已经成为我国最为严重的恶性肿瘤之一 目前研究表明结直肠癌的发生是多因素 多步骤相互作用的复杂 过程 肿瘤炎症微环境在结直肠癌发生发展中的作用受到越来越多的重视 结肠癌肿瘤中聚集的淋巴细 胞及巨噬细胞与血管的形成密切相关 %&' 是 由巨噬细胞分泌的一种促炎症细胞因子 是肿瘤炎症微环境中关键的介质 更是被认为是肿瘤形成的的危 险因子 本研究发现给予结肠癌细胞 # %&' 处理后 细胞的生长速度明显快于对照组细胞 进一步的细胞周期分析提示 # %&' 处理后可明显加速结肠癌细胞 转化 因此 可以推测 %&' 促进结肠癌细胞增殖可能与其加速细 胞 转化有关 3( 等研究表明在胆囊癌中!"#

4 期 余钧辉 孙学军 郑见宝 等 %&' 通过 )# ",#-# 信号通路促进结肠癌细胞的增殖 图. 对结肠癌细胞 - 中 & 及 &#, 蛋白表达的影响 '-7 48"8+, #- %&'#",#-#"",#!""-#.+-# +**-#*8(%" * 0) *+# 条带 各组 ",#-#"" 及 ""-#. 蛋白表达的比较 与对照组相比 图 0. 阻断 信号通路对 促进细胞 & 及 &#, 蛋白表达的影响 '-748"8",7 8 )# ",#-#,, /01#",#-#"",#!""-#.+-# +* *-#* #,#"!%&' 0) *+# 条带 各组 ",#-#"" 及 ""-#. 蛋白表达量比较 >(6'' 信号通路促进肝癌细胞的增殖 与侵袭 因此 作为肿瘤炎症微环境中关键的促炎因子 %&' 通过调控肿瘤细胞增殖 在多种肿瘤的形成及进展中发挥着重要的作用 )# ",#-# 信号通路的异常激活 引起 ",#-# 的核转位及靶基因的续贯激活 是结直肠癌 发生发展中最重要的分子事件之一 )# ", #-# 信号通路激活与肿瘤细胞的致瘤性 增殖和侵袭 等生物学功能密切相关 本实验结果发现 %&' 促进结肠癌细胞中 ",#-#"" 及 ""-#. 蛋白的表达 用 /01 阻断 )# ",#-# 信号通路后 逆转了 %&' 对结肠癌细胞增殖的促进作用 ) *+# 结果显示 /01 减弱了 %&' 对结肠癌细胞 ",#-#"" 及 ""-#. 等蛋白的促 图 /. 阻断 信号通路对 促进细胞增殖的影响 '-748"8",7 8 )# ",#-#,, /01#" +-8+,-# #,#"!%&' 0 生长曲线实验 %% 实验 下调 %&' 的表达可明显抑制细胞的增殖 在胰腺导管腺癌中 %&' 可促进肝素结合细胞因子 -!-# 的 表达 进而促进细胞的增殖 在肝癌中 %&' 通过 进作用 上述研究证实 %&' 可能通过 )# ",#-# 信号通路促进结肠癌细胞的增殖 研究报道 炎症微环境中 %&' 可通过多种信 $ 号通路或途径促进细胞增殖 3(> 等报道在常染色体显性遗传的多囊性肾病中 %&' 可通过 4505;! 和 6505%%> 分别引起转录因子 6! 的核转位和表达升高 进而转录抑制 的表达 从而促进细胞的增殖 在结肠癌中!"#

5 西安交通大学学报 医学版 第 卷 %&' 可通过促进纤维母细胞分泌 ;>/ 产生更多的 4 进而影响结肠癌细胞的增殖 且可能通 过 5; 途径 目前 关于 %&' 激活 )# ",#-# 信号通路 的分子机制尚不清楚 ;>5& 等研究发现 %&' 可下调 ;./ 的表达 进而导致 ",#-# 降解复合物 0;5 和 0-# 的降低 从而引起 ",#-# 的核转位和下游靶基因的激活 另外 有研究报道在结肠癌中 ;./ 可与 ",#-# 直接结合 抑制 ",#-#%;' 复合物的转录活性 抑制靶基因 "" 和 ""-#. 的表达 从而抑制结肠癌细 胞的增殖 然而 %&' 激活 )# ",#-# 信号通路的分子机制仍有待于完整的研究 这也是本实验接下来的研究方向 参考文献 +$!!2/23$*2&-# #"#" ""$#"" 4) +5-'&2-# $$& 陈万青 郑荣寿 张思维 等 & 年中国恶性肿瘤发病和死亡分析 & 中国肿瘤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编辑 胡爱玲 上接第 $ 页 $$*2'$*!$32$2$*2/$&) ( (( ### "# " )& #(& /53$26.$++$3&,"8"+/+# " ) "# # & $ (*$$$& /52$%!&2.#",) #)"##"#1#)## &%+1$$& '3 6.2' +6*' -&#" */+#&."#-*/ " &*8$& $+% */52$%!$$3 %&-(" ),"")")#" #1"#)""# ",)&-%$& 编辑 国 荣!"#

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