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1 2017 年 11 月第 37 卷第 11 期文章编号 : ( 2017 ) 基础医学与临床 Basic & Clinical Medicine November 2017 Vol.37 No.11 研究论文 COX 2 表达下调抑制人结肠癌细胞系 HT 29 增殖并促进凋亡 刘海云 1 ꎬ 钟睿 2 ꎬ 谢琛 2 ꎬ 王侠 2 2 ꎬ 何志坚 (1 江西中医药大学基础医学院 ꎬ 江西南昌 ꎻ 2 江西省肿瘤医院放疗四科 ꎬ 江西南昌 ) 摘要 : 目的探讨环氧化酶 2(COX 2) 表达对大肠癌细胞 HT 29 细胞的细胞活力 增殖和凋亡等生物学行为的影响 ꎮ 方法利用脂质体将 sirna COX 2 及空载体转入 HT 29 大肠癌细胞中 ꎬ 并设立对照组 ꎮ 48 h 后 ꎬreal time PCR 法检测 COX 2 Bcl 2 Bax 和基质金属蛋白酶 2(MMP2) mrna 表达 ꎻWestern blot 检测 COX 2 及 p AKT 表达 ꎻCCK 8 法检测细胞活力 ꎻAnnexin V / PI 流式双染检测细胞凋亡 ꎻ 流式细胞计量术检测细胞周期 ꎻ 划痕实验及 Transwell 实验分别检测细胞迁移和侵袭能力 ꎮ 结果与对照组及空载体组比较 ꎬCOX 2 抑制组 COX 2 蛋白及 mrna 表达量显著降低 (P<0 01)ꎻ 细胞活力下降 (P<0 01)ꎻ 细胞凋亡率提高 ꎬ 细胞周期阻滞于 G 期 ꎬ 细胞迁移及侵袭能力降低 ( P< 0 01)ꎻBcl 2 及 MMP2 mrna 表达下调 (P<0 01)ꎻBax mrna 表达上调 (P<0 01)ꎻp AKT 蛋白表达下调 (P<0 01)ꎮ 结论 COX 2 表达量下调后能显著的抑制细胞增殖 迁移与侵袭 ꎬ 并诱导细胞凋亡 ꎬ 可能与下调 p AKT 有关 ꎮ 关键词 : 环氧化酶 2(COX 2)ꎻ 大肠癌 ꎻHT 29ꎻ 生物学行为中图分类号 :R735 3 文献标志码 :A Down regulation of COX 2 expression inhibits proliferation and promotes apoptosis in human colon cancer cell line HT 29 LIU Hai yun 1 ꎬ ZHONG Rui 2 ꎬ XIE Chen 2 ꎬ WANG Xia 2 ꎬ HE Zhi jian 2 (1 Basic Medical Schoolꎬ Jiangxi University of Chinese Medicineꎬ Nanchang ꎻ 2 Dept. of Radiotherapyꎬ Tumor Hospital of Jiangxi Provinceꎬ Nanchang ꎬ China) Abstract: Objective To explore effect of cyclooxygenase 2 ( COX 2) expression on cell viabilityꎬ proliferationꎬ apoptosis and other biological behavior of human colon cancer cell line HT 29. Methods The expression of COX 2 was examed by Western blot and real time PCR after sirna COX 2ꎬ empty body was transferred into human color ectal cancer cell line HT 29 by liposome. Cell viability was measured by CCK 8 method. Cell apoptosis and cell cy cle was measured by flow cytometry. Cell migration and invasion was detected by scratch test and Transwell methodꎬ respectively. The expression of Bcl 2ꎬ Baxꎬ matrix metalloproteinase 2 ( MMP2) was measured by real time PCR. The level of protein kinase B ( AKT) phosphorylation was measured by western blot. Results Compared with the control group and empty vector groupꎬ the expression of COX 2 protein and mrna was decreased ( P<0 01) ꎬ cell viability was reduced ( P<0 01) ꎬ cell apoptotic rate was increased ( P<0 01) ꎬ cell cycle was arrested in G phase ( P < 0 01) ꎬ cell migration and invasion ability was decreased ( P < 0 01)ꎬ the expression of Bcl 2ꎬ MMP2 mrna and p AKT protein was down regulated (P<0 01)ꎬ the expression of Bax mrna was up regulated 收稿日期 : 修回日期 : 基金项目 : 江西省自然科学基金 (20142BAB205109) 通信作者 (corresponding author):hezhij13@ 163.com

2 刘海云 COX 2 表达下调抑制人结肠癌细胞系 HT 29 增殖并促进凋亡 1569 in COX 2 inhibition group (P<0 01). Conclusions Down regulation of COX 2 expression can significantly inhibit HT 29 cell proliferationꎬ migration and invasionꎬ and induce cell apoptosisꎬ which may be related to the down reg ulation of AKT phosphorylation. Key words: cyclooxygenase 2 ( COX 2) ꎻ colorectal cancerꎻ HT 29ꎻ biological behavior 大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一 ꎬ 近些年来随着人们生活方式 饮食习惯及环境的变化 ꎬ 大肠癌的发病率逐年上升 [1 2] ꎮ 目前对于大肠癌的治疗主要是采取手术切除 ꎬ 但是由于早期诊断敏感性低 ꎬ 患者预后较为不理想 ꎬ 术后的 5 年生存率仅在 50% 左右 [1 2] ꎮ 因此进一步深入了解大肠癌的发病机制 ꎬ 探讨大肠癌发生发展中关键标志物对于大肠癌的诊断及治疗将具有重要意义 ꎮ 环氧化酶 2( cy clooxygenase 2ꎬCOX 2) 是一种诱导型蛋白 ꎬ 是由位于染色体 1q 的应答基因所编码的 ꎮ COX 2 不仅是启动炎性反应的关键元件 ꎬ 还在众多肿瘤的发生发展中起着重要作用 [3 4] ꎮ 研究表明 COX 2 在大肠癌中高表达 ꎬ 并与肿瘤的临床分期 ꎬ 淋巴结转移密切相关 ꎬ 是大肠癌的独立预测因子 [3] ꎮ 但是 COX 2 在大肠癌的发生发展过程中的作用还尚未可知 ꎬ 因此本研究将探讨 COX 2 对大肠癌细胞 HT 29 增殖 凋亡 细胞周期 迁移和侵袭的影响及相关机制 ꎮ 1 材料与方法 1 1 材料 细胞系 : 人大肠癌细胞 HT 29( 中国科学院上海细胞库 )ꎮ 主要试剂 : sirna COX 2 载体 PRNA U6 1 sicox214 和无关序列 sirna( 广州锐博技术有限公司 )ꎻ 兔抗人 COX 2 多克隆抗体 ( Abcam 公司 )ꎻ 兔抗人 AKT p AKT 和 β actin 单克隆抗体 (Cell Signal Technology 公司 )ꎻ 胎牛血清和 DMEM 培养基 (Hyclone 公司 )ꎻAnnexin V FITC / PI 流式双染试剂盒和细胞周期检测试剂盒 ( 南京凯基生物技术有限公司 )ꎻ Trizol 总 RNA 提取试剂盒 Lipofectamine TM 2000 脂质体 HiFiScript cdna 第一链合成试剂盒和 UItraSYBR Mixture( 康为世纪生物科技有限公司 )ꎮ 1 2 方法 细胞转染及分组 : 当 6 孔板中的 HT 29 细胞汇合度达到 80% 时候 ꎬ 利用脂质体 Lipofectamine TM 2000 将 sirna COX 2 载体 PRNA U6 1 sicox214 (COX 2 抑制组 ) 和无关序列 sirna( 空载体组 ) 转入细胞中 ꎬ 培养 6 hꎬ 换成无血清的培养基 ꎬ 并利用 Western blot 及 real time PCR 检测转染效果 ꎬ 另外设立不转染任何质粒的对照组 ꎮ Real time PCR 检测 COX 2 Bcl 2 Bax 及 MMP2 mrna 的表达 : 根据 Trizol 试剂盒提取细胞总 RNAꎬ 并检测总 RNA 纯度 ꎬ 并将得到的 RNA 通过反转录 ( HiFiScript cdna 第一链合成试剂盒 ) 合成 cdnaꎬ 最后 real time PCR 进行扩增 ꎬ 扩增结果利用 2 -ΔΔCt 法进行分析 ꎮ CCK 8 法检测细胞活力 : 将 个 HT 29 细胞接种到 96 孔板 ꎬ 培养 24 hꎬ 按 进行转染 ꎬ 培养 48 hꎬ 加入 10 μl 的 CCK 8 试剂 ꎬ 孵育 4 h 后 ꎬ 利用酶标仪检测波长 570 nm 处的 A 值 ꎬ 所测 A 值即细胞活力 ꎮ Annexin V FITC / PI 流式细胞计量术检测细胞凋亡 : 将 个 HT 29 细胞接种到 6 孔板 ꎬ 培养 24 h 后 ꎬ 按 进行转染 ꎬ 培养 48 h 后 ꎬ 每组收集 个 / ml 细胞 ꎬ 按流式细胞仪说明书检测 ꎬ 1 h 内在流式细胞仪上进行细胞凋亡分析 ꎮ 流式细胞计量术检测细胞周期 : 将 个 HT 29 细胞接种到 6 孔板 ꎬ 培养 24 h 后 ꎬ 按 进行转染 ꎬ 继续培养 48 h 后 ꎬ 每组收集 个 / ml 细胞 ꎬ 按流式细胞计量术说明书检测 ꎬ 在流式细胞仪中进行细胞周期的分析检测 ꎮ 划痕实验检测细胞迁移能力 : 首先在 6 孔板的背面用 marker 笔划横线 ꎬ 横线横穿过孔 ꎬ 备用 ꎮ 将 个 HT 29 细胞接种到标记过横线的 6 孔板中 ꎬ 培养 24 h 后 ꎬ 用枪头垂直于背面横线而划线 ꎬ 并用 PBS 将划下来的细胞洗去 ꎮ 接着按 进行转染 ꎬ 培养 48 h 后 ꎬ 于显微镜下观察拍照 ꎮ Transwell 法检测细胞侵袭能力 : 实验前将 Matrigel 胶均匀的平铺于 Transwell 小室的微膜上 ꎬ 备用 ꎮ 将 个 HT 29 细胞接种到 6 孔板后 ꎬ 按 进行转染 ꎬ 培养 48 h 后 ꎬ 将细胞接种到

3 1570 基础医学与临床 Basic & Clinical Medicine (11) Transwell 的上室 ꎬ 而下室仅仅加入含有 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基 ꎬ48 h 后 ꎬ 将 Transwell 小室取出固定 ꎬ 染色 ꎬ 在倒置显微镜下进行观察并计数 ꎬ 即为细胞的侵袭数目 ꎮ Western blot: 收集细胞并裂解 ꎬ 离心收获上清液即是总蛋白 ꎬ 测定蛋白浓度 ꎬ 蛋白煮沸变性 ꎬ 上样 ꎬ 进行 SDS PAGEꎬ 湿法转膜 ꎮ 2% 的 BSA 室温下孵育 1 hꎬ 一抗溶液 ( 兔抗人 COX 2 多克隆抗体 ꎬ 兔抗人 AKT p AKT 和 β actin 单克隆抗体 ꎬ 稀释度均为 1 100) 4 过夜孵育 ꎬ 次日于二抗溶液孵育 1 ~ 2 hꎬ 在凝胶成像系统中曝光 ꎮ 1 3 统计学分析所有数据均用 SPSS 17 0 软件进行统计分析 ꎬ 用均数 ± 标准差 (x±s) 表示 ꎬ 采用 t 检验分析 2 组之间数据差异性 ꎮ 2 结果 2 1 sirna COX 2 在大肠癌细胞 HT 29 中的表达与对照组及空载体组比较 ꎬCOX 2 抑制组中 COX 2 蛋白及 mrna 表达量均显著降低 (P<0 01) ( 图 1)ꎮ 2 2 sirna COX 2 对 HT 29 细胞活力及凋亡情况的影响与对照组及空载体组比较 ꎬCOX 2 抑制组细胞活力显著降低 (P<0 01)ꎬ 早期凋亡率及晚期凋亡率均显著提高 (P<0 01)( 图 2AꎬB)ꎮ 2 3 sirna COX 2 对 HT 29 细胞细胞周期的影响与对照组及空载体组比较 ꎬCOX 2 抑制组细胞周期阻滞在 G 1 期 (P<0 01)( 图 2Cꎬ 表 1)ꎮ 2 4 sirna COX 2 对 HT 29 细胞迁移及侵袭能力的影响与对照组及空载体组比较 ꎬCOX 2 抑制组细胞迁移距离显著降低 (P<0 01) ( 图 3)ꎮ 与对照组 (123± 11) 及空载体组 (125±12) 比较 ꎬCOX 2 抑制组 (51±5) 细胞侵袭数目显著降低 (P<0 01)( 图 3)ꎮ 2 5 sirna COX 2 对 HT 29 细胞中 Bax Bcl 2 及 MMP2 mrna 表达量的影响与对照组及空载体组比较 ꎬCOX 2 抑制组 Bcl 2 及 MMP2 mrna 表达下调 (P<0 01)ꎬBax mrna 表 P<0 01 compared with control and empty vector 图 1 sirna COX 2 对大肠癌细胞 HT 29 中 COX 2 mrna 及蛋白表达量的影响 Fig 1 Effect of sirna COX 2 on the expression of COX 2 mrna and protein in colorectal cancer cell HT 29(x±sꎬ%ꎬn = 3) 达上调 (P<0 01)( 图 4)ꎮ 2 6 sirna COX 2 对 HT 29 细胞中 AKT 磷酸化水平的影响与对照组及空载体组比较 ꎬ COX 2 抑制组 p AKT 表达量显著下调 (P<0 01)( 图 5)ꎮ 3 讨论本研究首先利用 Western blot 及 real time PCR 证实 sirna COX 2 转染成功 ꎮ 接着发现 sirna COX 2 能显著降低细胞活力 ꎬ 提高细胞早期和晚期凋亡率 ꎬ 与 COX 2 在其他肿瘤细胞中的作用效果类似 [5 7] ꎮ 而肿瘤细胞的凋亡受限源自于肿瘤细胞的无限增殖 ꎬ 细胞周期的不可控 ꎬG 1 ꎬG 2 及 S 期是肿瘤细胞周期的关键调控点 ꎬ 是多种肿瘤药物的作用靶

4 刘海云 Fig 2 图2 control empty vector COX 2 inhibition sirna COX 2 对 HT 29 细胞活力 凋亡和细胞周期的影响 Effect of sirna COX 2 on cell viabilityꎬ apoptosis and cell cycle in colorectal cancer cell HT 29( x±sꎬ ꎬn 3) Fig 1 group 表1 sirna COX 2 对 HT 29 细胞细胞周期的影响 Effect of sirna COX 2 on colorectal cancer cell HT 29 cell cycle ( x±sꎬ ꎬn 3) G 1 phage 48 38±4 90 60 92±6 04 G 2 phage S phage 49 60±4 96 P<0 01 compared with control and empty vector. 1571 COX 2 表达下调抑制人结肠癌细胞系 HT 29 增殖并促进凋亡 30 69±3 70 32 67±3 48 29 74±2 77 19 71±1 97 18 95±1 90 9 34±0 92

5 1572 基础医学与临床 Fig 3 图3 Basic Clinical Medicine 2017 37(11) sirna COX 2 对 HT 29 细胞迁移和侵袭能力的影响 Effect of sirna COX 2 on colorectal cancer cell HT 29 cell migration and invasion ability( 200) ( x±sꎬ ꎬn 3) P<0 01 compared with control and empty vector Fig 4 图4 sirna COX 2 对 HT 29 细胞中 Bax Bcl 2 和 MMP2 mrna 表达量的影响 Effect of sirna COX 2 on the expression of Baxꎬ Bcl 2 and MMP2 mrna in colorectal cancer cell HT 29( x±sꎬ ꎬn 3) 点 [8 9] ꎮ 细胞的迁移及侵袭是肿瘤患者术后失败的 说明 sirna COX 2 能显著的降低 HT 29 细胞活力 患者的预后将具有重大的改善作用ꎮ 所以本研究继 细胞的凋亡受到细胞凋亡相关基因的严格调 主要原因之一ꎬ因此抑制肿瘤细胞的迁移侵袭对于 诱导细胞凋亡 抑制细胞增殖 迁移及侵袭ꎮ 续探讨 sirna COX 2 对 HT 29 细胞周期 迁移及侵 控ꎬBcl 2 家族是其中一种ꎮ 其中 Bcl 2 是最常见的 滞在 G 1 期ꎬ 能 显 著 降 低 细 胞 迁 移 及 侵 袭 能 力ꎬ 与 体ꎬ阻 断 凋 亡 信 号 传 递ꎬ 促 进 细 胞 的 存 活 与 增 值ꎮ 袭的影响ꎬ结果表明 sirna COX 2 能使细胞周期阻 COX 2 在其他肿瘤细胞中的作用一致 [6ꎬ10 13] ꎮ 从而 抑制凋亡蛋白ꎬ能与促凋亡蛋白 Bax 形成异源二聚 Bax 自身还能形成同源二聚体ꎬ将凋亡信号传递到

6 刘海云 COX 2 表达下调抑制人结肠癌细胞系 HT 29 增殖并促进凋亡 1573 P<0 01 compared with control group and empty vector group 图 5 sirna COX 2 对 HT 29 细胞中 p AKT 表达量的影响 Fig 5 Effect of sirna COX 2 on the expression of p AKT in colorectal cancer cell HT 29 (x±sꎬ%ꎬn = 3) caspase 家族 ꎬ 诱导细胞凋亡 ꎮ 细胞外基质的降解是肿瘤细胞的迁移侵袭过程中的关键因素 ꎬ 这一过程主要是由 MMPs 蛋白水解酶所介导 ꎮ 其中 MMP2 不仅能够降解包括 Ⅳ 型胶原在内的所有基质成分 ꎬ 还能够诱导血管新生促进肿瘤细胞扩散浸润 ꎮ 而细胞的增殖 凋亡 细胞周期 迁移及侵袭受多种信号通路的调控 ꎬ PI3K / AKT 信号通路就是其中一种 [14 15] ꎮ PI3K 接收到外界信号刺激后 ꎬ 能磷酸化磷脂酰二磷酸磷脂酰肌醇 ( PIP2) 的 3 羟基使之转化为使之成为三磷酸磷脂酰肌醇 ( PIP3)ꎬ 并促使 AKT 转位到细胞膜 ꎬ 被激活并磷酸化 ꎬ 活化后的 AKT 进而调控下游靶蛋白 ( Bcl 2 家族及 MMPs) 表达 ꎬ 进而参与细胞的增殖 凋亡和侵袭等生物学行为 ꎮ 因此本研究进一步的探讨 sirna COX 2 对 HT 2 细胞中 Bcl 2 Bax MMP2 及 p AKT 表达的影响 ꎬ 结果表明 sirna COX 2 下调 Bcl 2 MMP2 mrna 及 p AKT 蛋白表达 ꎬ 上调 Bax mrna 表达 ꎮ 综上所述 ꎬsiRNA COX 2 能显著降低 HT 29 细胞活力 诱导细胞凋亡 阻滞细胞周期 抑制细胞迁移及侵袭 ꎬ 与下调 Bcl 2 及 MMP2 表达 ꎬ 上调 Bax 表达有关 ꎬ 是通过抑制 AKT 磷酸化实现的 ꎮ 参考文献 : [1] 杜圣富 ꎬ 夏国园. 大肠癌的相关因素和早期症状研究进展 [J]. 医药导报 ꎬ 2016ꎬ35: [2] 张骅 ꎬ 张民. 大肠癌内镜诊断的研究进展 [J]. 中国老年学杂志 ꎬ 2015ꎬ35: [3] Lu Jꎬ Li XFꎬ Kong LXꎬ et al. Expression and significance of cyclooxygenase 2 mrna in benign and malignant ascites [ J]. World J Gastroenterolꎬ 2013ꎬ19: [4] 刘智豪 ꎬ 刘叔文 ꎬ 余乐. COX 2 抑制剂联合抗肿瘤的研究进展 [J]. 中国药理学通报 ꎬ 2012ꎬ28: [5] 钱永 ꎬ 邵益森 ꎬ 曹钟义 ꎬ 等. COX 2 在舌鳞癌细胞 Tca8113 增殖机制中的作用 [ J]. 口腔医学研究 ꎬ 2012ꎬ 28: [6] 钟英强 ꎬ 黄花荣 ꎬ 刘娟 ꎬ 等. sirna 沉默 COX 2 基因对人胰腺癌 Capan 2 细胞增殖 细胞周期 凋亡和成瘤能力的影响 [J]. 中国病理生理杂志 ꎬ 2011ꎬ27: [7] Sato Aꎬ Mizobuchi Yꎬ Nakajima Kꎬ et al. Blocking COX 2 induces apoptosis and inhibits cell proliferation via the Akt / survivin and Akt / ID3 pathway in low grade glioma[ J]. J Neurooncolꎬ 2017ꎬ132: [8] Cadoni Gꎬ Boccia Sꎬ Petrelli Lꎬ et al. A review of genetic epidemiology of head and neck cancer related to polymor phisms in metabolic genesꎬ cell cycle control and alcohol metabolism[ J]. Acta Otorhinolaryngol Italꎬ 2012ꎬ32:1 11. [9] Olszewska Mꎬ Bujarski JJꎬ Kurpisz M. P bodies and their functions during mrna cell cycle: mini review [ J]. Cell Biochem Functꎬ 2012ꎬ30: [10] Setiawati Aꎬ Setiawati A. Celecoxibꎬ a COX 2 selective inhibitorꎬ induces cell cycle arrest at the G2 / M phase in HeLa cervical cancer cells[j]. Asian Pac J Cancer Prevꎬ 2016ꎬ17: [11] Zhong Yꎬ Xia Zꎬ Liu Jꎬ et al. The effects of cyclooxygen ase 2 gene silencing by sirna on cell proliferationꎬ cell apoptosisꎬ cell cycle and tumorigenicity of Capan 2 human pancreatic cancer cells [ J ]. Oncol Repꎬ 2012ꎬ 27: [12] Che XHꎬ Chen CLꎬ Ye XLꎬ et al. Dual inhibition of COX 2/ 5 LOX blocks colon cancer proliferationꎬ migration and invasion in vitro[ J]. Oncol Repꎬ 2016ꎬ35: [13] 赵云 ꎬ 李媛媛 ꎬ 张宝刚 ꎬ 等. 小 RNA 干扰降低 COX 2 表达对乳腺癌细胞趋化和侵袭能力的影响 [J]. 肿瘤防治研究 ꎬ 2011ꎬ38: [14] Tokuhira Nꎬ Kitagishi Yꎬ Suzuki Mꎬ et al. PI3K / AKT / PTEN pathway as a target for Crohn s disease therapy (Re view)[j]. Int J Mol Medꎬ 2015ꎬ35: [15] Toren Pꎬ Zoubeidi A. Targeting the PI3K / Akt pathway in prostate cancer: challenges and opportunities ( review ) [J]. Int J Oncolꎬ 2014ꎬ45:

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