胥丰恺 等 ( 与食管鳞形细胞癌增殖和迁移关系的体外研究!,, - (1 1/ <! &<! 食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤 在中国 食管癌发病率位列第五 死亡率位列第四 病理 类型以鳞形细胞癌为主 发病率显著高于腺癌 由于食管癌易于迁移和转移的特性 尽管数十年来食管癌的诊治水平在不断提高 但其五
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- 右 尚
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1 复旦学报 医学版 (,/ 与食管鳞形细胞癌增殖和迁移关系的体外研究 胥丰恺 古 杰 王 琳 卢春来 葛 棣 袁云锋 蒋家好 复旦大学附属中山医院胸外科 上海 摘要 目的 探讨钙蛋白酶小亚基 1( 在食管鳞形细胞癌细胞系中的表达水平 分析其与食管鳞形细胞癌细胞增殖和迁移能力的相关性 方法 挑选人正常食管上皮细胞系 及食管鳞形细胞癌细胞系 与 应用 1 检测细胞系中 ( 蛋白质水平 应用 )( 干扰下调 与 中 ( 的表达水平 通过! 与 / 实验分别检测细胞增殖与迁移能力的变化 同时用 1 检测细胞系中增殖和迁移相关蛋白质水平 结果 ( 在 与 中的蛋白质水平显著高于 下调 与 中 ( 蛋白质水平后 细胞增殖与迁移能力均显著降低! 蛋白质水平下调 结论 ( 在食管鳞形细胞癌中高表达 促进食管癌增殖和迁移 并与下游分子! 的表达水平密切相关 关键词 食管鳞形细胞癌 钙蛋白酶小亚基 增殖 迁移 中图分类号 ) 文献标识码 (!! (,/ & 8 & & -!8 ( &! (!(!& (&! & &!!! &&!&! / & 1( & & & 1 ( /& & &&& 8 1 & ( & 8 (& && )( / & 1 & 8 8 ( 1 & & ( 8 & ( &1!! &!(( ( &&! & 1 国家自然科学基金 复旦大学附属中山医院人才培养计划 复旦大学卓学计划 &! &!&&
2 胥丰恺 等 ( 与食管鳞形细胞癌增殖和迁移关系的体外研究!,, - (1 1/ <! &<! 食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤 在中国 食管癌发病率位列第五 死亡率位列第四 病理 类型以鳞形细胞癌为主 发病率显著高于腺癌 由于食管癌易于迁移和转移的特性 尽管数十年来食管癌的诊治水平在不断提高 但其五年生存率并 未得到显著改善 因此 深入研究影响食管鳞形细胞癌迁移和转移的相关机制 具有重要的临床意义 钙蛋白酶 ( 为一组保守的半胱氨酸蛋白酶 在生物体内广泛表达 该分子具有钙依赖活性 并与细胞骨架重塑 细胞存活以及细胞迁 移密切相关 有研究表明 在一些肿瘤细胞中 ( 出现异常表达 例如 等 发现 ( 在黑色素瘤中表达下调 而上调 ( 水平可显著降低黑色素瘤细胞的增殖能力 等发现 ( 在子宫颈鳞状上皮逐步癌变进展过程中表达水平呈阶梯式上升 钙蛋白酶小亚基 1( 为! 的调 控亚基 影响胚胎早期的细胞死亡水平 目前已有报道在肝细胞癌 肝内胆管细胞癌 肾透明细胞癌 神经胶质瘤 鼻咽癌 非小细胞肺癌等肿瘤中 ( 的表达上调 并影响肿瘤细胞的迁移或增 殖能力 然而 目前国内外尚无相关文献报道 ( 在食管鳞形细胞癌中的相关研究 本研究拟检测 ( 在食管鳞形细胞癌细胞系中的表达水平 以探究其与食管癌迁移和增殖的相关性 材料和方法 细胞培养与转染 人正常食管上皮细胞系 人食管鳞形细胞癌细胞系 与 培养均使用 胎牛血清 于 9, 孵箱中培养 与 细胞系培养达到 密度时 按照 说明书予以转染 )(!( 正义链 :! (( (( (//!: 反义链 :! ((( ( //!: 上海 拓然生物科技有限公司 对照组 )(! 为非特异性非相关的 )( 片段 转染对应 )( 片段后 & 进行! 与 / 实验 & 收集细胞总蛋白 与 (() 实验 通过 / 实验来检测细胞迁移能力 不同细胞 个 以 无血清培养液重悬后 接种于 / 上室 小室 聚碳酸酯膜 下室内加入 含 血清的 培养液 培养 & 后取出上室 无菌棉签擦去上室培养液与未穿透的细胞 结晶紫染色 于倒置显微镜下随机选取 个视野进行计数 通过! 实验来检测细胞增殖能力 细胞接种于 孔板 转染对应 )( 片段后 &&& & 分别于对应孔中加入! 试剂 混匀孵育 & 采用酶标仪测定其在 的吸光度 细胞总蛋白提取与 检测 以 ) ( 裂解细胞 9 下 离心 后取上清液 取 样品于十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 转至聚偏二氟乙烯膜 用含 脱脂奶粉的 / //! /! 溶液封闭 & 加入对应一抗于 9 孵育过夜 以 / / 洗涤 次后 加入二抗于室温孵育 & 再以 / / 洗涤 次后 采用 试剂曝光显色 应用一抗如下! )! & ( 1(1! & 1 (1 ; &! (, / ) 统计学方法 采用 统计软件对结果进行分析 每项实验重复 次 采用 检验比较各实验组之间结果的差异 为差异具有统计学意义 结 果 食管鳞形细胞癌细胞系中 (,/ 蛋白质水平上调 1 结果显示 ( 在 与 细胞系中的蛋白表达水平比 细
3 复旦学报!医学版!! 年 ) 月 &! &! 胞系中的高出约 > ) 倍差异 具 有 统 计 学 意 义! ( > 转 染 AH@1@JH 后 ;1 与 CB,;) 细胞系 中 1@JH 的 蛋 白 表 达 水 平 显 著 下调约 倍差异均具有统 计 学 意 义! (> 图 & I R 9 < 8 T9 ;;1;1 CB,;)>G8 8 R V -VRR ( 8 :8 L I > >!(>!!(> > 图!!@JDG 在 LWW@ W@!MU 与 APEW!M 细胞系中的 蛋白表达水平及?D 干扰效果 F [ /LWW@ W@!MU-/( 1!!B -/(, )?D / /, APEW!M, /!! 表达 水 平 抑 制 食 管 鳞 形 细 胞 癌 细 胞的迁移与增殖能力! 通 过 G R 实 验检 测 肿 瘤细胞的迁移能力结果显 示下 调 1@JH 的 表 达 后 ;1 与 CB,;) 细 胞 系 的 迁 移 能 力 较 对 照 组显著下降! (> 图!@通 过 11C 实验检 G8< I R 8 G R!!!@ : R : 测肿 瘤 细 胞 的 增 殖 能 力结 果 显 示 ;1 细 胞 系 <: > G89 I R 8 R 于干扰 1@JH 后 8 起 增 殖 能 力 显 著 低 于 对 照!(! 8 >1 11C 组 CB,;) 细胞系于干扰 1@JH 后(!8 起增殖 能力显著低于对照组! (> 图!& L I R 9 < U 88 与 >>J I 表达水平密切相关! 结 果 显 示 下 调 ;1 与 CB,;) L I 细胞系中 1@JH 蛋白质水平 后J!蛋白质水 平显著下调 ; 8 与 Y< 蛋白质水平未 见明显变化!图!1& R T9 ( V -VR 1@JH> >!(>!!(> > : 图 I! 后 W@!MU 与 APEW!M 细胞系迁移与增 殖能力下降相关蛋白 >>J I 表达水平下调 F ()/ /1@JDG /W@!MU-/(APEW!M 1I! 19 ) )/-/(8 )/-:, /( ( -/( 1 ( ( ) / >>J I()/ ( 19
4 胥丰恺 等 ( 与食管鳞形细胞癌增殖和迁移关系的体外研究 讨 论 恶性肿瘤增殖与迁移是一个多步骤的复杂过 程 也是导致患者死亡的主要原因 ( 为一种钙蛋白酶小亚基 在调节 ( 的稳定性和 活性过程中起到非常重要的作用 在成纤维细胞中 ( 缺失可造成细胞迁移率降低 并造成 细胞黏附的异常 故有研究者推测 ( 可 能影响肿瘤细胞的迁移 等最早在肝细胞癌肝移植患者中研究 ( 的作用 并发现 ( 的过表达可促进肝细胞癌患者肝移植后的肿瘤迁移与远处转移 此外 在肝内胆管细胞癌 肾透明细胞癌 神经胶质瘤 鼻咽癌 非小细胞肺癌等肿瘤中 ( 均被证明表达上调 并影响肿瘤细胞的迁移或增殖能力 对于恶性肿瘤进展具有非常重要的 意义 本研究采用 1 法来检测人正常食管上皮细胞系 以及食管鳞形细胞癌细胞系 与 中 ( 的蛋白质水平 结果发现 与 中 ( 的蛋白质显著高于 这与既往报道 ( 在多种其他恶 性肿瘤中的研究结果一致 提示 ( 在食管鳞形细胞癌细胞中高表达 我们在体外实验研究中 利用! 和 / 检测食管鳞形细胞癌增殖和迁移能力 结果显示 )( 干扰下调 ( 表达后 肿瘤细胞的增殖与迁移能力均显著降低 既往文献报道中 在不同的恶性肿瘤中 一致发现 ( 能促进肿瘤细胞迁移 但对于细胞增殖能力的影响尚存在 争议 等发现在肝细胞癌中 ( 能同时 显著促进肿瘤细胞增殖与转移 而 & 等研究肝内胆管细胞癌中 ( 的作用 发现 ( 虽然能显著促进肿瘤细胞迁移与转移能力 但与肿瘤细胞的增殖能力无显著相关性 不同肿瘤类型的差异可能造成 ( 作用的差异 本研究结果与 等的结果一致 并提示 ( 蛋白质水平与食管鳞形细胞癌的增殖与迁移能力呈正相关 该分子可能在食管鳞形细胞癌进展过程中起到重要作用 影响恶性肿瘤进展与转移的的机制包括 上皮! 间质转化 &!& / 肿瘤细胞黏附 蛋白水解酶降解组织屏障 等 本课题组前期研究结果证明 ( 能够 通过调节! 以调节非小细胞肺癌的迁移能 力 & 等在鼻咽癌中发现一致的结果 家族是一类锌依赖的肽链内切酶 参与细胞外基质降解和新生血管的形成等过程 已被证实与恶性肿瘤细胞进展与转移密切相关 在本研究中 我们下调 ( 表达水平后 发现食管鳞形细胞癌细胞系内! 蛋白质水平显著下调 而 / 的标志物! & 与 ; 蛋白质水平未见明显变化 推测 ( 有可能通过调节! 的 表达从而促进食管鳞形细胞癌增殖与迁移 今后会进一步探究 目前 食管癌的非手术治疗以放 化疗为主 大量研究致力于探寻食管癌靶向治疗的靶点 目前已有报道 ) ) ;!/ (8 /,) 等通路的靶向药物已完成 期临床研究 但是结果并不令人满意 目前应用于临床的靶向药物如尼妥珠单抗 西妥昔单抗等 均为针对 ) 的靶向药物 但临床疗效尚无确切依据 深入研究 ( 影响食管癌侵袭和转移的信号通路和相关机制 将助于有望研发针对性的靶向药物 为食管癌治疗提供新的方向 综上所述 本研究结果证明 ( 在食管鳞形细胞癌细胞中高表达且促进食管鳞形细胞癌细胞增殖与迁移 并与下游分子! 的表达水平密切相关 因此我们将深入研究 ( 与食管癌迁移和增殖的相关分子信号通路 寻找相关的节点分子 这将具有重要的临床意义 参 考 文 献 /,))()( )1 ),! ()) ; ) ;( ), & & & ) (( )(( ) (;! 1 & &1 1 )(, //, ) ( ) 8 &,!!, /,, ; /& &!
5 复旦学报 医学版 年 月,) //,, &! &!!!!,) //, ((; (!! &, & & &, & &, (( )) ((, (! 1 & 1 1, /! & ()/) (,) & & /! ( ) ( & 1& (,, 1 & & 1 & ( &, &! ( (, & ( ( ( - & & & - )( &, (- )! &!! (-( && &!(& - 8 &!!! - (,! ) /) ) & /!&! /! &)! ) /) ) /88 8 ( ( ;;, ), ( /& 1!1 & 11,!! ()/ 8 &, 赖霄晶 郑晓 毛伟敏 食管癌靶向治疗的研究进展 肿瘤学杂志 收稿日期 编辑 王蔚
材 料 方 法 统 计 学 分 析 体 外 作 用 对 细 胞 增 殖 的 影 响
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