746 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2015,46(6): 第 46 卷 ThisstudywassupportedbyNingxiaNaturalScienceFoundation 牗 No.NZ14077 牘 恶性肿瘤是威胁人类

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1 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity 2015,46(6): 乌索酸通过抑制 mir 21 表达诱导肝癌 HepG2 细胞凋亡的机制 1,2 1 2 刘昆梅, 郭乐, 奚涛 ( 1 宁夏医科大学颅脑疾病重点实验室, 银川 ; 2 中国药科大学生命科学与技术学院, 南京 ) 摘要探讨乌索酸通过调控 mir 21 表达从而诱导肝癌 HepG2 细胞凋亡的作用机制 采用 MTT 方法检测乌索酸对肝癌细胞增殖的抑制作用 ;qpcr 检测肝癌细胞中 mir 21 的表达水平及乌索酸对 HepG2 细胞中 mir 21 表达的调控作用 ; 转染 mir 21mimics 进 HepG2 细胞中上调 mir 21 的表达后,MTT 流式细胞检测法 RT PCR 方法分别分析 mir 21 在乌索酸对细胞的增殖 凋亡以及对凋亡相关基因的调控过程中的作用 结果显示, 与肝正常细胞 L 02 以及肝癌 SMCC 7721 Bel 7402 细胞相比较, 乌索酸对肝癌 HepG2 细胞的增殖抑制效果最强, 且 HepG2 细胞中 mir 21 的表达水平最高 乌索酸可下调 HepG2 细胞中 mir 21 的表达, 且在 24h 的下调作用最强 mir 21 的表达上调可以部分抵消乌索酸对 HepG2 细胞的抑制增殖及促进凋亡, 部分抵消下调凋亡抑制基因 Bcl 2 survivin 表达和上调促凋亡基因 Bax 表达的作用 结果提示, 乌索酸通过抑制 mir 21 的表达诱导肝癌 HepG2 细胞凋亡 关键词 乌索酸 ; 肝癌细胞 ;mir 21; 增殖 ; 凋亡 中图分类号 R285 5 文献标志码 A 文章编号 (2015) doi: /j.isn Mechanism study on apoptosis ofhepatocelularcarcinoma HepG2 cels inducedbyursolicacidthroughinhibitingtheexpressionofmir 21 LIUKunmei 1 牞 2 牞 GUOLe 1 牞 XITao 2 1 NingxiaProvincialKeyLaboratoryofCerebrocranialDiseases 牞 NingxiaMedicalUniversity 牞 Yinchuan 牷 2 SchoolofLifeScienceandTechnology 牞 ChinaPharmaceuticalUniversity 牞 Nanjing 牞 China Abstract ThisstudyaimedatinvestigatingtheefectofmiR 21ontheapoptosisofhepatocelularcarcinoma HepG2celsinducedbyursolicacid 牗 UA 牘.MTTasaywasusedtodeterminetheinhibitionefectofursolicacid onproliferationofhepatocelularcarcinomacels.theexpresionlevelofmir 21inhepatocelularcarcinoma celsandtheregulationefectofursolicacidontheexpresionofmir 21inHepG2celsweredeterminedby qpcr.toup regulatetheexpresionofmir 21 牞 mir 21mimicsweretransfectedintoHepG2cels.ThenMTT asay 牞 flowcytometry 牗 AnnexinV FITCstaining 牘牞 andrt PCRwereusedtodetecttheregulationefectsofursolic acidontheproliferation 牞 apoptosis 牞 andtheexpresionofapoptosis relatedgenesaftermir 21over expresion. TheresultsshowedthattheproliferationinhibitionefectofursolicacidonHepG2celsandtheexpresionlevel ofmir 21inHepG2celswerehigherthaninhepaticcelL 02andhepatocelularcarcinomaSMCC 7721 牞 Bel 7402cels.SofurtherstudywasperformedintheHepG2cels.UrsolicacidinhibitedtheexpresionofmiR 21in HepG2cels.Andthegreatestinhibitionefectwasat24haftertreatmentwithUA.Over expresionofmir 21 partialyofsettheefectsofursolicacidontheproliferation 牞 apoptosis 牞 andtheexpresionofapoptosis related genessuchasbcl 2 牞 survivinandbaxafter24h.theresultssuggestedthatapoptosisofhepatocelularcarcinoma HepG2celscouldbeinducedbyursolicacidbydown regulatingtheexpresionofmir 21 Keywords ursolicacid 牷 hepatocelularcarcinomacels 牷 mir 21 牷 proliferation 牷 apoptosis 收稿日期 通信作者 Tel: E mail:guoletian1982@163 com 基金项目 宁夏自然科学基金资助项目 (No.NZ14077)

2 746 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2015,46(6): 第 46 卷 ThisstudywassupportedbyNingxiaNaturalScienceFoundation 牗 No.NZ14077 牘 恶性肿瘤是威胁人类健康的第二大杀手, 仅次于心血管疾病 从全球范围内来看, 肝癌是最常见的五大恶性肿瘤之一, 每年约有 90 万人群受到其影响,70 万患者被肝癌夺去生命, 其肿瘤致死率在各类癌症中高居第 3 位 [1] 早期预防和治疗是防治肝癌的关键, 而化学治疗仍然是治疗的主要手段 乌索酸 (ursolicacid,ua) 又名熊果酸, 属于五环三萜类化合物, 广泛存在于自然界多种植物中, 如山楂 熊果 陆英等 研究证明其具有多种生物学活性, 包括抗菌 抗氧化 免疫调节等作用 近年来发现乌索酸可通过诱导肿瘤细胞的凋亡而抑制其增殖, 包括肝癌 乳腺癌 前列腺癌 肺癌 黑色素瘤和子宫内膜癌等 [2-3] 值得注意的是, 乌索酸同时被证明具有良好的肝保护作用 [4], 因此乌索酸这类既能诱导肝癌细胞凋亡, 并能有效保护正常肝细胞的化合物, 是抗肝癌药物研究的热点 mir 21 是目前研究较为深入的一种 mirna, 研究表明, 其与肿瘤相关的细胞增殖 凋亡 侵袭和转移都有联系, 在多种肿瘤细胞中过表达, 试验敲除 mir 21 可以减少癌变 [5], 因此,miR 21 作为一个潜在的抗凋亡因子受到广泛的关注 有文献报道,miR 21 参与调控的信号通路与乌索酸凋亡机制有交叉点 [6], 为研究 mir 21 在乌索酸的凋亡机制中的调控作用提供了理论基础 本课题组前期研究表明乌索酸可促进 HepG2 细胞的凋亡 [7], 本研究针对乌索酸对肝癌细胞的促凋亡作用和 mir 21 对肿瘤细胞的抗凋亡作用, 研究两者之间的联系, 深入研究乌索酸的抗肿瘤作用机制, 为后续研究抗肿瘤药物靶点提供理论基础 材料 1 1 药品与试剂乌索酸 (UA, 纯度大于 99 8%, 受赠于宜春学院陈武教授 ); 胎牛血清 RPMI 1640 和 DMEM( 美国 Gibco 公司 ); 胰酶 ( 美国 Amersco 公司 ); 噻唑兰 MTT 和二甲基亚砜 DMSO( 美国 Sigma 公司 ); 总 RNA 提取试剂 Trizol 转染试剂 Lipofectamine 2000 凋亡检测试剂盒 ( 上海 Invitrogen 公司 ); mir 21qPCR 引物试剂盒 EzOmicsSYBR qpcr kits mir 21mimics( 南通百奥生物技术公司 ); 实验中所用的各引物 DNA 均合成于上海生工生物工程有限公司, 其序列见表 1 Table1 PrimersequencesusedforRT qpcr Gene Sequences(5 3 ) Annealing Length/ temperature/ bp C Survivin CGACGTTGCCCCCTGCCTG AAGGAAAGCGCAACCGGACGA Bcl 2 TGTGTGTGGAGAGCGTCAACC TTCAGAGACAGCCAGGAGAAATC Bax TCAGGATGCGTCCACCAAGAA TCCCGGAGGAAGTCCAATGTC GAPDH AAGGTCGGAGTCACCGGATT CTGGAAGATGGTGATGGGATT 1 2 细胞株人肝细胞 L 02 肝癌细胞株 HepG2 人肝癌细胞株 SMCC 7721 和人肝癌细胞株 Bel 7402( 中国药科大学郭青龙教授惠赠, 本实验室继以保存 ), 所有细胞均培养于含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基中 1 3 仪器 PowerWaveXS2 全波长酶标仪 ( 美国 Bio Tek 公司 );CFX96 荧光定量 PCR 仪 ( 美国 Bio Rad 公司 );FACSCalibur 流式细胞仪 ( 美国 BD 公司 ) 方法 2 1 MTT 法测定 UA 对人肝癌细胞的增殖抑制率将细胞 ( 活细胞率超过 95%) 接种于 96 孔培养板, 每孔 个细胞, 空白孔不接种细胞 待细胞培养 24h 证实贴壁后去掉培养基, 加入不同浓度 (10,20,40,60μmol/L) 的 UA, 阴性孔加入含 0 3% DMSO 的无血清培养基作为溶剂对照, 空白孔则加入无血清培养基作为对照, 每孔 200μL, 细胞分别培养 48h 后吸去培养基, 每孔加入 5mg/ mlmtt20μl, 孵育 4h 弃上清液, 每孔加入 DMSO150μL, 酶标仪测定 490nm 处的吸收度, 按计算细胞生长抑制率并作图计算 IC 50 每个剂量浓度设 3 个平行孔 2 2 qpcr 检测 mir 21 在人肝细胞 L 02 和人肝癌细胞中的表达水平采用 Trizol 试剂, 按照说明书的方法提取各细胞总 RNA, 取总 RNA1μg 以 mirnartprimer 逆

3 第 46 卷第 6 期 刘昆梅等 : 乌索酸通过抑制 mir 21 表达诱导肝癌 HepG2 细胞凋亡的机制 747 转录合成 cdna 以 cdna 为模板, 选用 U6RNA 作为内参照, 使用 EzOmicsSYBR qpcr kits 扩增 mir 30a, 通过 Real timepcr 法对 mir 30a 进行相对定量 反应条件为 :95 5min,95 30s, 61 30s(30 次 ),72 10min 2 3 qpcr 检测 UA 对 mir 21 在人肝癌 HepG2 细胞中表达水平的影响加药组加入 30μmol/LUA, 对照组加入 0 3% DMSO, 分别培养 24 和 48h 后收集细胞, 提取 RNA 后 qpcr 检测 mir 21 的表达水平差异 qpcr 步骤同 2 2 项 2 4 MTT 方法检测 mir 21 过表达对 UA 抑制肝癌 HepG2 细胞增殖作用的影响将 HepG2 细胞 ( 活细胞率超过 95%) 接种于 6 孔培养板, 每孔含 个细胞, 待细胞培养 24h 证实贴壁后用 Lipofectamine2000 转染试剂盒将 50nmol/LmiR 21 mimics 和阴性对照 RNA(NC RNA) 转染入肝癌 HepG2 细胞上调 mir 21 表达水平 qpcr 检测 mir 21 mimics 在人肝癌 HepG 细胞中转染效率 转染 24h 后消化细胞重新铺 96 孔板 MTT 方法检测抑制率,MTT 具体步骤见 2 1 项 2 5 流式细胞仪检测 mir 21 过表达对 UA 抑制肝癌 HepG2 细胞凋亡作用的影响将 HepG2 细胞 ( 活细胞率超过 95%) 接种于 6 孔培养板, 每孔含 个细胞, 待细胞培养 24h 证实贴壁后用 Lipofectamine2000 转染试剂盒将 50nmol/L mir 21 mimics 和 NC 转染入肝癌 HepG2 细胞上调 mir 21 表达水平,NCRNA 作为阴性对照 转染 24h 后加入 20 和 30μmol/LUA 处理 24h, 按照凋亡检测试剂盒步骤处理细胞后上流式细胞仪检测 2 6 RT PCR 检测 mir 21 过表达对 UA 抑制凋亡相关基因表达作用的影响用 Lipofectamine2000 转染试剂盒将 50nmol/L mir 21 mimics 和 NC 转染入肝癌 HepG2 细胞, 转染 24h 后加入 10,20,30,40μmol/LUA 处理 24h, 采用 Trizol 试剂, 按照说明书的方法提取总 RNA, 取总 RNA1μg 以 OligodT18 逆转录合成 cdna 以 cdna 为模板, 选用 GAPDH 作为内参, 用 survivin 和 Bcl 2 验证引物进行平行 PCR 扩增 PCR 条件如下 :95 预变性 5min;95 变性 30s,54 退 火 30s,72 延伸 1min, 循环 30 次 ;72 再延伸 7min 反应产物进行琼脂糖电泳检测 2 7 统计学分析结果数据以 x±s 珋标准差表示, 用 SPSS 统计软件进行数据分析, 分析用 t 检验,P<0.05 被认为具有统计学意义 结果 3 1 UA 对人肝癌 HepG2,SMMC 7721,Bel 7402 细胞的增殖抑制作用为了检测 UA 对人肝癌细胞生长增殖情况的影响, 通过 MTT 法检测了细胞在经 UA 处理之后的存活情况 结果 ( 图 1) 显示,48h 处理后, 随着剂量的增加,UA 对肝癌 HepG2 Bel 7402 SMCC 7721 细胞生长的抑制作用呈浓度依赖性的增加, 且 UA 对 HepG2 细胞的增殖抑制作用最为显著, 当药物浓度高于 20μmol/L 时 HepG2 细胞的存活率与阴性对照相比有极其显著性差异 (P<0 01) 加权回归法计算半数生长抑制浓度 (IC 50 ) 显示, HepG2 Bel 7402 SMCC 7721 细胞在 48h 的 IC 50 分别为 (28 8±2 12),(35 8±1 73) 和 (39 6± 3 13)μmol/L, 证明 UA 对 HepG2 细胞的细胞增殖抑制作用最强 3 2 mir 21 在肝癌 HepG2,SMMC 7721,Bel 7402 细胞中高表达 qpcr 方法检测 mir 21 在肝细胞 L 02 和肝癌细胞中的表达水平, 结果 ( 图 2) 显示 : 与 L 02 相比, mir 21 在不同肝癌细胞中都有不同程度的表达上调, 其中,HepG2 Bel 7402 SMCC 7721 细胞中 mir 21 的表达量分别是 L 02 的 和 1 5 倍, 结果表明 HepG2 细胞中 mir 21 表达水平最高 3 3 UA 下调 HepG2 细胞中 mir 21 的表达水平在 3 种肝癌细胞中,UA 对 HepG2 细胞的增殖抑制作用最强, 且 mir 21 在 HepG2 中的表达量最高, 所以利用 HepG2 细胞作为后续实验对象 采用 UA 对 HepG2 细胞的 IC 50 浓度 30μmol/L 作为加药浓度, 处理 24 和 48h 后检测 mir 21 的表达水平变化 qpcr 结果 ( 图 3) 显示 : 在有效浓度 30μmol/LUA 的作用下,miR 21 的表达下调, 但是表达变化不呈时间依赖性,24h 表达下调 50%, 48h 表达下调 30%, 结果表明 UA 在 24h 对 mir 21 的表达抑制效果最强

4 748 学报 J C P m U 1 5 4 6 6 7 4 5 7 5 第4 6卷 F 1 I d UA m H G A B 7 4 B ds MCC 77 1 C w d m d m m C w d dw d UA w d dw d d 1 T w d m E w 3 P 5 P 1 珋± F E m 1 m m d mrt PCR T m dm 1 L w 1 3 P 1 L 珋± F 4 A C w d m d m m M 1 dnc w d H G A 4 w dw UA C w d dw UA w d dw d d 1 T w d m P B R mpcr m 1w 5 dm 1 m m NC H G 珋± 3 P 1 NC 3 5 m 1过 表 达 部 分 消 除 了 UA 促 进 肝 癌 H G细胞凋亡的作用 为了证实 m 1对 UA促进 H G细胞凋亡 1转染入细胞提高 m 1的 作用的影响 把 m 表达 水 平 NC RNA作 为 阴 性 对 照 由 于 UA 在 F 3 E m 1 H G dw 3 LUA 4 d48m d mrt PCR μm 珋± 3 P 1 4对 m 1表达下调作用最强 所以流式细胞 仪方法检测 4时 UA对两组细胞的凋亡率 结 3 4 m 1过 表 达 部 分 消 除 了 UA 抑 制 肝 癌 与 3 μm LUA处理两组细胞 果如图 5所示 H G细胞增殖的作用 4后 转染 m 1细胞的细胞凋亡率 UR为晚 为了证实 m 1对 UA抑制 H G细胞增殖 期凋亡 LR为早期凋亡 凋亡率为两者之和 分别 1 m m 转 染 入 细 胞 提 高 作用的 影 响 把 m 7 93 和 4 33 与阴性对照组细胞相比显 是1 m 1的表达水平 图 4 B NCRNA作为阴性对 著性降低 照 由于 UA在 4对 m 1表达下调作用最强 3 6 m 1过表达部分消除了 UA抑制凋亡相关 所以 MTT方法检测 4时 UA对两组细胞的增殖 B 和 B 表达的作用 基因 抑制 率 结 果 显 示 图 4 A 当 药 物 浓 度 高 于 为了进一步证实 m 1对 UA促进 H G细 μm L时 UA对转染 m 1细胞的增殖抑制 胞凋亡作用的影响 转染 m 1后用不同浓度的 率与阴性对照相比显著性降低 UA处理 4 RT PCR检测凋亡抑制基因

5 第 46 卷第 6 期 刘昆梅等 : 乌索酸通过抑制 mir 21 表达诱导肝癌 HepG2 细胞凋亡的机制 749 和 bcl 2 和促凋亡基因 Bax 的 mrna 表达水平变化 结果如图 6 所示,UA 处理未转染 mir 21 的 HepG2 细胞后,survivin 和 Bcl 2 呈浓度依赖性下 调,Bax 呈浓度依赖性上升, 而转染了 mir 21 后, UA 对 survivin 和 Bcl 2 的下调作用和对 Bax 的上调作用明显下降 Figure5 (A)Extentofapoptosisasesedbyflowcytometryanalysis;(B)quantificationoftheflowcytometryanalysis( 珋 x±s,n=3) P<0 01vsNCgroup Figure6 UAsuppresesthemRNAexpresionofbcl 2,survivinand baxinaconcentration dependentmanner.hepg2 celswhich were transfectedwithmir 21mimicsorNCweretreatedwithorwithoutUA (10,20,30,40μmol/L)for24h,andtotalRNAwasextractedand examinedbyreverse transcriptasepcr 讨论目前认为, 肝肿瘤细胞的发生演化是一个多基因 多因素 多阶段的过程 [1] 当细胞凋亡被认定为肿瘤细胞恶变的一个重要原因后, 越来越多的研究开始集中在诱导肿瘤细胞凋亡的层面 目前很多天然的化合物被发现能有效诱导肿瘤细胞的凋亡, 这其中也包括 UA [8] 研究认为 UA 能诱导多种体外培养的肿瘤细胞凋亡并抑制肿瘤增殖, 但其具体机制尚未明确 mirna 是近几年抗肿瘤研究热点之一, 研究发现 mirna 在肿瘤的发生发展中起着重要作用, 如参与肿瘤转移 凋亡 血管生成以及耐药性等 [9] mir 21 是最早研究与肿瘤凋亡相 关的 mirna,mir 21 在多种肿瘤中过表达, 与肿瘤细胞抗凋亡作用密切相关 [10] 本课题研究证实了 mir 21 在多种肝癌细胞中高表达 UA 处理 24h 后,miR 21 的表达水平降低 并且, 增加细胞中 mir 21 的表达可以部分消除 UA 对细胞增殖的抑制作用 对细胞凋亡的促进作用以及对抗凋亡基因表达的下调作用, 说明 mir 21 参与了 UA 的抗肿瘤作用机制, 为后续抗肿瘤药物靶点研究提供理论基础 MicroRNA(miRNA) 是一类由内源基因编码的长度约为 22 个核苷酸的非编码单链 RNA 分子, 其作用机制是与靶 mrna 不完全互补结合, 在蛋白质翻译水平上抑制其表达 本研究表明 mir 21 在 UA 的促凋亡过程中的作用可能与上调抗凋亡基因 Bcl 2 和 survivin 有关 细胞凋亡可依赖于线粒体和死亡受体信号传导通路 绝大多数细胞凋亡是通过线粒体信号通路来实现的, 并受到一系列基因的调控,Bcl 2 家族是该途径的主要调节者,bcl 2 属于 Bcl 2 家族中的抗凋亡基因 Bcl 2 能阻断引起细胞凋亡的最后通路, 通过防止受损 DNA 翻译成参与细胞凋亡基因的信号, 或者通过阻止这些基因产物的活动, 起到保护这些细胞的作用 [11]

6 750 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2015,46(6): 第 46 卷 survivin 基因一个凋亡抑制基因, 作为 IAP 家族的一个成员,survivin 是目前发现的抗凋亡作用最强的分子之一 [12] 有研究表明 Bcl 2 是 mir 21 的直接靶基因,miR 21 的过表达可上调 Bcl 2 的表达 [13] 而 survivin 基因是否是 mir 21 的直接靶基因还需进一步的探讨 实验结果表明,miR 21 的过表达可以部分消除 UA 对肝癌 HepG2 细胞的增殖抑制作用 促凋亡作用以及对凋亡抑制基因的下调作用 但是, 并没有完全消除 UA 的促细胞凋亡作用, 说明在 UA 促肝癌 HepG2 细胞凋亡过程中还存在其他的分子机制和作用靶点, 有待进一步研究 参考文献 [1] CristinaB,FedericaT,CarloLV.Hepatocelularcarcinomaepi demiology[j].bestpractresclingastroenterol,2014,28(1): [2] GaoY,LiZ,XieX,etal.Dendrimericanticancerprodrugsfor targeteddeliveryofursolicacid tofolatereceptor expresing cancercels:synthesisandbiologicalevaluation[j].eurjpharm Sci,2015,70:55-63 [3] WangJS,ShenJ,ZhangT,etal.Ursolicaciddownregulates COX 2expresionbysuppresingtheactivationofERKinA549 cels[j].jchinapharmuniv( 中国药科大学学报 ),2011,42 (1):68-72 [4] SaravananR,ViswanathanP,PugalendiKV.Protectiveefectof ursolicacidonethanol mediatedexperimentalliverdamagein rats[j].lifesci,2006,78(7): [5] WangY,GaoX,WeiF,etal.Diagnosticandprognosticvalueof circulatingmir 21 forcancer:asystematicreview andmeta analysis[j].gene,2014,533(1): [6] HanZ,ChenF,GeX,etal.miR 21aleviatedapoptosisofcorti calneuronsthroughpromotingpten Aktsignalingpathwayin vitroafterexperimentaltraumaticbraininjury[j].brainres, 2014,1582(1):12-20 [7] TangC,LuYH,XieJH,etal.Downregulationofsurvivinand activationofcaspase 3throughthePI3K/Aktpathwayinursolic acid inducedhepg2celapoptosis[j].anticancerdrugs,2009, 20(4): [8] VoiculescuM,WinklerRE,MoscoviciM,etal.Chemotherapies andtargetedtherapiesinadvancedhepatocelularcarcinoma: fromlaboratorytoclinic[j].jgastrointestinliverdis,2008,17 (3): [9] HataA,LiebermanJ.DysregulationofmicroRNAbiogenesisand genesilencingincancer[j].scisignal,2015,8(368):re3 [10]BuscagliaLE,LiY.ApoptosisandthetargetgenesofmicroRNA 21[J].ChinJCancer( 癌症 ),2011,30(6): [11] AklH,VervloesemT,KiviluotoS,etal.Adualrolefortheanti apoptoticbcl 2proteinincancer:mitochondriaversusendoplas micreticulum[j].biochimbiophysacta,2014,1843(10): [12] AltieriDC.Survivin theinconvenientiap[j].seminceldev Biol,2015,39(1):91-96 [13] XuLF,WuZP,ChenY,etal.MicroRNA 21(miR 21)regulates celularproliferation,invasion,migration,andapoptosisbytarge tingpten,reckandbcl 2inlungsquamouscarcinoma[J]. PLoSOne,2014,9(8):e103698

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