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1 第 卷 期 # 年 ## 月 :)6( ) >? <=( 8@ 0)@ # 对胃癌细胞凋亡影响的体外研究 ( 天津医科大学肿瘤医院消化肿瘤内科, 国家肿瘤临床医学研究中心, 天津市 肿瘤防治 重点实验室, 天津市恶性肿瘤临床医学研究中心, 天津 )!"#! 24"#$% &' $%&%#!"# ()*+,-./0! 1' () *+,7 -".7.",/7.",// 89(:;-. 01 $%&%# '89 <=>?@ABC"DE BC ;?+FGH( "2 -. I'J7 K'JLMNO-. &'K 01 $%&%# 01 89! <4H#2 OPQRS 561 -". '*+, 89R ",/7.",// ' H+2 TK $%&% UVWXY 5EH2<=>?@ABCEQ Y $%&% Z6[ I'J7 K'J"#\]LM^ _ U!" $%&% 01 89`PQab+2$%&%# BC'1895G_ =4c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胃癌是消化系统常见恶性肿瘤之一, 其死亡率 # 位于恶性肿瘤第二位 虽然胃癌治疗方式有一定进展, 但预后并没有得到相应的改善 近年来, 肿瘤治疗进入了靶向治疗新时代, 随着对胃癌发生 发!"#$%& '()*+,-./ 01+(23456!78, -49:;!"4#$%&' 展分子机制的深入探索, 靶向药物在胃癌中的应用 逐渐增多, 但尚未有突破性的结果, 因此寻找新的治疗靶点具有重要的临床意义 微小 01 C01 是一种小分子非编码 01, 可通过与靶基因 01 分子, 非翻译区 (,6(< ;),8> 结合而影响肿瘤细胞的生物学行为 位于人 # 号染色体上, 属于 01, 簇, 已证实在肾细胞癌 肝细胞癌 神经胶质瘤及乳腺癌等多种

2 .- 第. 卷 恶性肿瘤中表达上调, 参与调控细胞增殖 凋亡 分 化等病理生理过程 有文献报道 在胃腺癌中高表达, 并通过与抑制素基因靶向结合而抑制 胃癌细胞生长 笔者前期的研究表明 在胃癌中表达显著上调, 进一步的预后分析显示 高表达者预后欠佳 以上研究结果提示 在胃癌中可能发挥了癌基因的作用 叉头框蛋白 (!"#$%& '! ""!!" (, )*() 是 )* 家族中研究较为成熟的一员, 在肿瘤或其他疾病中发挥了重要的作用 研究表明, )*( 在一些肿瘤中可作为 +, 的靶基因, 如在乳腺癌中, ( 及 可以协同靶向抑制 )*( 表达, 进而促进了细胞增殖并 (- 参与了细胞周期转换 在肺癌中,.(( 通过沉 (( 默 )*( 表达促进肺癌细胞增殖 基于上述研究背景, 本实验旨在探讨 对胃癌细胞株 /01-( 的凋亡作用, 同时研究敲低 )*( 对胃癌细胞凋亡的影响, 并对 与 )*( 的关系进行验证与分析, 以期为胃癌治疗新靶点提供理论依据 (( 人胃腺癌细胞株 /01-( 购自北京协和医科大学细胞资源中心 ;"! %%,! %% --- %% 购自美国 2"!% 公司 ;/345 6"%/"5 +, 购自大连宝生物公司 ; 质粒 对照质粒 $'!" 质粒 $'!" 对照质粒 )*( 质粒及 )*( 对照质粒均购自上海吉玛公司 ;)*( 一抗购自美国,' 公司 ; 辣根酶标记山羊抗兔 0 购自美国 / 1"9 公司 ; 报告基因质粒购自美国 6"!& 公司 ; 细胞凋亡,% :)1;6 试剂盒购自美国 4 公司 ( (( 细胞培养和转染 /01-( 细胞培养于含有 (- 的胎牛血清的 67. 培养液, 置于 1 饱和湿度的培养箱中 取生长状态良好的细胞, 于转染前一天将细胞接种于培养皿中, 按照说明书用! %% 转染试剂盒分别转染 7 质粒,7 对照质粒, 7 $'!" 质粒,7 $'!" 对照质粒,7)* 质粒及 7)* 对照质粒, 细胞培养.<. $ 后进行后续的实验 == 流式细胞仪检测细胞凋亡率 7,% :;6 双染色法收集胃癌细胞 /017-( 到 (- > 的离 心管中, 每样本细胞数为 (- ;>,( --- "; 离心 后弃去培养液 用孵育缓冲液洗涤 ( 次, ( --- "; 离心 用 (-- > 的标记溶液重悬细胞, 室温下避光孵育 (,( --- "; 离心 沉淀细胞? 孵育缓冲液洗 ( 次 加入,% :7)1@6 溶液,. 下孵育 - 最后补.-- > 64/, 随即进行流式细胞仪检测,,% :7)1 为绿色荧光,6 为红色荧光 加入,% :7)1@6 溶液. 下孵育 -, 避光并不时振动 随即进行流式细胞仪分析, 流式细胞仪激发光波长., 用波长 ( 的通带滤器检测 )1 荧光, 用波长大于 - 的滤器检测 6 凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如 6 有抗染性, 坏死细胞则无此特性 细胞膜有损伤的细胞的 +, 可被 6 着染产生红色荧光, 而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生 因此, 在细胞凋亡的早期 6 不会着染而没有红色荧光信号 正常活细胞与此相似 ( A%%" '! 检测 41>7 >1 >1 及 )*( 蛋白表达收集转染后. $ 的 /017-( 细胞, 加入 6, 细胞裂解液后离心收集 /017-( 细胞中总蛋白, 经 (-7(//76,0B 电泳后转至 6:) 膜上,. 脱脂牛奶封闭 ( $ 后, 加入一抗,. 孵育过夜 4/7 洗去一抗, 辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育 ( $,4/7 洗涤 次,B1> 试剂盒显影, 以 7 作为内参 (==. 双荧光素酶报告基因试验根据生物信息学预测结果得到 7 的潜在靶基因 )*(, 同时得到 7 在 )*( 基因 C 中结合位点, 将含有靶位点的 C 序列及突变型 C 序列进行全基因合成, 然后将目的序列构建至荧光素酶报告基因载体 D 将 7 表达质粒单独转染或者与荧光素报告载体共转染至 /017-( 细胞 转染后. $ 以酶标仪检测荧光素酶的活性 ( +, 的提取及 %7% 61 检测采用 "! 试剂提取 /017-( 细胞总 +,D ( 琼脂糖凝胶电泳鉴定 +, 质量 根据 /34 5 6"%/" 5 +, 试剂盒说明书加入 -- 的总 +, 及逆转录反应所需试剂 得到的逆转录产物用相应的 61 引物在定量 61 仪进行实时定量 条件为,-., 进行.- 个循环 7 61 引物序列上游 : ,1,0001,,07, 下游 :711,001, ,00,7;)*( 基因引物序列上游 7 00,1,011,01,0,1,17, 下游 :700 01,001001,7;7 基因引物序列上游 :

3 !B" 张 悦 等P0128/34 对胃癌细胞凋亡影响的体外研究 X3)!!"#$#$$%%$%#$##%&# &$%&"'! 下游!!"$#% /*/ &#%&&#&%%&##&&%#&"(! +&$839.) E!(6D$F8/6F$(? ( F$(?? 3789: )*(!"#$% 所有数据都至少来自 ( 组独立 的实验 数据处理采用 +,++ 软件 计量资料用!"# 表示 所有统计结果以!-.*.! 为差异具有统计学 345 G;HI;J: KLMI 检测结果显示 敲低 5676N 组 5676N 蛋白表达较对照组下调!-OP.! 相对各自 意义!!" /*) &' 012"/34 ()* 5676) +,-./ +&$839.) & ' 012 8/34 ( ) * 5676) +, -. 0 的对照组 上调 0128/34 组及 H185676) 组凋亡相 关蛋白 E!( 表达水平下降 D$F8/ 表达上调 自噬相 关蛋白 F$(? F$(?? 表达下降!-.P.! 图 / #::;<1: =>,? 双染色 法可以区分不同凋亡时期的细胞 在双变量流式细 胞仪的 散 点 图 上 左 上 象 限 表 示 机 械 损 伤 细 胞 #::;<1:85?%$8>,?@ 左下象限显示正常活细胞 #::;<1:"5?%$">,?" 右上象限是凋亡中晚期细胞 # #::;<1:"5?%$@>,?@ 右下象限为早期凋亡细胞 #::;<1:"5?%$@>,?"A 凋亡率为右上象限与右下象 限细胞占总细胞数的比例 实验结果如图 )# 0128 /34 过表达组及其对照组细胞凋亡率分别为 )BC /9C 表明 0128/34 过表达可显著抑制 +&$839.) 细胞凋亡!-.*.! 而如图 )D 所示 5676) 低表 达组及其对照组细胞凋亡率分别为!C ).C 表明 5676) 低 表 达 亦 显 著 抑 制 +&$ 839.) 细 胞 凋 亡 D!-.*.! # 0128/34 U$,? $ #::;<1: = S H185676) D U$ #"DP 上调 0128/34 后 D$F8/ 表达上调 E!( F$(? F$(?? 表达下调W E!( F$(? F$(?? 表达下调 $"SP 敲低 5676) 后 D$F8/ 表达上调 #! $% #$%&!'( 1'( )*+*" 2 1=>3?@A&!3A@>B3A@>BB,? $4.01/.22$ =>C?@A&!C A@>B (4; A@>BB $4 #$%&!'( 3-./&.01/.22$34 (4; )*+*" 637&.01/.22$34 #::;<1: = #P0128/34 过表达抑制 +&$839O) 细胞凋亡 DP H185676) 可抑 制 +&$839O) 细胞凋亡 # " $% #$%&!'( &'( )*+*" )*+,-./0 )$, " *-./ &.01/.22$34 35 #$% &!'( 3/ 637 &.01/.22$34 35 )*+*" $48$9$:.;,(2:/$< <(4<./ <.66 (131:32$2 /P( 0128/34 ;<=3>? 通过生物信息学方法 用靶基因预测数据库 %4JQ;I +R4: 012SD及0124:T4 网站预测 012U#8/34 的靶基因V 获得潜在的靶点 5676) 2;4LI10;8,$2 检测结果显示 0128/34 高表 达质粒 0128/34 低表达质粒转染至胃癌细胞后 0128/34 水平分别上调 下调 表明了 0128/34 高 表达质粒 0128/34 低表达质粒成功转染至胃癌细

4 " 第 " 卷 胞中 应用双荧光素酶报告基因验证, 结果显示, 在野生型 组, 高表达组的荧光素酶活性比相应的对照组低, 低表达组的荧光素酶活性则比相应的对照组高 (!) 而在突变型 组, 高表达或低表达后荧光素酶活性与对照组相比并没有明显变化 (!) ( 图 ) 0 " #$%&' % 结果显示, 相对于各自对照组, 上调或下调 后,#$%' 细胞中 水平无明显变化 ((!) 转染 & ) 组细胞中 蛋白水平较其对照组低 (!), 转染 & *+,-. 组细胞中 蛋白水平较其相应对照组高 ( /!)( 图 ") 通过靶基因预测网站得到 & 在 中的作用位点, 并将其突变 ;0 双荧光素酶报告基因检测验证了 & 靶向结合!"#$% $! # # &#$%' #% % 0 上调或下调 & 对 #$%&' 细胞中 水平无明显变化 ;0& 负性调控 #$%&' 细胞中 蛋白水平!"# $% %#(&) *&# # $#% + ''$% $! &' 近年来, 在人类肿瘤研究领域获得较多关注 是一种非编码短链, 通过与靶基因 完全或不完全碱基互补配对, 促进靶基因 的降解或抑制靶基因的翻译, 发挥了癌基因或抑癌基因的功能 目前 & 在胃癌中的体内外研究多集中于其对肿瘤细胞增殖 侵袭迁移能力及细胞周期阻滞的影响, 而针对细胞凋亡的研究尚属空白 因而本研究对 & 在胃癌细胞凋亡中的作用及作用机制进行了初步探索 细胞凋亡是由基因控制的程序化细胞主动死亡, 在调节机体正常发育和维持稳态中发挥重要作用 肿瘤细胞存在凋亡逃逸, 从而获得了无限增殖的能力 本研究对转染 & 过表达质粒的中分化人胃腺癌 #$%&' 细胞株的凋亡情况进行了研究, 结果显示, 在胃癌细胞中 & 过表达可以显著抑制细胞凋亡, 提示 & 在胃癌的发生发展中发挥了癌基因的作用并可作为潜在的胃癌治 疗新靶点 是 家族中的 亚族, 是生理及病理状态下均发挥重要作用的转录因子, 由 " 及 1 组成," 个成员各自发挥 着不同的功能 研究表明 在乳腺癌 肺癌 原发性肝癌 骨肉瘤等肿瘤中呈低表达, 可通过调控下游的肿瘤相关基因的表达而参与细胞增殖 凋,&" 亡及转移等过程, 发挥着抑癌基因的功能 *&#+ 等发现抑制乳腺癌细胞中 表达后, 表达上调, 进而促进了细胞凋亡和导致! 细胞周期阻滞 本研究中敲低 #$%2' 细胞中 表达后得到了与转染 & )3 类似的实验结果, 即 表达下调抑制胃癌细胞凋亡 提示 可以为胃癌治疗提供新的方向 通过生物信息学方法得到 & 潜在的靶点, 目前研究亦提示在一些肿瘤中 &,! 与 存在靶点关系 本研究应用双荧光素酶报告基因进行了验证, 结果表明 4.&& 前

5 张悦, 等 3&! 对胃癌细胞凋亡影响的体外研究 体能够显著降低野生型 组质粒的荧光活性, 而对突变型 组质粒没有影响, 最终证实了 是胃癌 细胞中! 的靶基因 进一步研究显示上调 " 下调! 后,# 细胞中 $% 水平无明显变化, 蛋白水平相应下调 " 上调, 这提示 &! 能够在蛋白翻译水平负性调控 蛋白的表达 由此推断 :! 通过抑制靶基因 的表达抑制胃癌细胞凋亡 ' 是细胞凋亡相关研究中研究最多的一种抗凋亡蛋白 而 蛋白是重要的细胞凋亡调控因子, 可以监视 $% 损伤及诱导细胞凋亡, 抑制细胞增殖 据文献报道 ' 能够抑制 介导的凋 ( 亡 本研究应用 )*+,*-. /01, 法对上调 &! 敲低 的胃癌细胞中 '& 及 水平进行检测, 结果显示 '& 表达上调, 表达下降, 由此进一步印证了 &! 抑制胃癌细胞凋亡及 促进细胞凋亡的结论 同时可以推断,'& 通过抑制 的表达参与了 &!" 轴对胃癌细胞凋亡的影响过程, 进而促进胃癌的发生发展, 但其中的作用机制尚需深入研究 肿瘤细胞受细胞程序性死亡的调控, 而凋亡和自噬是程序性死亡的两种形式, 且凋亡和自噬有着密切的关系 有文献报道, 葡萄籽原花青素可以通过调控 表达而诱导凋亡和自噬, 当加入 &% 抑制自噬时 葡萄籽原花青素诱导细胞凋亡的能力 ( 下降, 表明了自噬可以促进凋亡 本研究对上调!" 敲低 的胃癌细胞中自噬相关蛋白 进行检测, 结果表明 表达下降, 由此我们可初步推断! 过表达及 + 可以抑制自噬而抑制胃癌细胞凋亡, 从而在胃癌的进展过程中发挥重要作用 由于胃癌早期筛查及诊断率低, 多数胃癌患者在被确诊时已为晚期, 化疗为主要治疗手段, 但因原发或获得性耐药的出现, 胃癌治疗陷入瓶颈 由于胃癌具体的发病机制未被阐明, 故尚无良好的靶点 本研究分析了! 对胃癌 # 细胞凋亡的影响及其作用机制, 初步得出了! 可通过靶向抑制 的表达抑制胃癌细胞凋亡的结论, 这提示!" 轴可以作为胃癌治疗的新靶点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张克君, 李德春, 朱东明 3 $&' '70& '70&@ 蛋白在胰腺癌中的表达及其与 和凋亡指数的关系 (3 中国癌症杂志, ##( )# (!: <,,:1 <,*,!03-178!.4.+ =-1 C,+.=*-! +**4+.4;7*!1,1,7!.4!;,1:!67 7*00 4*!,:! 6*.*-!,1. 1= -*!7,*1@86*.+*7*+.+D;!1;+7*00 7!-7.1!7*00+(3.710 *,,, #,( ) ( #9&# & 收稿 )

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