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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'& $& 基础研究 在肝细胞癌中的表达及意义 薛雨墨 姚博文 刘志奎 徐 蒙 涂康生 王军 西安交通大学第一附属医院 肝胆外科 急诊科 陕西西安 摘要 目的 探讨 %&%' 在肝细胞癌 $!$#!!"()** 癌组织中的表达 并通过下调肝癌 +)**, ) 细胞中 %&%' 的水平观察其对 +)**,) 细胞侵袭和迁移能力的影响 方法 收集 - 例 )** 组织及对应的癌旁组织 应用免疫组化检测 %&%' 蛋白在肝癌及对应癌旁组织中的表达 并分析其表达与肝癌临床病理特征的关系 采用小干扰.%&/.%& 下调肝癌 +)**,) 细胞中 %&%' 水平 0"/$ 实验检测 +)**,) 细胞的侵袭及迁移能力 结果 %&%' 在肝癌组织中表达水平显著高于相应癌旁组织 肝癌组织中 %&%' 高表达与肿瘤大小 0%+ 分期 门静脉侵犯及 1("/" 分级显著相关 %&%' 高表达患者 年生存率明显低于低表达组 特异性 /.%& 下调 %&%' 水平后 明显抑制 +)**,) 细胞的侵袭和迁移 结论 %&%' 在肝癌组织中的表达上调并与肝癌恶性临床病理特征有关 下调 %&%' 明显抑制肝癌细胞的侵袭和迁移能力 关键词 %&%' 肝细胞癌 侵袭 迁移中图分类号. 文献标志码 &!!"##$%!&! ' 1#,( &',$" 23,4# +$"5 0 6"5,/$"5 7&%8#" 9$($":)$;#5$9$($":1($5$"! +$!"$$/ &:$)/:"8"5"$/"*" "#''())###) "")#''(#")!*++,*#-.#."/''(& 0##"-*++",##)""#"''( - ))#)#&+##"###''( /" & ''( /.#.""/- 1'!*++,* #&/ / )"*++#" )&''( *++ /# ",##)"/# #" /) '! "")""&''(",/&0''( /"/"- ## 1'''(.#."/- -"#" )!*++,* #& ''(" *++"#" / )###&''(.#."/-#")*++#& ( ) ''( ###)) 肝细胞癌 $!$#!!"()** 是癌症原因致死的第 大肿瘤 起病隐匿 临床表现不典型 转移早 易复发 大多数患者在诊断时已为晚期 失去, 了手术切除的机会 预后极差 目前 药物靶向治疗为中晚期肿瘤的治疗开辟了新的思路 因此 研究 肝癌发生 发展的分子机制 确定有效的诊断标志物 或作用靶点已成为当前研究热点 %&%' 是 +20;2 和 *)&+1.; 几乎同时报道的在囊胚内细胞群 原始生殖细胞以及胚胎干细胞系表达的新的, 转录因子 %&%' 属 &%0 类 %6 家族基因 收稿日期,, 修回日期,, 基金项目 国家自然科学基金资助项目 %- 陕西省自然科学基础研究计划 %8+ ;#$ $%"%#;!$"!$#"":*"%-"$%#;!$"!$#"".$/$!$!: ;""!$%8+ 通讯作者 王军 1,(!( 优先出版!"4"$4!(/$.--(,-,

2 期 薛雨墨 姚博文 刘志奎 等 %&%' 在肝细胞癌中的表达及意义 - 在人定位于 号染色体 其主要作用于胚胎干细胞自我更新 维持细胞分化状态 促进细胞增,- 殖 研究发现 在精原细胞瘤 乳腺癌 宫颈癌 睾丸原位癌 胃癌 结肠癌等多种肿瘤组织中 %&%', 处于高表达状态 %&%' 的过表达与肿瘤细胞干性 肿瘤的增殖 侵袭与迁移密切相关 通过抑制其表达或功能可抑制肿瘤的恶性表型 目前 %&%' 在肝癌中的表达水平及其与肝癌的临床病理及预后的关系研究较少 本实验通过免疫组化检测 %&%' 在肝癌中的表达水平 并分析其与患者临床病理资料及预后的关系 通过 /.%& 技术检测 %&%' 的下调对 )** 细胞侵袭和迁移能力的影响 * 材料与方法 ** 研究对象 收集并筛选 年 月至 年 月期间在西安交通大学第一医院肝胆外科手术治疗后经病理证实的肝细胞癌患者共计 - 例 其中男 例 女 例 年龄 岁 中位年龄 岁 所有入组患者均签署知情同意书 患者术前均未接受放疗 化疗等其他辅助治疗 患者术后平均随访时间为 个月 癌旁组织为距肿瘤边缘!( 的肝组织 所有组织为术后获得的新鲜标本组织 组织获得后立即转移至液氮及 5 多聚甲醛固定后常规石蜡包埋 *+ 细胞株及试剂 人肝癌细胞株 +)**,) 细胞购自中国科学院上海生命研究所 9+1+ 细胞培养基 胰蛋白酶购自 )!"$ 公司 胎牛血清购自杭州四季青公司 兔抗人 %&%' 多克隆抗体购自 公司 鼠抗人,!" 单克隆抗体 ). 标记山羊抗鼠 25 山羊抗兔 25 二抗购自北京中杉金桥公司 脂质体 :$!("$ 购自 2"5$" 公司 %&%'/.%& 及对照 /.%& 购自上海吉玛公司 0"/$ 小室购自 +$ 公司 *& 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所 1* 化学发光试剂盒购自 +$ 公司 *, 方法 *,* 免疫组化法检测 %&%' 蛋白的表达 组织标本经常规脱水 石蜡包埋 制作 ( 切片 切片经二甲苯脱蜡 梯度乙醇水化后 微波柠檬酸盐抗原热修复 ("( ) ' 灭活内源性过氧化物酶 (" ( 山羊血清封闭 兔抗人 %&%' 抗体 < 孵育过夜 洗涤后 加生物素标记的山羊抗兔二抗工作液 < 孵育 (" 洗涤后 加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素 < 孵育 (" 洗涤后 9& 显色 苏木素复染 逐级梯度乙醇脱水 二甲苯透明 中性树胶封片 每张切片经 位病理医师 在高倍镜 = 下随机选取 个视野 按以下标准单独阅片 评分 染色强度评分 分 阴性 分 弱阳性 分 中度阳性 分 强阳性 阳性细胞百分比评分 阳性细胞 > 为 分 > 分 >> 分 >> 分 > 分 > 每视野评分? 染色强度评分 = 阳性肿瘤细胞百分比评分 取平均分作为切片终评分 *,+ 细胞培养与转染 人肝癌细胞株 +)**,) 培养于含 ( 胎牛血清的 9+1+ 培养液中 (*' 培养箱中常规培养 用 5 胰酶消化传代 取对数生长期的细胞进行实验 待细胞汇合率达 > 左右按照 :$!("$ 0+ 说明书以 "(%&%'/.%& 及阴性对照组!"/., %& 加入 孔板中 用无双抗 ( 血清的 9+1+ 培养细胞 - 后进行后续实验 *,,7$/$" 法检测 %&%' 蛋白表达 利用.2& 强 试剂盒提取转染后 +)**,) 细胞内总蛋白 *& 蛋白定量试剂盒 *&4 检测蛋白样品浓度 各组样品均加样 5;9;,&1 分离后 膜上 5 脱脂奶粉封闭 加 5 ;& 稀释的兔抗 %&%' 多克隆抗体 < 及小鼠抗,!" 单克隆抗体 < 过夜 0;0 0;(0$$", 洗膜 次 (" 次 分别加 ). 标记的抗兔或抗小鼠二抗 < 室温孵育 1* 化学发光剂暗室显影 *,-0"/$ 侵袭及迁移实验 取转染 - 后的 +)**,) 细胞 重悬细胞调整细胞数为 = 个 ( (5 +5$ 胶 <- 稀释液包被 0"/$ 小室 孔径 -( 底部 侵袭实验铺胶 迁移实验未铺胶 取各组细胞悬液 加入 0, "/$ 小室 孔板下室加入 ( 胎牛血清的完全培养基 每组重复 个样本 继续将 孔细胞培养板培养 取出 0"/$ 小室 用 ; 液淋洗 棉签擦去基质胶及微孔膜上层细胞 5 多聚甲醛固定 5 结晶紫染色 在倒置显微镜下计算移至微孔膜下层的细胞数 每个样本随机选取 - 个 倍视野求细胞计数的平均数 *- 统计学分析 使用 ;;; 统计软件分析 计量数据以 A 表示 检验 采用 检验分析 %&%' 表达与临床病理资料间的相关性 应用 6",+$$ 曲线分析 %&%' 高 低表达组的生存情况 为差异具有统计学意义 所有检测均重复 次

3 - 西安交通大学学报 医学版 第 卷 + 结 果 +.* 在 / 及对应癌旁组织中的表达 免疫组化检测 )** 及对应癌旁组织中 %&%' 的表达 %&%' 阳性染色主要定位于细胞核和细胞 质 结果显示 %&%' 在 )** 组织中的阳性表达率为 ->- 而在对应癌旁组织中的阳性表达率为 - 图 & 经免疫组化评分 %&%' 在肝癌中的表达明显高于癌旁组织中的表达 图 * 图 * 在肝癌及对应癌旁组织中的表达 50$$$//":%&%'")**"(!$!$",!!"(//#$/= & 肝癌组织 癌旁组织 *%&%' 免疫组化评分 与癌旁组织比较 +.+ 表达与肝癌患者临床病理特征的关系 对 - 例 )** 病例的临床病理资料分析 以免疫组化结果分为 %&%' 阳性组? 与 %&%' 阴性组? 结果发现 %&%' 高表达与肿瘤大小!(0%+ 分期 期和 期 门静脉侵犯及 1("/" 分级相关 表 表 * 的表达与肝癌临床病理特征的关系 +., 的表达与患者生存率的关系 结果显示 阳性表达 %&%' 的患者 年生存率明显低于阴性表达患者 差异具有统计学意义 图 0.$" $$$"%&%'"!"!5!:$, #$/:- )**$"/?- %&%' 项目 类别 阳性组? 阴性组? 性别男 女 - 年龄 岁 - - 岁 - 肿瘤直径!( - -!( 肿瘤数目 个 - 个 0%+ 分期 B - B 门静脉侵犯 无 有 & "5( "5( )@ 感染 无 有 1("/" B B - 图 +!01 法分析 表达水平与肝癌患者生存率的关系 5 6",+$$$/#$!#$/: )** $"/!!"5$$$:%&%'$$//" +.- 1/0/ 细胞中干扰 表达 人肝癌 +)**,) 细胞转染 %&%'/.%& 或 *", /.%&7$/$" 法检测发现 %&%' 蛋白表达显著降低 图 +. 下调 表达抑制 1/0/ 肝癌细胞的侵袭 铺胶的 0"/$ 侵袭实验显示 /.%& 下调 %&%' 表达可明显抑制 +)**,) 细胞的侵袭能力 图 +. 下调 表达抑制 1/0/ 肝癌细胞的迁移 为进一步研究 %&%' 对肝癌细胞迁移能力的影响 未铺胶的 0"/$ 实验显示 下调 %&%' 表达能明显抑制 +)**,) 细胞的迁移

4 期 薛雨墨 姚博文 刘志奎 等 %&%' 在肝细胞癌中的表达及意义 - 能力 图, 讨 论 图, 靶向沉默对 1/0/ 细胞 表达的抑制作用 50$"$:$!:/.%&5$"5:%&%' "$$$//":%&%'" +)**,)!$ &7$/$" 检测 /.%& 靶向沉默 +)**,) 细胞中 %&%' 的表达 半定量分析 次重复实验中 /.%& 沉默 %&%' 的表达 与对照组比较 肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一 因其早期浸润生长并发生远处转移致使大部分患者就诊时已失去 根治性手术机会 严重影响患者预后 因此 寻找新的有效的 )** 分子标志物及治疗靶点 已成为提高我国 )** 诊断和治疗水平的重要途径 系列研究表明 %&%' 作为胚胎干细胞的特异性基因 主要表达于胚胎和生殖细胞肿瘤中 但随着肿瘤干细胞研究的进展 在非生殖系统肿瘤中也发现 %&%' 的异常表达 且 %&%' 是干细胞维持其 全能性和自我增殖的重要调控因子 %&%' 可通过与 *96 相互作用影响星形胶质细胞的增 殖 %&%' 在胰腺癌中异常高表达 且可作为预测患者预后的指标 %&%' 在胃癌中可促进胃癌的增殖 侵袭及转移 并且与化疗抵抗密切相关 在卵巢癌中 %&%' 可以与 *9 及透明质酸结合形成复合物 启动 %&%' 下游的干细胞基因 如 ;.$ 等的表达 并且与 ;0&0 之间形成通路激活其下游的耐药基因如 +9. 表达 共同促进肿瘤细胞 图 - 下调 抑制 1/0/ 细胞侵袭 59"$5#":%&%'"$$"/":+)**,) &*"/.%& 组 %&%'/.%& 组 *0"/$ 实验各组穿膜细胞数分析 与对照组比较 图 下调 抑制 1/0/ 细胞迁移 59"$5#":%&%'"$$(5":+)**,) &*"/.%& 组 %&%'/.%& 组 *0"/$ 实验各组穿膜细胞数分析 与对照组比较

5 -- 西安交通大学学报 医学版 第 卷 的增殖和多重耐药 而本研究通过对 - 例 )** 组织标本检测发现 在 )** 组织中 %&%' 的表达水平显著高于对应癌旁组织 并且 %&%' 在肝癌中的表达多位于细胞核 且 %&%' 的过表达与肿瘤大小!( 高 0%+ 分期 门静脉侵犯及高 1("/" 分级等 )** 恶性临床病理特征密切相关 通过随访 发现高表达 %&%' 患者的 年生存率明显低于低表达 提示 %&%' 的高表达预示患者预后不良 这与 2 等研究结果基本一致 而进一步通过小.%& 干扰技术沉默 +)**,) 细胞中 %&%' 表达 结果证实 %&%' 表达降低后 肝癌 +)**,) 细胞的侵袭和迁移能力明显下调 这提示 %&%' 在肝癌的侵袭及转移过程中发挥重要作用 有研究表明 %&%' 可以与 ;( 相互作用并干扰辅激活蛋白的募集 妨碍 ;( 转录复合物的激活 从而阻止细胞分化 %&%' 可通过作用于 &.6 及, 的表达影响 %+ 的磷酸化 从而影响 的降解 但 %&%' 在肝癌中的作用机制仍需进一步探明 综上所述 %&%' 在 )** 组织中表达显著升高 并与 )** 的恶性临床病理特征密切相关 且高表达 %&%' 预示患者预后不良 在体外下调 %&%' 的表达有抑制肝癌细胞侵袭及迁移的作用 因此 %&%' 可能成为新的 )** 分子标志物及生物治疗靶点 参考文献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编辑 卓选鹏

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