2014,34(9) 王康等 :IQGAP1 基因干扰对人食管癌细胞同质粘附能力的影响 25 基, 使用 Lipofectamine2000 将对照质粒或 IQGAP1 干扰质粒转染到细胞中转染 48h 后, 给予 G418 筛选 10d~14d, 取耐药单克隆细胞扩增培养, 获得稳定表达细胞株

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妹汶寇
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2014,34(9):24 30 DOI: /j.cb IQGAP1 基因干扰对人食管癌细胞同质粘附能力的影响王 1 康贺 1 春高 2 伟 2 王斌全 1 王晓霞 (1 山西医科大学生物化学与分子生物学教研室太原山西医科大学第一医院太原 ) 摘要目的 : 研究 IQGAP1 基因干扰对人食管癌细胞同质粘附能力的影响方法 : 体外培养人食管癌 KYSE150 和 EC9706 细胞, 利用 Westernblot 方法检测两株细胞 IQGAP1 蛋白的表达, 利用缓慢聚集和细胞分离实验比较两株细胞同质粘附能力的差异 ; 进一步在 KYSE150 和 EC9706 细胞中构建 IQGAP1 基因干扰的稳定细胞系, 观察 IQGAP1 基因干扰后细胞同质粘附能力的改变结果 : KYSE150 细胞 IQGAP1 蛋白表达量低于 EC9706 细胞, 而同质粘附能力高于 EC9706 细胞 ;IQGAP1 基因干扰后, 其蛋白表达量明显降低, 而细胞同质粘附能力明显增强结论 :IQGAP1 基因干扰能够显著增强食管癌细胞的同质粘附能力, 从而降低肿瘤细胞的恶性表型关键词 IQGAP1 同质粘附基因干扰食管癌中图分类号 R734.2 食管癌是我国常见的消化道肿瘤, 其发病率和死亡率均居恶性肿瘤的前列食管癌患者的高死亡率主要与肿瘤的转移密切相关因此, 针对食管癌转移机制的研究将有助于寻求新的治疗手段, 从而提高肿瘤患者的生存率近些年发现, 人类多数肿瘤中存在 IQGAP1 的过表达, 其升高水平与肿瘤的分化程度侵袭性以及患者的预后密切关系 [1 4], 而高表达的 IQGAP1 具有促进肿瘤细胞增殖侵袭和转移的作用 [5 7] 因此,IQGAP1 作为癌症相关基因受到人们的重视我们前期的研究表明 [3],IQGAP1 在食管癌中存在高表达, 其升高水平与癌组织的侵袭深度呈正相关 ; 裸鼠荷瘤实验显示, 干扰 IQGAP1 的表达能够有效阻止食管癌细胞的侵袭和转移另外研究发现, 细胞同质粘附 ( 即细胞间粘附 ) 能力的改变是造成肿瘤细胞迁移侵袭和转移的重要原因 [8] 但关于 IQGAP1 是否通过影响肿瘤细胞间粘附作用, 从而影响食管癌细胞侵袭和转移的能力尚未见文献报道因此, 通过研究收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金 ( ), 中国博士后基金 (2014M551058) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :wxiaoxia99007@126.com IQGAP1 表达与食管癌细胞同质粘附能力的关系, 以期为食管癌的治疗寻找到新的靶点 1 材料与方法 1.1 材料细胞及质粒人类食管癌 KYSE150 和 EC9706 细胞株由本实验室常规保存 ;IQGAP1 干扰质粒由本实验室构建和保存主要试剂 RPMI1640 培养基及胎牛血清购自 Hyclone 公司 ; 细胞蛋白裂解液购自上海碧云天公司 ; Lipofectamine2000 购自美国 Invitrogen 公司 ; 鼠抗人 IQGAP1 单克隆抗体购自美国 BD 公司 ; 鼠抗人 β actin 单克隆抗体购自美国 SantaCruz 公司 ;HRP 标记的羊抗鼠 IgG 购自美国 Promega 公司 ; 琼脂粉购自于北京索莱宝科技有限公司 1.2 方法细胞培养及转染食管癌 KYSE150 和 EC9706 细胞用含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培养基, 于 5% CO 2,37 培养箱中常规培养取生长状态良好的细胞, 待细胞丰度为 70% ~80% 时, 替换为无血清培养

2014,34(9) 王康等 :IQGAP1 基因干扰对人食管癌细胞同质粘附能力的影响 25 基, 使用 Lipofectamine2000 将对照质粒或 IQGAP1 干扰质粒转染到细胞中转染 48h 后, 给予 G418 筛选 10d~14d, 取耐药单克隆细胞扩增培养, 获得稳定表达细胞株 1.2.2 Westernblot 检测收集对数生长期细胞, 加入细胞蛋白裂解液 ( 含 PMSF

单抗,4 摇床过夜 PBST 洗膜 3 次, 每次 10min, 然后加入 1 3000 稀释二抗, 室温孵育 3h,PBST 洗膜 3 次, 每次 10min, 化学发光成像, 使用 QuantityOne 进行结果分析 1.2.

2 2014,34(9) 王康等 :IQGAP1 基因干扰对人食管癌细胞同质粘附能力的影响 25 基, 使用 Lipofectamine2000 将对照质粒或 IQGAP1 干扰质粒转染到细胞中转染 48h 后, 给予 G418 筛选 10d~14d, 取耐药单克隆细胞扩增培养, 获得稳定表达细胞株 Westernblot 检测收集对数生长期细胞, 加入细胞蛋白裂解液 ( 含 PMSF 蛋白酶抑制剂 ), 冰上裂解 40min,13000r/min 离心 20min, 收集上清液, 获得细胞总蛋白,Bradford 法测定蛋白浓度取 100μg 样品与上样缓冲液混合, 加热变性,8% 聚丙烯酰胺凝胶 (SDS PAGE) 电泳进行分离, 然后转至硝酸纤维素膜上, 以 5% 脱脂奶粉室温封闭 2h, 加入稀释的鼠抗人 IQGAP1 或鼠抗人 β actin 单抗,4 摇床过夜 PBST 洗膜 3 次, 每次 10min, 然后加入稀释二抗, 室温孵育 3h,PBST 洗膜 3 次, 每次 10min, 化学发光成像, 使用 QuantityOne 进行结果分析缓慢聚集实验缓慢聚集实验按照 Boterberg [9] 等报道的方法进行操作将制备好的单细胞悬液 ( 细胞 /ml), 按 200μl/ 孔加入琼脂包被过的 96 孔板, 于 5% CO 2,37 培养箱中培养 12h, 使用倒置显微镜观察细胞聚集情况并拍照细胞分离实验细胞分离实验按照 Nagafuchi [10] 等报道的方法进行操作取等量的各组细胞接种于 48 孔板, 待细胞单层汇合长满后, 用含 1mmol/ LEDTA 或 CaCl 2 的 0.2% 胰酶处理细胞 30min, 滴管反复吹打 10 次, 于倒置显微镜下计数单个细胞和细胞团总数 (N) 细胞分散程度用 N TC 来表示, TE 代表含 EDTA 胰酶处理组,TC 代表含 CaCl 2 胰酶处理组统计学分析采用 SPSS18.0 进行统计学分析, 结果用 x±s 珋表示, 组间比较采用 t 检验,P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 KYSE150 和 EC9706 细胞中 IQGAP1 蛋白的表达 Western blot 检测 KYSE150 和 EC9706 细胞 IQGAP1 蛋白表达量,β actin 作为内参照如图 1 所示,KYSE150 细胞中 IQGAP1 蛋白表达量低于 EC9706 细胞, 两株细胞的灰度比值分别为 0.527±0.02 和 0.754±0.03, 差异具有统计学意义 (P<0.01) 2.2 KYSE150 和 EC9706 细胞聚集能力的检测缓慢聚集实验显示,KYSE150 细胞发生聚集, 形成许多细胞团块 ;EC9706 细胞汇集到视野中央, 形成一图 1 Westernblot 检测 KYSE150 和 EC9706 细胞中 IQGAP1 蛋白的表达 Fig.1 ExpresionofIQGAP1proteininKYSE150 andec9706celsdetectedbywesternblot 片均质的圆形区域, 高倍镜下可见大量散在的单细胞 ( 图 2) 上述结果表明,KYSE150 细胞间聚集能力高于 EC9706 细胞图 2 倒置显微镜下观察 KYSE150 和 EC9706 细胞聚集情况 Fig.2 CelaggregationabilityofKYSE150and EC9706celsdetectedbyinverted microscope( 40, 100) 2.3 KYSE150 和 EC9706 细胞分离程度的检测细胞分离实验显示, 用含 EDTA 的胰酶处理后, KYSE150 和 EC9706 细胞大多分散成为单个细胞 ; 用含 CaCl 2 的胰酶处理后,KYSE150 细胞呈现为大小不等的细胞团块, 而 EC9706 细胞仍大多呈单个细胞形式存在 ( 图 3a), 可见 KYSE150 细胞间分离程度明显低于 EC9706 细胞 ; 经计数可知, 两株细胞的 N TC 值分别为 0.125±0.01 和 0.972±0.06, 差异具有统计学意义 (P<0.01, 图 3b) 上述结果表明,KYSE150 细胞的同质粘附能力高于 EC9706 细胞 2.4 IQGAP1 蛋白在基因干扰稳定细胞系中的表达 Westernblot 结果显示, 与对照组 (KYSE150 Control 或 EC9706 Control) 细胞相比, 干扰组 (KYSE150 IQ

26 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No.92014 图 3 不同胰酶处理 KYSE150 和 EC9706 细胞后的细胞分离情况 Fig.

TC ) ofkyse150andec9706cels( P<0.01) RNAi 或 EC9706 IQ RNAi) 细胞中 IQGAP1 蛋白表达水平明显降低 ( 图 4) KYSE150 两组细胞的灰度比值分别为 0.470±0.011 和 0.101±0.030,EC9706 两组细胞的灰度比值分别为 0.706±0.017 和 0.290±0.010, 差异均具有统计学意义 (P< 0.

4 ExpresionofIQGAP1proteinincontrol groupandinterferencegroupofkyse150and EC9706celsdetectedbyWesternblot 2.

3 26 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No 图 3 不同胰酶处理 KYSE150 和 EC9706 细胞后的细胞分离情况 Fig.3 CeldisociationabilityofKYSE150andEC9706celstreatedwithtrypsin inthepresenceofedtaorca 2+ (a)celdisociationabilityofkyse150andec9706celsdetectedbyinvertedmicroscopy( 200) (b)theceldisociationindex(n TC ) ofkyse150andec9706cels( P<0.01) RNAi 或 EC9706 IQ RNAi) 细胞中 IQGAP1 蛋白表达水平明显降低 ( 图 4) KYSE150 两组细胞的灰度比值分别为 0.470±0.011 和 0.101±0.030,EC9706 两组细胞的灰度比值分别为 0.706±0.017 和 0.290±0.010, 差异均具有统计学意义 (P< 0.01) 结果表明, IQGAP1 基因干扰有效抑制了 KYSE150 和 EC9706 细胞中 IQGAP1 蛋白的表达,IQGAP1 基因干扰稳定细胞系构建成功图 4 Westernblot 检测 KYSE150 和 EC9706 细胞对照组和干扰组中 IQGAP1 蛋白的表达 Fig.4 ExpresionofIQGAP1proteinincontrol groupandinterferencegroupofkyse150and EC9706celsdetectedbyWesternblot 2.5 IQGAP1 基因干扰对细胞聚集能力的影响缓慢聚集实验显示, 与对照组相比,KYSE150 细胞干扰组聚集形成的细胞团块更大更致密 ( 图 5); EC9706 细胞干扰组中央细胞汇集区域出现明显间隙, 高倍镜下可见更多的细胞聚集而成的微小团块 ( 图 6) 结果表明, 干扰 IQGAP1 基因表达能够增强细胞间的聚集能力图 5 倒置显微镜下观察 KYSE150 细胞中对照组和干扰组的细胞聚集情况 Fig.5 Celaggregationabilityincontrolgroupand interferencegroupofkyse150celsdetectedby invertedmicroscope( 40, 100) 2.6 IQGAP1 基因干扰对细胞分离程度的影响细胞分散实验显示, 用含 EDTA 的胰酶处理后, 各组细胞多呈单个细胞的形式存在 ; 用含 CaCl 2 的胰酶处理后, 与对照组相比, 干扰组细胞分离程度低, 形成的细胞团明显增大 ( 图 7,8) KYSE150 细胞中对照组和干扰组的 N TC 值为 0.104±0.017 和 0.037± 0.007, 差异具有统计学意义 (P<0.01);EC9706 细胞中对照组和干扰组的 N TC 值为 0.938±0.045 和 0.083±0.008, 差异具有统计学意义 (P<0.01) 上述结果表明, 干扰 IQGAP1 的表达能够增强 KYSE150 和 EC9706 细胞的同质粘附能力

4 2014,34(9) 王康等 :IQGAP1 基因干扰对人食管癌细胞同质粘附能力的影响 27 3 讨论图 6 倒置显微镜下观察 EC9706 细胞中对照组和干扰组的细胞聚集情况 ( 40, 100) Fig.6 Celaggregationabilityincontrolgroup andinterferencegroupofec9706celsdetected byinvertedmicroscope( 40, 100) 在肿瘤发生发展过程中, 常常出现细胞间粘附能力降低细胞外基质降解以及细胞运动力增强, 这些共同促进肿瘤转移的发生 [5] 伴随着细胞间粘附能力的降低, 肿瘤细胞间彼此分离并脱离原发癌组织, 构成了肿瘤转移的起始步骤 [11] E cadherin 作为单跨膜的糖蛋白分子, 通过胞外区与相邻细胞的 E cadherin 分子形成同源二聚体, 参与上皮细胞间粘附的形成 [12] 同时, E cadherin 通过胞内区与 α catenin,β catenin,γ catenin 相互作用, 形成 E cadherin/catenin 复合体, 并通过 α catenin 与细胞骨架相连接 [13], 这对于形成牢固的细胞间粘附限制细胞移动起到非常重要的作用 [14 15] 大量的证据表明,E cadherin 是一种抑癌基因, 而 E cadherin 表达缺失和 E cadherin/catenin 复合体功能下调是导致肿瘤细胞发生侵袭和转移的重要原因 [11,16], 因此, 对于 E cadherin 介导的细胞间粘附能力的检测, 有助于判断肿瘤细胞的侵袭性和转移能力图 7 不同胰酶处理 KYSE150 细胞中对照组和干扰组细胞后的细胞分离情况 Fig.7 CeldisociationabilityincontrolgroupandinterferencegroupofKYSE150cels treatedwithtrypsininthepresenceofedtaorca 2+ (a)celdisociationabilityincontrolandinterferencegroupofkyse150celsdetectedbyinvertedmicroscopy( 200) disociationindex(n TC )incontrolandinterferencegroupofkyse150cels( P<0.01) (b)thecel IQGAP1 是人类 IQGAP 蛋白家族中最早被发现的成员, 它广泛表达于人体大多数组织和器官作为支架蛋白,IQGAP1 可以与多种蛋白分子相互作用, 参与细胞骨架细胞间粘附细胞迁移信号转导等多种细胞进程的调节 [17 19] 例如在细胞粘附方面,IQGAP1 可以与 β catenin E cadherin 结合, 参与细胞间粘附的调节 [20 21] [21] Kuroda 等研究发现, 高表达的 IQGAP1 能与 β catenin 相互作用, 使得 α catenin 从 E cadherin/ catenin 复合体中解离出来我们前期的研究发现 [3], IQGAP1 基因干扰能使 E cadherin 的表达升高, 从而逆转食管癌细胞的上皮间质转化 (epithelial mesenchymal transition,emt) 过程以上研究提示,IQGAP1 表达异常可能会影响肿瘤细胞的同质粘附能力, 但关于此方面的研究尚未见文献报道缓慢聚集实验和细胞分离实验是检测肿瘤细胞间粘附 ( 即同质粘附 ) 能力的两种重要的方法缓慢聚集

28 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No.92014 图 8 不同胰酶处理 EC9706 细胞中对照组和干扰组细胞后的细胞分离情况 Fig.

5 28 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No 图 8 不同胰酶处理 EC9706 细胞中对照组和干扰组细胞后的细胞分离情况 Fig.8 CeldisociationabilityincontrolgroupandinterferencegroupofEC9706cels treatedwithtrypsininthepresenceofedtaorca 2+ (a)celdisociationabilityincontrolandinterferencegroupofec9706celsdetectedbyinvertedmicroscopy( 200) (b)theceldisociation index(n TC )incontrolandinterferencegroupofec9706cels( P<0.01) 实验主要用于检测上皮肿瘤细胞 E cadherin/catenin 复合体的功能, 通过观察琼脂表面形成细胞团块的大小和致密程度, 反映细胞间粘附能力和肿瘤细胞的侵袭性 [22 23] 细胞分离实验采用含 EDTA 和 Ca 2+ 的胰酶分别处理单层贴壁汇合的细胞, 滴管吹打并计数细胞团块和单细胞的总数由于 E cadherin 介导的上皮细胞间粘附需要 Ca 2+ 的存在, 含 EDTA 胰酶处理时,Ca 2+ 被 EDTA 螯合,E cadherin 功能丧失, 细胞多分散为单个细胞 ; 含 Ca 2+ 胰酶处理时,E cadherin 功能存在, 细胞间相互粘附形成细胞团, 分离形成的单细胞数目减少因此, 含 Ca 2+ 胰酶处理后的 N TC 值要比含 EDTA 胰酶理后的 N TE 值小,N TC 值可以反映 E cadherin 的功能 [10,24] N TC 值越小, 表明 E cadherin 功能越好, 细胞间同质粘附能力越强因此, 本研究采用以上两种方法分析肿瘤细胞间同质粘附能力研究结果显示,KYSE150 细胞中 IQGAP1 蛋白表达量低于 EC9706 细胞, 而细胞同质粘附能力高于 EC9706 细胞如缓慢聚集实验显示,KYSE150 细胞聚集形成许多细胞团块,EC9706 无细胞团块形成细胞分离实验显示, 用含 Ca 2+ 的胰酶处理后,KYSE150 细胞多以细胞团形式存在,EC9706 细胞多分散为单个细胞,KYSE150 细胞的 N TC 明显小于 EC9706 细胞以上研究表明 IQGAP1 蛋白表达量与食管癌细胞间粘附能力有着密切关系为了进一步证实上述观点, 我们在 KYSE150 和 EC9706 细胞中分别构建了 IQGAP1 基因干扰的稳定细胞系实验结果显示, 与对照组相比, 干扰组细胞聚集程度增加, 细胞分离程度降低, N TC 值减小, 差异具有统计学意义, 说明干扰组细胞同质粘附能力增强因此, 本研究表明 IQGAP1 表达量能够影响人类食管癌细胞同质粘附能力, 而且利用基因干扰抑制 IQGAP1 蛋白的表达后, 能够有效的增强人类食管癌 KYSE150 细胞和 EC9706 细胞同质粘附能力, 从而降低肿瘤细胞的恶性表型本研究提示 IQGAP1 有望成为治疗食管癌的新型靶点, 从而为食管癌的治疗提供了新的思路参考文献 [1] HayashiH,NabeshimaK,AokiM.etal.Overexpresionof IQGAP1 in advanced colorectalcancercorelateswith poor prognosis criticalroleintumorinvasion.intjcancer,2010,126 (11): [2]JinJ,LeeJW,RhaKS.etal.ExpresionpaternofIQGAP1in sinonasalinverted papilomasand squamouscelcarcinomas. Laryngoscope,2012,122(12): [3] WangXX,WangK,LiX Z.etal.Targetedknockdownof IQGAP1inhibitstheprogresionofesophagealsquamouscel carcinomainvitroandinvivo.plosone,2014,9(5):e [4]XiaFD,WangZL,ChenHX.etal.DiferentialExpresionof IQGAP1/2inHepatocelularCarcinomaanditsRelationshipwith ClinicalOutcomes.AsianPacJCancerPrev,2014,15(12): [5]WhiteCD,BrownMD,SacksDB.IQGAPsincancer:afamily ofscafoldproteinsunderlyingtumorigenesis.febslet,2009, 583(12): [6]CasteelD E,TurnerS,SchwappacherR.etal.Rhoisoform specificinteraction with IQGAP1 promotesbreastcancercel

6 2014,34(9) 王康等 :IQGAP1 基因干扰对人食管癌细胞同质粘附能力的影响 29 proliferationandmigration.jbiolchem,2012,287(45): [7]MaY,JinZ,HuangJ.etal.IQGAP1playsanimportantrolein thecelproliferationofmultiplemyelomaviathemapkinase (ERK)pathway.OncolRep,2013,30(6): [8] WadhawanA,SmithC,NicholsonR I.etal.Src mediated regulationofhomotypicceladhesion:implicationsforcancer progresionandopportunitiesfortherapeuticintervention.cancer TreatRev,2011,37(3): [9]BoterbergT,VennekensKM,ThienpontM.etal.Internalization ofthe E cadherin/catenin complex and scatering ofhuman mammary carcinoma cels MCF 7/AZ after treatment with conditionedmedium from humanskinsquamouscarcinomacels COLO16.CelAdhesCommun,2000,7(4): [10]NagafuchiA,IshiharaS,TsukitaS.etal.Therolesofcatenins inthecadherin mediatedceladhesion:functionalanalysisofe cadherin alphacateninfusionmolecules.jcelbiol,1994,127 (1): [11]OnderTT,GuptaPB,ManiSA.etal.LosofE cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways.cancerres,2008,68(10): [12]ShapiroL,FannonAM,KwongPD.etal.Structuralbasisof cel celadhesionbycadherins.nature,1995,374(6520): [13] GumbinerB M, McCreaPD. Cateninsasmediatorsofthe cytoplasmicfunctionsofcadherins.jcelscisuppl,1993,17: [14]ParedesJ,FigueiredoJ,AlbergariaA.etal.EpithelialE andp cadherins: roleand clinicalsignificancein cancer. Biochim BiophysActa,2012,1826(2): [15] DavidJM,RajasekaranA K.Dishonorabledischarge: the oncogenicrolesofcleavede cadherinfragments.cancerres, 2012,72(12): [16] CavalaroU,ChristoforiG.Celadhesionand signalingby cadherinsandig CAMsincancer.NatRevCancer,2004,4 (2): [17]NoritakeJ,WatanabeT,SatoK.etal.IQGAP1:akeyregulator ofadhesionandmigration.jcelsci,2005,118(10): [18]BrownM D,SacksDB.IQGAP1incelularsignaling:bridging thegap.trendscelbiol,2006,16(5): [19]WhiteCD,ErdemirHH,SacksDB.IQGAP1anditsbinding proteinscontroldiversebiologicalfunctions.celsignal,2012, 24(4): [20]FukataM,NakagawaM,KurodaS.etal.CeladhesionandRho smalgtpases.jcelsci,1999,112(pt24): [21]KurodaS,FukataM,NakagawaM.etal.RoleofIQGAP1,a targetofthesmalgtpasescdc42andrac1,inregulationofe cadherin mediated cel celadhesion. Science, 1998, 281 (5378): [22]DeryckeL,StoveC,Vercouter EdouartAS,etal.Theroleof non musclemyosin IA inaggregationandinvasionofhuman MCF 7breastcancercels.IntJDevBiol,2011,55(7 9): [23] Simoes CoreiaJ,FigueiredoJ,LopesR.etal.E cadherin destabilization accounts for the pathogenicity of misense mutationsinhereditarydifusegastriccancer.plosone,2012, 7(3):e33783 [24]AkitaK,TanakaM,TanidaS.etal.CA125/MUC16interacts withsrcfamilykinases,andover expresionofitsc terminal fragmentin human epithelialcancercels reduces cel cel adhesion.eurjcelbiol,2013,92(8 9): EfectofIQGAP1KnockdownonHomotypicCel Cel AdhesionofEsophagealCarcinomaCels WANGKang 1 HEChun 1 GAOWei 2 WANGBin quan 2 WANGXiao xia 1 (1DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan ,China) (2DepartmentofOtolaryngologyHeadandNeckSurgery,TheFirstHospital,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan ,China) Abstract Objective:ToinvestigatetheefectofIQGAP1knockdownbyRNA interference(rnai)on homotypiccel celadhesionofesophagealcarcinoma(ec)cels.method:westernblotanalysiswasadoptedto detecttheproteinexpresionofiqgap1 inkyse150 andec9706 cels.slow aggregationasayandcel disociationasaywereperformedtodetectthehomotypiccel celadhesionpropertiesoftumorcels.further,

7 30 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No KYSE150andEC9706celsweretransfectedwithRNAiplasmidfortargetingIQGAP1geneornegativecontrol, andthenthecellinesofiqgap1knockdownwerescreenedwithg418.levelofiqgap1proteinininterference groupandcontrolgroupwasmeasuredbywesternblot,andthechangesofhomotypiccel celadhesionwere observedbyslowaggregationasayandceldisociationasay.result:comparedwithec9706cels,levelof IQGAP1proteininKYSE150celswaslower,whilethehomotypiccel celadhesioninkyse150celswas stronger.further,westernblotinganalysisshowedthatiqgap1proteinexpresionwaseficientlydownregulated bystabletransfectionwithiqgap1sirna expresionvector.thehomotypiccel celadhesionwasobviously enhancedbyiqgap1knockdown.conclusion:thesedatasuggestthatdownregulationofiqgap1expresion couldsignificantlyenhancehomotypiccel celadhesionanddecreasemalignantphenotypeofeccels. Keywords IQGAP1 Homotypiccel celadhesion RNAi Esophagealcarcinoma

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot

2014,34(9) 王康等 :IQGAP1 基因干扰对人食管癌细胞同质粘附能力的影响 25 基, 使用 Lipofectamine2000 将对照质粒或 IQGAP1 干扰质粒转染到细胞中 转染 48h 后, 给予 G418 筛选 10d~14d, 取耐药单克隆细胞扩增培养, 获得稳定表达细胞株

2014,34(9) 王康等 :IQGAP1 基因干扰对人食管癌细胞同质粘附能力的影响 25 基, 使用 Lipofectamine2000 将对照质粒或 IQGAP1 干扰质粒转染到细胞中转染 48h 后, 给予 G418 筛选 10d~14d, 取耐药单克隆细胞扩增培养, 获得稳定表达细胞株