2 研究论文肺癌是二十一世纪以来发病率和死亡率都极高的恶性肿瘤, 其中非小细胞肺癌为主流群体, 病例数量大, 一直以来都是研究的难点和热点全世界每年都会新增上百万的肺癌患者近年来我国肺癌死亡率仍以每年 4.5% 的速度增加, 到 2030 年我国每年将会有 170 万中年人死于肺癌

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庵仲
7 years ago
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1 :34 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2013, 36(1): DOI: /cjcb LATS1 过表达对肺癌 A549 细胞增殖及周期的影响熊伟吴庆琛 * 张诚 ( 重庆医科大学附属第一医院胸心外科, 重庆 ) 摘要通过过表达手段上调大肿瘤抑制因子 1(large tumor suppressor gene 1, LATS1) 基因在 A549 细胞中的表达, 研究 LATS1 对 A549 细胞生长和细胞周期调控的作用构建过表达 LATS1 基因的慢病毒载体, 转染 A549 细胞株, 采用 RT-PCR 和蛋白质印迹法检测转染后 A549 细胞中 LATS1 YAP mrna 和蛋白的表达效率 ; 流式细胞术检测细胞凋亡周期情况 ; CCK-8 检测细胞的增殖水平变化结果发现, 过表达 LATS1 慢病毒载体转染 A549 细胞株后, LATS1 mrna 及蛋白表达水平高于未处理组及转染空载体组, YAP mrna 及蛋白表达水平低于未处理组及转染空载体组 ; 过表达 LATS1 慢病毒转染后, A549 细胞增殖率从第五天开始低于对照组 (P<0.05), 过表达组细胞 G 1 期比例明显增高 (P<0.05), 凋亡率明显增加 (P<0.05), 差异均有统计学意义以上结果提示, LATS1 可通过下调 YAP 的表达水平促进 A549 细胞的凋亡, 诱导 G 1 期阻滞, 降低细胞的增殖能力关键词非小细胞肺癌 ; HIPPO; LATS1; YAP Effect of LATS1 Over-Expression on Proliferation and Cell Cycle Regulation of A549 Cells Xiong Wei, Wu Qingchen*, Zhang Cheng (Department of Cardiothoracic Surgery, the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing , China) Abstract By over-expressing large tumor suppressor gene 1 (LATS1), we aimed to investigate its effect on the proliferation and cell cycle regulation in lung cancer cell A549. LATS1 gene coding region was cloned into lentivirus vector, and then lentivirus particles were transfected into A549 cells to up-regulate the expression of LATS1 gene. The expression of LATS1 and YAP were detected at both mrna and protein levels by RT-PCR and Western blot. The apoptosis and cycle of cells were detected by flow cytometry. The proliferation level of cells was detected by CCK-8. The expression levels of LATS1 mrna and protein were up-regulated significantly after the lentivirus vector of LATS1 over expression transfected into A549 cells. Meanwhile, the expression levels of YAP mrna and protein were down-regulated. 5th days after transfection with lentivirus vector of LATS1 over expression, the proliferation rate of transfected cells was lower than untransfected cells (P<0.05). Flow cytometry showed that more cells of transfected went into phase G 1 and fewer cells went into phase S. Moreover, apoptosis rate was significant increased in transfected cells (P<0.05). The results demonstrate that LATS1 can promote A549 cells apoptosis, induce G 1 phase arrest and inhibit the cell proliferation by down-regulating the expression of YAP. Key words NSCLC; HIPPO; LATS1; YAP 收稿日期 : 接受日期 : 重庆市科委科研项目 ( 批准号 : CSTC,2008BB5215) 资助的课题通讯作者 Tel: , wuqc6@hotmail.com Received: August 29, 2013 Accepted: November 4, 2013 This work was supported by Science and Technology Commission of Chongqing Project (Grant No.CSTC,2008BB5215) Corresponding author. Tel: , wuqc6@hotmail.com

2 2 研究论文肺癌是二十一世纪以来发病率和死亡率都极高的恶性肿瘤, 其中非小细胞肺癌为主流群体, 病例数量大, 一直以来都是研究的难点和热点全世界每年都会新增上百万的肺癌患者近年来我国肺癌死亡率仍以每年 4.5% 的速度增加, 到 2030 年我国每年将会有 170 万中年人死于肺癌 [1-2] 在肺癌患者中非小细胞肺癌 (non small cell lung cancer, NSCLC) 占 80% 以上, 虽然近年来对肺癌的治疗方面取得了一定进步, 但 5 年生存率仍低肺癌的发病过程是一个集遗传环境及生活习惯等多因素于一体的复杂过程, 其确切分子机制仍不清楚 HIPPO 信号转导通路对调节器官大小发育有着重要的作用其最初发现于果蝇体内, 而后进一步研究发现, 人类机体中也存在着具有与果蝇 HIPPO 通路中各个因子相同功能的组件 [3-4] 近年来研究认为 HIPPO 能促进细胞凋亡并对器官的大小产生重要的影响 [5] 研究表明 HIPPO 信号转导通路由 LATS1 等数种抑癌因子及一种癌基因 YAP 构成, 但目前关于 HIPPO 通路的研究还较少, 特别是在非小细胞肺癌方面还十分欠缺因此我们在本研究中通过慢病毒载体使 A549 细胞中 LATS1 过表达, 探究其对 A549 细胞生长和细胞周期调控的作用, 为 LATS1 在 NSCLC 的研究打下基础 1 材料与方法 1.1 主要材料 LATS1 兔抗人多克隆抗体购自 Abnova 试剂公司, YAP 兔抗多克隆抗体购自 Santa Cruz 公司 ; LATS1 过表达慢病毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司构建 DL1000 DNA Marker RNAiso Plus Total RNA 提取试剂 Premix Taq 购自 TaKaRa 公司 ; CCK-8 细胞增殖 / 毒性检测试剂购自广州奕源生物科技有限公司 ; 蛋白提取及 BCA 蛋白浓度测定试剂盒 SDS- PAGE 蛋白上样缓冲液 SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒一抗稀释液超敏 ECL 化学发光试剂盒购自碧云天 ; 抗 β-actin 兔多克隆抗体购自北京康为世纪科技有限公司 ; 非小细胞肺癌细胞株 A549 为本科室冻存 1.2 实验方法过表达 LATS1 慢病毒载体转染 A549 细胞将 A549 细胞分为 3 组 : 未转染组 ( 未进行处理的 A549 细胞 ); 空载体组 ( 用空白病毒转染的 A549 细胞 ); LATS1 组 ( 用过表达 LATS1 慢病毒载体转染的 A549 细胞 ) 先于培养瓶中培养 A549 细胞株, 待细胞状态良好处于对数生长期时, 以每孔细胞数接种 6 孔板, 培养液 2 ml, 置于 37 C 5% CO 2 的培养箱中培养 24 h 后, 弃旧培养液, 每孔加新鲜培养液 1 ml, 病毒稀释后以 MOI 值 20 的病毒数量加入培养孔中, 另外每个培养孔加入稀释好的 Polybrene 以增强转染效果, 小心混匀, 继续培养 12 h 后弃去含病毒的培养液, 换新鲜培养液继续培养, 常规换液, 培养 96 h, 正置荧光显微镜下观察荧光表达情况, 转染效率大于 80% 认为转染成功, 转至培养瓶继续培养 RT-PCR 检测各组细胞 LATS1 及 YAP mrna 表达情况 LATS1 YAP 引物构建于金斯瑞生物科技公司, GAPDH 为内参 ( 表 1) 细胞达到一定数量后用 0.25% 的胰蛋白酶进行消化, 离心收集细胞, 加 Trizol 进行裂解, 提取总 RNA, RNA 浓度测定合格后进行逆转录, 扩增, 电泳, 再利用 Gene Tools 软件进行灰度值分析, 实验重复 3 次 Western blot 检测 LATS1 与 YAP 蛋白表达将未转染组空载体组 LATS1 组细胞进行消化离心后以预冷的 PBS 清洗细胞两次, 转至 EP 管离心弃上清后加入适量蛋白裂解液及 1% 体积的蛋白酶抑制剂, 表 1 RT-PCR 引物 Table 1 Primer Pairs for RT-PCR 基因 Gene YAP LATS1 GAPDH 引物序列 (5-3 ) Primer sequences (5-3 ) 上游 5 -TGA ACA A AC GTC CAG CA A GAT AC-3 下游 5 -CAG CCC CCA AAA TGA ACA GTA G-3 上游 5 -CCA CCC TAC CCA A A A CAT CTG-3 下游 5 -CGC TGC TGA TGA GAT TTG AGT AC-3 上游 5 -ACC ACC ATG GAG AAG GCT GG-3 下游 5 -CTC AGT GTA GCC CAG GAT GC-3 产物大小 Product size 165 bp 302 bp 528 bp

3 熊伟等 : LATS1 过表达对肺癌 A549 细胞增殖及周期的影响 3 冰上裂解 30 min, 再 4 C r/min 离心 15 min 得到总蛋白 BCA 法测蛋白浓度 ; 取总蛋白 50 μg, 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到 PVDF 膜上, 50 g/l 脱脂牛奶封闭 2 h 后加一定比例稀释的一抗, 4 C 孵育过夜后 TBST 室温摇床洗膜 5 5 min, 加入相应稀释的二抗, 37 C 孵育 1 h, TBST 室温摇床洗膜 5 5 min, 加 ECL 发光试剂后凝胶成像显色, β-actin 为内参, 对条带进行统计分析流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况培养细胞至铺板 70%~80%, 换无血清培养基培养 24 h, 然后换正常培养液培养 24 h, 消化离心收集细胞, 预冷 PBS 洗两次后加入预冷 70% 乙醇 ( 充分吹打 ) 固定, 4 C 固定过夜, 离心弃固定液后加入 RNase 和 PI, 避光染色 30 min, 流式细胞仪检测周期分布实验重复 3 次消化离心收集各组细胞约个, PBS 洗 2 次, 加 500 μl binding buffer 重悬细胞, 然后加入 2 μl Annexin V-FITC 混匀, 加入 5 μl 碘化丙啶, 混匀避光室温反应 5 min, 流式细胞仪检测细胞凋亡率实验重复 3 次 CCK-8 检测细胞增殖能力将对数期生长的 A549 细胞按 1 000/ 孔接种于 96 孔板中, 分三组 ( 未处理组空载体组过表达组 ), 每组设 5 个复孔, 孔板中培养液体积 100 μl, 置于 37 C 5% CO 2 培养箱中培养 24 h 分别进行空载体及过表达载体的细胞转染操作, 方法同前转染后 1 d 开始进行检测, 在固定时间向待测孔加入 10 μl CCK8 溶液, 避光 37 C 反应 1 h 后用酶标仪测定吸光度 (D) 值, 数据处理时去掉最大值和最小值实验重复 3 次统计学分析采用 SPSS17. 0 软件进行统计分析计量资料以均数 ± 标准差 (x _ ±s) 表示, 两组均数比较采用 t 检验 ; 多组间单因素分析采用 one-way ANOVA 检验 ; P<0.05 认为差异有统计学意义 2 实验结果 2.1 慢病毒转染获得稳定过表达 LATS1 的 A549 细胞株转染操作后 96 h 于正置荧光显微镜下观察荧光情况, 空载体组细胞荧光强, 转染效率 95% 以上, 细胞生长良好 ; 过表达 LATS1 组细胞荧光稍弱, 转染效率约 90%, 转入培养瓶中持续培养, 得到稳定株 ( 图 1) 2.2 RT-PCR 检测细胞转染前后 LATS1 YAP mrna 表达情况未转染组与空载体组 LATS1 mrna 的表达量无统计学差异 (P<0.05), 而 LATS1 转染组 LATS1 mrna 的表达量明显高于未处理组及空载体组 (P<0.05), 结果 A B C D A: 光镜下的空载体组 ; B: 荧光显微镜下的空载体组 ; C: 光镜下的 LATS1 转染组 ; D: 荧光显微镜下 LATS1 转染组 A: the empty vector transfected group under optical microscope; B: the empty vector transfected group under fluorescence microscope; C: LATS1 transfected group under optical microscope; D: LATS1 transfected group under fluorescence microscope. 图 1 A549 细胞的慢病毒转染结果 (200 ) Fig.1 Lentiviral vector transfection into A549 cells (200 )

4 4 研究论文有统计学意义 ( 图 2A, 表 2); 未转染组与空载体组 YAP mrna 的表达量无统计学差异 (P<0.05), LATS1 转染组 YAP mrna 的表达量明显低于未处理组及空载体组 (P<0.05), 结果有统计学意义 ( 图 2B, 表 2) 2.3 Western blot 检测各组细胞 LATS1 及 YAP 蛋白的表达情况未转染组和空载体组细胞 LATS1 YAP 蛋白表达无明显差异 (P<0.05); LATS1 转染组 LATS1 蛋白表达量明显高于未转染组和空载体组 (P<0.05), 证明转染有效, 而 LATS1 转染组的 YAP 蛋白表达量低于未转染组和空载体组 (P<0.05), 差异有统计学意义 ( 图 3 和表 2) 2.4 过表达 LATS1 基因对 A549 细胞生长的影响 CCK-8 检测结果显示, 在转染前 4 d, 未转染组 LATS1 转染组在每个时间点的 D 值之间无明显差异 (P<0.05), 在转染后第 5 d 开始, LATS1 转染组的细胞增值率开始明显低于未处理组, 差异有统计学意义 (P<0.05, 图 4), 表明 LATS1 具有抑制 A549 细胞增殖的作用 2.5 过表达 LATS1 基因对 A549 细胞周期的影响采用流式细胞术对各组细胞进行周期分析, 结果与未转染组及空载体组相比, LATS1 转染组 G 1 期细胞比例增多, 差异具有统计学意义 (P<0.05), S 期细胞比例明显降低, 差异具有统计学意义 (P<0.05), (A) M (B) M GAPDH 600 GAPDH 528 bp bp 400 LATS1 302 bp 300 YAP bp 100 M: marker; 1, 2: 未转染组 ; 3, 4: 空载体组 ; 5, 6: LATS1 转染组 M: marker; 1, 2: untranfected group; 3, 4: empty vector transfected group; 5, 6: LATS1 transfected group. 图 2 LATS1 YAP 在三组细胞中的转录水平 Fig.2 LATS1 and YAP transcriptional levels in the three group cells 表 2 转染前后三组细胞间的 LATS1 和 YAP mrna 和蛋白质水平比较 (x _ ±s) Table 2 The expression of LATS1 and YAP in mrna and protein levels in the three group cells (x _ ±s) 组别 Group 未转染组 Untransfected group 空载体组 Empty vector transfected group LATS1 转染组 LATS1 transfected group LATS1 mrna ± ± ± * YAP mrna ± ± ± * LATS1 protein ± ± ± * YAP protein ± ± ± * * P<0.05 vs other groups. 2.0 Empty vector * LATS1(124 kda) YAP(65 kda) D (450 nm) LATS1 * β-actin(43 kda) 0.5 1: 未转染组 ; 2: 空载体组 ; 3: LATS1 转染组 1: untransfected group; 2: empty vector transfected group; 3: LATS1 transfected group. 图 3 LATS1 YAP 蛋白在三组细胞中的表达情况 Fig.3 LATS1 and YAP protein expressions in the three group cells *P<0.05 vs LATS1 groups. Time (days) 图 4 LATS1 基因过表达对 A549 细胞生长的影响 (x _ ±s) Fig.4 Effect of LATS1 over-expression on the proliferation of A549 cells (x _ ±s)

5 熊伟等 : LATS1 过表达对肺癌 A549 细胞增殖及周期的影响 5 (A) (B) (C) Number G 1 : 61.70% G 2 : 10.93% S: 27.37% A: 未转染组 ; B: 空载体组 ; C: LATS1 转染组 Number G 1 : 59.40% G 2 : 11.27% S: 29.33% Number A: untranfected group; B: empty vector transfected group; C: LATS1 transfected group. 图 5 LATS1 过表达对 A549 细胞周期的影响 Fig.5 Impact of LATS1 over-expression on cell cycle of A549 cells G 1 : 79.35% G 2 : 8.44% S: 12.18% Channels (FL2-A) Channels (FL2-A) Channels (FL2-A) (A) (B) (C) 7-AAD AAD AAD Annexin-PE Annexin-PE Annexin-PE A: 未转染组 ; B: 空载体组 ; C: LATS1 转染组 A: untranfected group; B: empty vector transfected group; C: LATS1 transfected group. 图 6 LATS1 过表达对 A549 细胞凋亡的影响 Fig.6 Impact of LATS1 over-expression on cell apoptosis of A549 cells 组别 Group 表 3 LATS1 基因对 A549 细胞周期及凋亡的影响 (n=3, %, x _ ±s) Table 3 Effect of LATS1 on the cell cycle and apoptosis of A549 cells (n=3, %, x _ ±s) 细胞周期凋亡 Cell cycle Apoptosis G 1 S G 2 Untransfected 61.7± ± ± ±0.7 Empty vector transfected 61.0± ± ± ±1.8 LATS1 transfected 80.1±1.6* 11.3±3.9* 8.6± ±5.5* *P<0.05 vs other groups. G 2 期无明显差异 (P>0.05, 图 5, 表 3) 2.6 LATS1 基因过表达对 A549 细胞凋亡的影响流式细胞仪对各组细胞凋亡情况进行检测, 结果显示 LATS1 转染组细胞的凋亡率明显高于未转染组和空载体组 (P<0.05), 差异有统计学意义 ; 未转染组和空载体组凋亡率无明显差异 (P>0.05, 图 6, 表 3) 3 讨论 HIPPO 信号通路高度保守, 对生物生长控制有着重要作用并且对器官细胞的增殖和凋亡有关键的调节作用 LATS1 为 HIPPO 信号通路中的重要作用元件, 其在多种肿瘤组织中均存在着低表达或者 [6] [7] 表达缺失现象, 如在乳腺癌星型细胞瘤中启动 [8] [9] 子的甲基化宫颈癌中 LATS1 的缺失 ; Salah 等认为 LATS1 能通过诱导 G 2~M 及 G 1 ~S 的静止而对肿瘤细胞的生长产生抑制作用, LATS1 还可以通过对凋亡蛋白的调节而促进细胞凋亡, 提示 LATS1 在多种

6 6 研究论文肿瘤组织及相应癌旁组织中有差异性表达, 与肿瘤发生密切相关 YAP 为 HIPPO 通路的重要作用靶点, 位于 LATS1/2 下游, 研究认为 HIPPO 通路中的上游转录因子均能通过磷酸化和促进细胞质细胞核转位而对 [10] YAP 起负性调节作用 YAP 在多种肿瘤组织中高表达, 如肝癌前列腺癌食管癌等, 目前认为 YAP 为癌 [11] [12] 基因在进一步研究中 Overholtzer 等和 Liu 等均提出低表达 YAP 能抑制肝癌细胞的增殖能力 ; Wang [13] 等提出 YAP 在 NSCLC 组织中高表达, 并且在体外实验中发现 YAP 能增加细胞的增值及侵袭能力, 提示了通过对癌基因 YAP 进行靶向干预来抑制肿瘤细胞的增殖力侵袭力的可能研究证明 LATS1 LATS2 均能与下游的 YAP 结合, 并对 YAP 有一定的调控作用, 但以 [14] LATS1 为主, 能抑制 YAP 引起的致瘤改变 2008 年, [15] Zhang 等发现 LATS1 过表达能有效地抑制 YAP 的活性, 并对乳腺癌细胞中上皮间叶细胞转变迁移产生了抑制作用结合目前文献资料, LATS1 可能靶向调节 YAP 并且对某些肿瘤发生发展产生重要的作用, 但目前相关研究还较少, 需要进一步探讨近来研究指出, LATS1 为抑癌因子, 但 LATS1 在 NSCLC 的研究尚未见报道, 本研究通过构建过表达 LATS1 的慢病毒载体, 稳定转染 A549 细胞株, 并采用 RT-PCR Western blot 验证 LATS1 有效的高表达后, YAP mrna 及蛋白的表达量变化, 并通过 CCK-8 实验绘制增殖曲线流式细胞术检测转染 LATS1 后 A549 细胞周期及凋亡情况结果表明, 高表达 LATS1 使 A549 细胞 G 1 期比例明显增高, S 期比例明显下降 ; 过表达 LATS1 的 A549 细胞的增殖能力明显降低, 细胞凋亡率明显增高实验结果提示, LATS1 基因可能通过诱导 A549 细胞停滞在 G 1 期, 而降低 A549 细胞增殖能力, 并引起 A549 细胞凋亡率增高这与 [12] LATS1 在宫颈癌方面的研究结果基本符合另一方面, 通过 RT-PCR Western blot 检测有效过表达 LATS1 的 A549 细胞中 YAP mrna 及蛋白的表达, 发现 YAP mrna 及蛋白的表达量均明显减低, 提示在 A549 细胞中过表达 LATS1 可能对 YAP 产生了抑制作用上调 LATS1 对 A549 细胞生物学行为产生的作用可能与癌基因 YAP 的表达量降低有关 LATS1 和 YAP 相互作用机制还需进一步实验明确从目前研究结果来看, 进一步针对 LATS1 在 NSCLC 侵袭能力体内致瘤性方面的影响及相关机制研究非常必要 LATS1 在非小细胞肺癌的发生发展过程中可能起着重要的作用, 然而关于 LATS1 抑癌作用的产生机制及与其他通路的相互作用关系还十分复杂, 有待于进一步深入研究全面深入地研究 LATS1 可为肺癌的诊断治疗提供新的策略和靶点参考文献 (References) 1 Han ZL, Wei XS, Fang MC, Xiang RW, Wei PL, Ai SW. Cigarette smoking status and smoking cessation counseling of chinese physicians in wuhan, hubei province. Asia pac J public health. 2008; 20(3): Thomas JL, Bronars CA, Stewart DW, Okuyemi KS, Befort CA, Nazir N, et al. Psychometric properties of a brief Smoking consequences questionnaire for adults (SCQ-A) among african American light smokers. Subst Abus 2009; 30(1): Harvey K F, Pfleger CM, Hariharan IK. The drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell 2003; 114(4): Udan RS, Kango SM, Nolo R, Tao C, Halder G. Hippo promotes proliferation arrest and apoptosis in the Salvador/Warts Pathway. Nat Cell Biol 2003; 5(10): Halder G, Johnson RL. Hippo signaling: Growth control and beyond. Development, 2011; 138(1): Takahashi Y, Miyoshi Y, Takahata C, Irahara N, Taguchi T, Tamaki Y, et al. Down-regulation of LATS1 and LATS2 mrna expression by promoter hypermethylation and its association with biologically aggressive phenotype in human breast cancers. Clin Cancer Res 2005; 11(4): Jiang Z, Li X, Hu J, Zhou W, Jiang Y, Li G, et al. Promoter hypermethylation-mediated down-regulation of LATS1 and LATS2 in human astrocytoma. Neurosci Res 2006; 56(4): Visser S, Yang X. Identification of LATS1 transcriptional targets in hela cells using whole human genome oligonucleotide microarray. Gene 2010; 449(12): Salah Z, Melino G, Aqeilan RI. Negative regulation of the Hippo pathway by E3 ubiquitin ligase ITCH is sufficient to promote tumorigenicity. Cancer Res 2011; 71(5): Zeng Q, Hong W. The emerging role of the hippo pathway in cell contact inhibition, organ size control, and cancer development in mammals. Cancer Cell 2008; 13(3): Overholtzer M, Zhang J, Smolen GA, Muir B, Li W, Sqroi DC, et al. Transforming properties of YAP, a candidate oncogene on the chromosome 11q22 amplicon. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103(33): Liu AM, Xu MZ, Chen J, Poon RT, Luk JM. Targeting YAP and Hippo signaling pathway in liver cancer. Expert Opin Ther Targets 2010; 14(8): Wang Y, Dong Q, Zhang Q, Li Z, Wang E, Qiu X. Over expression of yes-associated protein contributes to progression and poor prognosis of non-small-cell lung cancer. Cancer Sci 2010; 101(5): Hao Y, Chun A, Cheung K, Rashidi B, Yang X. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP. J Biol Chem 2008; 283(9): Zhang J, Smolen G A, Haber DA. Negative regulation of YAP by LATS1 underscores evolutionary conservation of the Drosophila Hippo pathway. Cancer Res 2008; 68(8):

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot