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1 ( ) JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)016Vol.56No a b a a a ( a. ; b ) : -l(fibroblast-specificprotein-1fsp-l) Transwel MD-M-31 ESF; RT-qPCR MD-M-31 ESF FSP-1 mrn ; MD-M-31 ESF FSP-1 ;CelCounting Kit-8(CCK-8) MD-M-31 ; FSP-1 FSP-1 MD-M-31 ESF ESF FSP-1 MD-M-31 ;ESF+MD-M-31 MD-M-31 FSP-1 MD-M-31 FSP-1 ; MD-M-31 ESF FSP-1 FSP-1 : -1; ; : R737.9 ;R-33 : : (016) DOI: /j.cnki.ncdm Up-RegulationandSignificanceofFSP-1inHuman FibroblastsCo-CulturedwithreastCancerCels LIU Huan a LIWen-lin b CHENShao-fen a WU Hong a SHIXiao-yu a (a.departmentof Histology and EmbryologyColegeof asic Medicine; b.jiangxi Key Laboratoryof MedicaliologyNanchang UniversityNanchang330006China) STRCT:Objective Toinvestigatethemolecularmechanismsofactionofstromalfibroblasts onbreastcancerandtostudytheexpressionoffibroblast-specificprotein-1(fsp-1)anditsim- pactonbreastcancergrowth.methods HumanbreastcancerMD-M-31celsandhumanen- dometrialstromalfibroblasts(esf)wereco-culturedintranswelsystemorculturedalone.the expressionoffsp-1mrn wasexaminedin MD-M-31celsandESFbyRT-qPCR.Theex- pressionoffsp-1proteinwasdetectedbyimmunofluorescenceflowcytometry.theproliferation ofmd-m-31celswastestedusingcelcounting Kit-8.TheexpressionofFSP-1inbreast cancertissueoftumor-burdenednudemicewasanalyzedusingimmunofluorescenceconfocallaser microscopyandtheefectoffsp-1ontumorvolumewasexamined.results Theexpressionof FSP-1wasup-regulatedin ESFco-cultured with MD-M-31celsandtheup-regulationof FSP-1promotedtheproliferationof MD-M-31cels.FSP-1 wasexpressedin MD-M-31 : : (919118) : (1985 ) : [email protected]

2 celsco-culturedwithesfbutnotin MD-M-31celsculturedalone.InadditionFSP-1washighly expressedinthecancertissuewithco-growthofmd-m-31celsandesfinnudemiceandthehigh expressionoffsp-1acceleratedtumorgrowth.conclusion Theco-culturewithhumanbreastcancer celscanup-regulatefsp-1expressionandpromotebreastcancergrowth. KEY WORDS:fibroblast-specificprotein-1;humanfibroblasts;breastcancer;co-culture (ESF+MD-M-31 ) Transwel ; [1] [-5] Transwel ESF MD-M-31 [6] ESF MD-M-31 ( ESF MD-M-31 ) 1.3 RT-qPCR 3 4 Trizol -l(fibroblast-specific ThermoScientific )qpcr IQ SYR GreenSupermix( io-rad )Transwel ( 0.4μm FisherScientifi ) ( ) )CelCounting Kit-8(CCK-8) ( eyotime ) (3 6 ) FSP-1 : 5 -CCCC- ( SCXK( )01-000) GCTCCGT-3 5 -TTCG- FSP-1( bcam )FSP % ESF MD-M-31 30min0.1%TritonX min5% 10% 100 U ml μg S 60 min 37 ml -1 DMEM-H hps 3 /IgG- 37 5%CO 80% ~90% FITC 60minPS 3 Transwel 6 500μLFCM bufer ESF MD-M-31 RN DEPC-H O protein1fsp-l) μlrn 60nm/ 80nm RN RN 60nm/80nm>.0 <.3 cdn : RN10μL( 0.7μg) 1μL 1 5 5μLRN 1μL(0U 1.1 μl -1 )mix-dntpμl(10 mm)mmlv 1μL 0μL 5 5 min37 CCC-ESF-1( ESF 60min70 5 min -0 ) cdn PCR :10 μl IQ MD-M-31( SYR GreenSupermix8μL cdn(10μmol) )DMEM-H ( LifeTech-Gibco 1 μl (10 μmol) 1 μl )RevertidfirststrandcDN ( (10μmoL) 0μL 50 3min95 3min;95 8s63 35s39 ;73 7min ; 64~94 PCR io-radcfx Manager GCGCCCCGT PS

3 : CCK-8 MD-M ESF FSP-1 mrn ESF (P<5) ESF FSP-1mRN 4 MD-M-31 CCK-8 ESF FSP-1 mrn ;ESF 0μLCCK FSP-1 h 100μL 96 (P>5) 450nm (OD ) FSP-1 MD-M-31 = OD / ( 1):ESF+MD-M-31 OD 100% ESF FSP ESF FSP ESF FSP-1 3 :ESF+MD-M-31 MD-M ESF MD-M-31 7hPS 100μL :V(mm 3 )=ab / [7] 30 10% 3 4 FSP-1 ( HE ) ESF+MD-M-31 MD-M-31 FSP-1 3 FSP-1 MD-M-31 FSP (P<5) 4 MD-M-31 10% FSP-1 3 (P>5) FSP-1 : 1 M ( ):MD-M-31 FSP-1 (ph6.0) ESF+ MD-M-31 3 PS 3 1%S37 30 min 3 MD-M-31 FSP MD-M-31 FSP-1 30minPS minps 3 5 min 3 DPI 10 minps 3 ESF Image-ProPlus SPSSStatistics x±s t P< MD-M-31 ESF FSP-1 RT-qPCR ( 1):ESF+MD-M- RT-qPCR ( : 10 6 MD-M ESF ) FSP-1 1d 4 (a) (b). ESF 5mm MD-M-31 FSP-1 RT-qPCR ( ):MD-M-31 ESF FSP-1 mrn ESF+MD-M t/d

4 4 3 4 ESF :RT-qPCR ESF FSP-1mRN ;: ESF FSP-1 P<5;P>5ESF+MD-M-31 vs 3 4 ESF+ MD-M-31 3 vs 4 ; P>5 1 MD-M-31 ESF FSP-1.3 MD-M-31 FSP-1 ESF+MD-M-31 MD-M-31 FSP-1 (P < 6 MD-M C) (P<5) 5 3 1: ESF+MD-M-31 MD-M-31 0 ESF+MD-M-31 3 ESF+MD-M- MD-M-31 (P<5) 31 MD-M-31 3 FSP-1 (P<5) 3 MD-M-31.4 ESF+MD-M-31.4 FSP-1.0 HE : ( 4) 0.8 : 0.4 FSP-1ESF+MD-M-31 FSP-1MD-M MD-M-31 FSP-1 mrn t/d 3 4 MD-M-31 :RT-qPCR MD-M-31 FSP-1 mrn ;: MD-M-31 FSP-1 P<5P>5 ESF MD-M-31 FSP-1

5 刘 欢等 与乳腺癌细胞共培养的人成纤维细胞特异蛋白 1 表达上调及意义 5 3.0 MD-M-31 组 ESF+MD-M-31 组.5.0 MD-M-31 细胞活力 对照组值设为 100% MD-M-31 细胞增殖 450 nm 时间 t/d MD-M-31 组 ESF+MD-M-31 组 时间 t/d 分别在细胞 培 养 第 1 6 天 收 集 MDA MB 231 细 胞 A CCK 8 细 胞 增 殖 实 验 结 果 B MDA MB 231 细 胞 增 殖 活 力 05 P 0 05 P 0 图 3 与人成纤维细胞 ESF 共培养促进人乳腺癌细胞 MDA MB 231 增殖 C FSP-1 免疫荧光强度 ES MD-M-31 组 ESF+MD-M-31 组 F +M D -M - 31 组 M D -M - 31 组 在 MDA MB 231 细胞和 ESF 细胞接种于裸鼠的第 30 天 将 荷 瘤 裸 鼠 颈 椎 脱 臼 处 死 A HE 染 色 光 学 显微镜观察荷瘤裸鼠乳腺肿瘤组织 B 免疫荧光激光共聚焦显微镜观 察 荷 瘤 裸 鼠 乳 腺 肿 瘤 组 织 FSP 1 的 表 达 C Image Pr op l us软件分析荧光强度的结果 P 0 05 图 4 荷瘤裸鼠乳腺癌细胞和成纤维细胞共生长的癌组织高表达 FSP 1 表 1 裸鼠移植瘤体积 组别 n 10d 12d x±s V mm3 14d 16d 18d 20d MDA MB 231 组 131 89±7 18 150 95±10 11 167 75±13 01 228 01±15 12 283 18±16 35 345 04±18 13 ESF MDA MB 231 组 132 50±7 22 151 13±9 16 组别 167 97±12 66 227 81±14 84 282 73±16 45 371 67±19 32 n 22d 24d 26d 28d 30d MDA MB 231 组 410 06±20 57 473 34±22 52 536 79±23 86 602 66±25 09 664 38±27 57 ESF MDA MB 231 组 493 78±21 47 592 96±24 81 707 23±28 04 819 44±31 81 955 35±34 85 05 与 MDA MB 231 组比较 P 0

6 6 3 [8] FSP-1 FSP-1 FSP-1 (cancer-associatedfibroblastscfs) [49-10] FSP-l S100 4(S100calci- um binding protein 4S1004) FSP-1 [11] 10ku FSP-1 FSP-1 FSP-1 FSP-1 : [1-14] [1] FSP-1 ties[j].reastcancer(uckl)0159(s):7-15. FSP-1 FSP (1): FSP-1 FSP-1 FSP-1 topathol01631(4): [6] FSP ():1-0. [7] [J]. [15] Rev0133(1/): ofthecoin[j].mjcancerres0111(4): [16] FSP ; FSP-1 FSP-1 FSP-1 FSP-1. [J]. 0154(13): blasts:theirrolesintumorinitiationprogressionandclinical applications[j].frontmed01610(1): [] Qiao Gu FGuo Xetal.reastcancer-associatedfibro- [3] RothschildEanerjeeD.Subvertingsubversion:areviewon thebreastcancermicroenvironmentandtherapeuticopportuni- [4] LuoHTuGLiuZetal.Cancer-associatedfibroblasts:amul- tifaceteddriverofbreastcancerprogression[j].cancerlet [5] JungY YKim H MKooJS.Theroleofcancer-associatedfi- broblastsin breast cancer pathobiology [J].Histol His-.Caveolin-1siRN [J].. 15 I 0063(1): [8] MaoYKelerETGarfieldD Hetal.Stromalcelsintumor microenvironmentand breastcancer[j].cancer Metastasis [9] CirriPChiarugiP.Cancerassociatedfibroblasts:thedarkside [10] uckleyc D.Whydoeschronicinflammationpersist:anun- expectedroleforfibroblasts[j].immunollet011138(1): [11] DonatoRCannonRSorciGetal.FunctionsofS100pro- teins[j].currmolmed01313(1):4-57. ( 1 )

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12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

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摘 要

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