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1 668 第三军医大学学报,2017,39(7) htp://aammt.tmmu.edu.cn DOI: /j 吉非替尼联合二甲双胍对 EGFR TKIs 原发性耐药非小细胞肺癌 H1975 细胞的抑制作用及其机制研究 潘永红, 焦 琳, 林采余, 卢从华, 王玉波, 陈恒屹, 李 力, 何 勇 ( 重庆, 第三军医大学大坪医院呼 吸内科 ) [ 摘要 ] 目的探讨吉非替尼联合二甲双胍对肺癌 H1975 细胞的抑制增效作用及其机制 方法 采用 MTT 克隆形成实验观察吉非替尼与二甲双胍单用及联用对原发性耐药非小细胞肺癌 H1975 细胞增殖活性的影响 ;Matrigel 包被的 Transwel 小室检测细胞侵袭能力 ; 划痕愈合实验检测细胞迁移能力 ;TUNEL 检测细胞凋亡率 ;Westernblot 免疫荧光法检测凋亡和上皮细胞 间充质转化 (epithelialto mesenchymaltransition,emt) 相关蛋白的变化 结果吉非替尼联合二甲双胍组对 H1975 细胞增殖 侵袭及迁移抑制效应优于吉非替尼组, 协同增效作用明显 (P<0.05); 吉非替尼和二甲双胍单用时较对照组的细胞凋亡率增加, 当两者联合作用时细胞凋亡率增加更显著 (P<0.05), 且明显下调抗凋亡相关蛋白 (Bcl xl Mcl 1) 和上调促凋亡蛋白 Bax; 两药联用明显逆转 H1975 细胞 EMT 的发生 ; 间质细胞相关蛋白 (Vimentin N cadherin Slug Snail) 表达水平降低, 上皮细胞相关蛋白 E cadherin 表达水平升高 结论吉非替尼联合二甲双胍可显著抑制 EGFR TKIs 原发性耐药非小细胞肺癌 H1975 细胞的增殖 侵袭和迁移, 促使肿瘤细胞凋亡 ; 其机制可能通过激活线粒体凋亡途径及逆转 EMT 的发生来发挥抗肿瘤作用 [ 关键词 ] 二甲双胍 ; 吉非替尼 ; 原发性耐药 ;T790M 突变 ; 上皮细胞 间充质转化 ; 凋亡 [ 中图法分类号 ] R734.2;R965;R979.1 [ 文献标志码 ] A Inhibitoryefectandmechanism ofgefitinibcombinedwithmetforminonegfr TKIintrinsicresistantNSCLCH1975cels PanYonghong,JiaoLin,LinCaiyu,LuConghua,WangYubo,ChenHengyi,LiLi,HeYong(Departmentof RespiratoryDiseases,InstituteofSurgeryResearch,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing, ,China) [Abstract] Objective Toinvestigatethesynergisticinhibitoryefectofgefitinibcombinedwith metforminonnon smalcellungcancercellineh1975withintrinsicresistancetoegfr tyrosinekinase inhibitors(tkis),andexploretheunderlyingmechanism.methods AfterH1975celsweretreatedby gefitinibor/andmetformin,mttasayandcolonyformationasaywereusedtoobservetheproliferationofthe cels.celinvasionwastestedbymatrigel coatedtranswelchamberasay,andmigration abilitywas measuredbywoundhealingasay.tunelasaywasemployedtoobserveapoptoticrate.theproteinlevelsof apoptosis and epithelial to mesenchymal transition (EMT) related proteins were asayed by immunofluorescenceasayandwesternbloting.results Gefitinibcombinedwithmetforminshowedmore obviouslysynergisticinhibitoryefectontheproliferation,invasionandmigrationinh1975celsthangefitinib alone(p<0.05).ascomparedtotheuntreatedcontrolcels,gefitinibandmetforminalonepromotedthecel apoptosis.theircombinationinducedanevenhigherapoptoticrateinh1975cels(p<0.05),down regulatedanti apoptoticproteinsbcl xlandmcl 1,up regulatedpro apoptoticproteinbax,enhancedtheemt reversion,decreasedtheexpresionlevelsofmesenchymalmarkers,vimentin,n cadherin,slug,snailwhile increasedtheepithelialmarkere cadherin.conclusion Combinationofgefitinibandmetforminremarkably inhibitsthegrowth,invasionandmigrationandinducestheapoptosisininherentegfr TKIsresistantH1975 [ 通信作者 ] 何勇,E mail:heyong8998@126.com [ 优先出版 ] htp://

2 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2017,39(7) 669 cels.thepotentialmechanism forantitumormightbeduetotheiractivationonmitochondrialapoptosis pathwayandemtreversal. [Keywords] metformin;gefitinib;primaryresistance;t790m mutation;epithelialtomesenchymal transition;apoptosis Corespondingauthor:HeYong,E 肺癌目前是世界上最常见 死亡率最高的恶性肿瘤, 其中非小细胞肺癌 (nonsmalcellungcancer, NSCLC) 占肺癌总数的 85% [1] 第 1 代可逆性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂 (epidermalgrowthfactor receptortyrosinekinaseinhibitors,egfr TKIs) 吉非替尼 (Gefitinib) 和厄洛替尼 (Erlotinib) 对 EGFR 敏感突变肺癌患者有确切的疗效 [2-3] 其中有 20%~30% 的肺癌患者对 EGFR TKIs 药物产生原发性耐药 [4], 即使对 EGFR TKIs 药物初始有效的患者最终都会产生获得性耐药 目前, 大部分获得性耐药机制及耐药后治疗策略已被提出并论证, 而关于原发性耐药的研究甚少 原发性耐药严重限制了 EGFR TKIs 的临床应用 因此, 目前临床尚缺乏有效的治疗手段 因此, 探讨针对 EGFR TKIs 原发性耐药的治疗方案具有重要的临床应用价值 二甲双胍作为一种口服双胍类降糖药物, 不仅经济 安全, 还被证明有潜在良好的抗肿瘤作用 我们前期的研究结果证实, 二甲双胍在体内 外均可克服肺癌细胞对 EGFR TKIs 的获得性耐药 [5] 为此, 我们进一步观察二甲双胍是否能克服 EGFR TKIs 原发性耐药 本实验通过研究吉非替尼和二甲双胍联合对原发性耐药非小细胞肺癌 H1975 细胞的疗效, 探究其作用机制, 旨在为临床联合治疗提供理论依据 1 材料与方法 1.1 材料与试剂人肺癌细胞株 H1975 购自美国国家细胞库 (ATCC), 二甲双胍 吉非替尼 MTT 购自 Sigma 公司, RPMI1640 培养基购自 HyClone 公司, 胎牛血清购自 Gibco 公司,TUNEL 试剂盒购自 Milipore 公司,Bcl xl Mcl 1 Bax Vimentin N cadherin Slug Snail E cadher in GAPDH 等抗体购自美国 CST 公司, 山羊血清 荧光标记山羊抗兔 IgG 抗体 荧光标记山羊抗鼠 IgG 抗体 山羊抗兔 IgG 抗体购自美国 Abcam 公司 1.2 方法 细胞培养人肺癌细胞株 H1975 培养于含 10% 胎牛血清,100μg/mL 青 链霉素的 RPMI1640 培养基, 培养于 37 90% 湿度 5%CO 2 的培养箱中 MTT 检测药物细胞毒性收集处于对数生长期的细胞, 按每孔 个细胞接种 96 孔板, 培养 12h 后弃上清液, 每个实验孔加入含不同浓度的二甲 双胍 吉非替尼培养基 200μL 在培养箱中继续培养 48h 后, 每孔加入 MTT(5mg/mL)20μL,37 培养 4h, 加入二甲基亚砜 (DMSO)150μL, 检测前轻摇混匀, 使用酶联检测仪在波长 490nm 处检测各孔的光密度值 [D(490)] 按照以下公式计算细胞增殖抑制率 细胞增殖抑制率 =[( 对照组光密度值 - 药物处理组光密度值 )/ 对照组光密度值 ] 100% 实验重复 3 次 划痕实验收集处于对数生长期细胞, 按每孔 个细胞接种 6 孔板, 培养 12h 后弃上清液, 实验设对照组 ( 正常细胞 ) 和不同药物作用实验组, 实验孔分别加入 5mmol/L 二甲双胍 4μmol/L 吉非替尼以及两药联合培养基 4mL 在培养箱中继续培养 48h 后, 用 10μL 枪头垂直划痕, 更换含 5% 胎牛血清的培养基, 于 0 24h 在显微镜下拍照 实验重复 3 次 侵袭实验采用 Boyden Chamber 分析法 将具有孔径为 8μmPET 膜的 Milicel 小室放入 24 孔培养板中, 用基质胶 Matrigel50μL/ 孔包被 Milicel 小室的底部,37 过夜使其成凝胶状 将对照组与不同实验处理组的 H1975 细胞以胰酶消化并收集后, 以含 1% 胎牛血清的 RPMI1640 培养液制成细胞悬液, 调整细胞密度为 个 /ml, 以 100μL/ 孔接种于上室, 下室中加入 600μL 含 10% 胎牛血清的培养基 37 培养 48h, 取出 Milicel, 用棉签小心擦去微孔滤膜上层细胞, 以 4% 多聚甲醛固定 30min, 结晶紫染色 30min 光镜下计数滤膜下层的细胞数 实验重复 3 次 TUNEL 实验收集处于对数生长期细胞, 按每孔 个细胞接种于铺有载玻片的 6 孔板上, 培养 12h 后细胞贴附于玻片, 对照组更换新鲜培养基, 实验组更换二甲双胍 吉非替尼以及两药联合培养基 4mL, 继续培养 48h 后进行 TUNEL 检测, 实验过程及步骤严格依照 TUNEL 检测试剂盒产品说明进行, 显微镜下对阴性细胞及阳性细胞进行计数 实验重复 3 次 免疫荧光染色收集处于对数生长期细胞, 按每孔 个细胞接种 6 孔板, 培养 12h 后弃上清液, 对照组更换新鲜培养基 4mL, 实验孔分别加入二甲双胍 吉非替尼以及两药联合培养基 4mL, 继续培养 48h 后弃培养基,4% 多聚甲醛固定 30min,5% 普通山羊血清封闭 30min, 用 E cadherin 抗体 1 50 稀释 Vimentin 抗体 稀释后置于 4 孵育过夜, 荧光二抗避光孵育 1h,DAPI 避光孵育 15min, 显微镜下

3 6 第三军医大学学报 2 1 3 对阴性细胞及阳性细胞进行计数 实验重复 3次 1 W nb 检测 收集并提取对照组及各 实验组细胞蛋白溶液 根据 BCA法蛋白定量试剂盒说明 测定蛋白浓度 样品蛋白通过 1 S DS 聚丙烯酰胺凝胶 电泳 PAGE 分 离 后 经 半 干 转 膜 仪 转 至 聚 偏 氩 乙 烯 5 脱脂奶粉常温封闭 1h 一抗 1 1 PVDF 膜上 4 孵育过夜 二抗 1 5 常温孵育 1h ECL发光显 影液显影 B R d成像系统采集图像 实验重复 3次 1 3 统计学处理 采用 SPS S1 3 统计软件进行分析 计量资料以 x 珋±表示 对二甲双胍组 对照组 吉非替尼组 二甲 双胍 吉非替尼联合培养组细胞存活率 细胞凋亡率 等指标组间差异采用单因素方差分析 两两比较采用 LSD 检验 检验水准 α 5 2 结果 h p mm mmu d u c n # $ A 对照组 B 二甲双胍组 C 吉非替尼组 D 二甲双胍 1 二甲双胍与吉非替尼联用对 H1 5细胞增殖的 影响 以 5mm L二甲双胍和 4μm L吉非替尼分别 作用 H1 5细胞 48h后 通过 MTT实验及克隆形成 实 验 检 测 未 见 明 显 的 抑 制 作 用 但 当 吉 非 替 尼 4μm L 联合二甲双胍 5mm L 后 明 显 抑 制 H1 5细胞的增殖能力 P 5 图 1 2 #$%&(' ) ) ) # $ % & & ' % () P 1 与二甲双胍 吉非替尼联合培养组比较 1 对照组 2 二甲双胍组 3 吉非替尼组 4 二甲双胍 吉 非替尼联合培养组 图 1 MTT检测各组 H1 5细胞的存活率 %&& ' %&& ' 吉非替尼联合培养组 图 2 克隆形成实验检测各组 H1 5细胞克隆形成能力比较 2 二甲双胍与吉非替尼联用对 H15细胞侵袭 迁移能力的影响 以 5mm L二甲双胍和 4μm L吉非替尼处理 H15细胞后通过侵袭实验 划痕实验检测发现 两药 联合组与单药组细胞相比 细胞侵袭到 T n w 小室 M g 胶下面的细胞数显著降低 细胞迁移至创伤区 的能力明显减弱 图 3 4 3 二甲双胍联合吉非替尼对 H1 5细胞凋亡的影响 以 5mm L二甲双胍和 4μm L吉非替尼处理 H15细胞后通过 TUNEL实验发现 各单药组细胞凋 亡率 较 对 照 组 增 高 与 二 甲 双 胍 组 2 1± 1 25 及吉非替尼组的凋亡率 21 5±1 5 相比 两 药 联 用 后 H15细 胞 凋 亡 率 3 5 5± nb 检测结果同样发现 3 显著增加 W 二甲双胍 吉非替尼联合培养组处理 H1 5细胞较 二甲双胍组 吉非替尼组 促凋亡蛋白 B x表达增高 x Mc 1表达降低 图 5 6 抗凋亡蛋白 Bc %&& ' # %&& ' A 对照组 B 二甲双胍组 C 吉非替尼组 D 二甲双胍 吉非替尼联合培养组 图 3 T n w 实验检测各组 H1 5细胞侵袭能力 $

4 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2017,39(7) 671 图 4 划痕形成实验检测各组 H1975 细胞迁移能力 ( 10) A: 对照组 ;B: 二甲双胍组 ;C: 吉非替尼组 ;D: 二甲双胍 + 吉非替尼联合培养组 图 5 TUNEL 检测各组 H1975 细胞凋亡的变化 1: 对照组 ;2: 二甲双胍组 ;3: 吉非替尼组 ;4: 二甲双胍 + 吉非替尼联合培养组图 6 Westernblot 检测各组 H1975 细胞促凋亡蛋白 Bax 以及抗凋亡蛋白 Bcl xl Mcl 1 的表达 2.4 二甲双胍联合吉非替尼对肺癌 H1975 细胞上皮细胞 间充质转化 (epithelialtomesenchymaltran sition,emt) 标志分子表达的影响选取 3 种处于对数生长期的肺癌细胞株, 使用 Westernblot 检测各细胞株中 E cadherin Vimentin 的蛋白表达水平 结果显示, 吉非替尼原发性耐药肺癌细胞株 H1975 较吉非替尼敏感肺癌细胞株 PC 9 HCC827 显示出了 EMT 转变特征, 具体表现为 E cad herin 表达水平低,Vimentin 表达水平高 ( 图 7) 为明确二甲双胍协同吉非替尼对原发性耐药肺癌 H1975 细胞的抑制作用是否与逆转 EMT 有关, 设计实验分组同 2.2, 免疫荧光和 Westernblot 检测 H1975 细胞中 EMT 标志分子的表达差异 两药联合作用 48h 后细胞间质标志 Vimentin 荧光定量和蛋白表达量较单药组均明显降低,Snail Slug N cadherin 蛋白表达量较单药组明显减少 ; 细胞上皮标志 E cadherin 荧光定量和蛋白表达量较单药组均增加 ( 图 8 9) #$% 1:H1975;2:HCC827;3:PC 9 图 7 Westernblot 检测耐药肺癌 H1975 细胞 敏感肺癌 HCC827 细胞及敏感肺癌 PC 9 细胞中 E cadherin Vimentin 蛋白的表达

5 62 第三军医大学学报 2 1 3 &'()*+,-. / # #$% h p mm mmu d u c n $%&'()*+,-./# ()*+# $%&'# 图 8 免疫荧光染色法检测各组作用 H1 5细胞后 EMT相关分子 E c dh n V m n n荧光定量的表达 # $ %&'()*+,-#./# 0,1*-2,-.3/# 4&'()*+,-$//# 3 讨论 可逆性 EGFR 药物 如吉非替尼 是用于治 5678#//# 疗非小细胞肺癌的重要靶向药物 但 EGFR 原发 5-',69/# 性耐药肺癌患者不能从中获益 使人们不断寻找新的 :;<=>#3/# 治疗方法 EGFR 原发性耐药的发生机制包 括 1 对照组 2 二甲双胍组 3 吉非替尼组 4 二甲双胍 吉 非替尼联合培养组 图 W nb 检测各组作用 H1 5细胞后 EMT相 PTEN缺 失 MET扩 增 和 TM 基 因 突 变 等 6 在 EGFR 治疗前 约有 3 的肿瘤标本存在 T M 关 分 子 E c dh n V m n n N c dh n S ug 突变 导致 EGFR 原发性耐药 针对 T M突 Sn 蛋白水平的变化 变的肺癌患者 二代不可逆 EGFR 如阿法替尼

6 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2017,39(7) 673 对 T790M 突变肺癌细胞有一定的抑制作用, 但毒副作用大且不能有效提高患者的总生存期 [8] 三代不可逆 EGFR TKIs( 如 AZD9291 和 CO 1686) 可阻断 T790M 突变, 但这些新研发 EGFR TKIs 药物的面世并应用于临床治疗尚待时日 [9-10] 因此, 本研究拟寻求简单 有效 经济的联合用药方案以增强 EGFR TKIs 原发性耐药肺癌患者对一代 EGFR TKIs 的敏感性 二甲双胍广泛应用于 2 型糖尿病患者的降糖治疗, 能有效降低糖尿病患者肿瘤的发生率及肿瘤相关死亡率 [11] 我们回顾性研究发现, 与其他降糖药物相比, 服用 EGFR TKIs 治疗的非小细胞肺癌合并糖尿病患者使用二甲双胍降糖治疗的中位无进展生存期明显延长 [12] 我们前期研究证实, 二甲双胍通过抑制 IL 6/STAT3 信号通路协同增强 EGFR TKIs 对 EGFR TKIs 获得性耐药肺癌细胞的杀伤作用 [5] 于是我们希望验证吉非替尼联合二甲双胍是否能协同抑制 EGFR TKIs 原发性耐药肺癌细胞 在本课题中, 我们发现吉非替尼联合二甲双胍对比吉非替尼单药明显抑制原发性耐药肺癌 H1975 细胞的增殖 侵袭和迁移, 并深入探讨两药联合作用机制 本研究结果显示, 吉非替尼与二甲双胍联用使细胞中 Bcl xl Mcl 1 蛋白表达明显减少, 而 Bax 蛋白表达明显增加 这说明两药联用的确有协同增效作用, 且对原发性耐药肺癌 H1975 细胞的增殖抑制作用可能是通过促进其发生线粒体凋亡实现的 EMT 的发生与 EGFR TKIs 原发性耐药密切相关 [13] 我们发现 EGFR TKIs 原发性耐药肺癌 H1975 细胞存在 EMT 改变, 该细胞与 EGFR TKIs 敏感的 HCC827 PC 9 细胞相比, 上皮标志物 E cadherin 表达低, 间质标志物 Vimentin 表达高 当用吉非替尼处理 H1975 细胞后, 上皮标志物 E cadherin 及间质标志物 N cadherin Vimentin Slug Snail 表达未见明显变化, 提示吉非替尼不能逆转 H1975 细胞发生的 EMT 改变 有研究证实, 二甲双胍可以逆转子宫内膜腺癌细胞及卵巢肿瘤干细胞发生 EMT 转变 [14-15] 当用吉非替尼联合二甲双胍处理原发性耐药 H1975 细胞后, 显著升高 E cadherin 蛋白表达水平, 降低 Vimentin 蛋白表达水平, 说明二甲双胍可以明显逆转 H1975 细胞的 EMT 改变 我们进一步发现吉非替尼与二甲双胍联用能够降低肺癌 H1975 细胞中 Snail Slug 的蛋白表达水平 Snail Slug 是含锌指结构的核转录因子, 对 E cadherin 的转录表达起到直接抑制作用 [16], 说明二甲双胍通过 影响 Snail 及 Slug 参与 E cadherin 蛋白的转录调控进而抑制肺癌 H1975 细胞 EMT 的发生 发生 EMT 的肿瘤细胞由于细胞间连接的缺失而更容易侵袭和迁移, 因此, 两药联用抑制 H1975 细胞的侵袭和迁移与 EMT 逆转有关 综上所述, 本研究发现吉非替尼联合二甲双胍对 EGFR TKIs 原发性耐药肺癌 H1975 细胞具有抑制增效作用, 其作用机制是激活线粒体凋亡途径及逆转 EMT 的发生 在后续研究中将继续探讨具体调控的信号通路, 为今后临床联合用药奠定更加有力的理论基础 参考文献 : [1] HerbstRS,HeymachJV,LippmanSM.Lungcancer[J]. NEnglJMed,2008,359(13): DOI: /NEJMra [2]MokTS,WuYL,ThongprasertS,etal.Gefitiniborcarbo platin paclitaxelinpulmonaryadenocarcinoma[j].nenglj Med,2009,361(10): DOI: /NEJMoa [3] RoselR,CarcerenyE,GervaisR,etal.Erlotinibversus standardchemotherapyasfirst linetreatmentforeuropeanpa tientswithadvancedegfr mutation positivenon smal cel lungcancer(eurtac):amulticentre,open label,random isedphase3trial[j].lancetoncol,2012,13(3): doi: /s (11)70393 X [4] MaemondoM,InoueA,KobayashiK,etal.Gefitinibor chemotherapyfornon smal cellungcancerwithmutatedeg FR[J].N EnglJMed,2010,362(25): DOI: /NEJMoa [5] LiL,HanR,XiaoH,etal.MetforminsensitizesEGFR TKI resistanthumanlungcancercelsinvitroandinvivo throughinhibitionofil 6signalingandEMTreversal[J]. ClinCancerRes,2014,20(10): DOI: / CCR [6] WangJ,WangB,ChuH,etal.IntrinsicresistancetoEGFR tyrosinekinaseinhibitorsin advanced non smal cellung cancerwithactivatingegfrmutations[j].oncotargetst her,2016,9: doi: /ot.s [7] SuKY,ChenH Y,LiKC,etal.Pretreatmentepidermal growthfactorreceptor(egfr) T790M mutation predicts shorteregfr tyrosinekinaseinhibitorresponsedurationin patientswithnon smal cellungcancer[j].jclinoncol, 2012,30(4): DOI: /JCO

7 674 第三军医大学学报,2017,39(7) htp://aammt.tmmu.edu.cn [8]MilerVA,HirshV,CadranelJ,etal.Afatinibversuspla ceboforpatientswithadvanced,metastaticnon smal cel lungcancerafterfailureoferlotinib,gefitinib,orboth,and oneortwolinesofchemotherapy(lux Lung1):aphase2b/ 3randomisedtrial[J].LancetOncol,2012,13(5): DOI: /S (12) [9] ThresKS,PaweletzCP,FelipE,etal.AcquiredEGFR C797SmutationmediatesresistancetoAZD9291innon smal cellungcancerharboringegfr T790M[J].NatMed, 2015,21(6): DOI: /nm.3854 [10] SequistLV,SoriaJC,GoldmanJW,etal.Rociletinibin EGFR mutatednon smal cellungcancer[j].n EnglJ Med,2015,372(18): DOI: /NEJ Moa [11] LeoneA,DiGennaroE,BruzeseF,etal.Newperspective foranoldantidiabeticdrug:metforminasanticanceragent [J].CancerTreatRes,2014,159: DOI: / _21 [12]ChenH,YaoW,ChuQ,etal.Synergisticefectsofmet forminincombinationwithegfr TKIinthetreatmentofpa tientswithadvancednon smalcellungcancerandtype2 diabetes[j].cancerlet,2015,369(1): doi: /j.canlet [13]ParkKS,RafeldM,MoonYW,etal.CRIPTO1expres sioninegfr mutantnsclcelicitsintrinsicegfr inhibitor resistance[j].jclininvest,2014,124(7): DOI: /JCI73048 [14]LiuZ,QiS,ZhaoX,etal.Metformininhibits17β estradi ol inducedepithelial to mesenchymaltransitionviaβklotho relatederk1/2signalingandampkαsignalinginendome trialadenocarcinomacels[j].oncotarget,2016,7(16): DOI: /oncotarget.7040 [15]ZhangR,ZhangP,WangH,etal.Inhibitoryefectsofmet forminatlowconcentrationonepithelial mesenchymaltransi tionofcd44(+)cd117(+)ovariancancerstem cels [J].Stem CelResTher,2015,6:262.DOI: / s [16]TaniaM,KhanMA,FuJ.Epithelialtomesenchymaltran sitioninducingtranscriptionfactorsandmetastaticcancer [J].TumourBiol,2014,35(8): DOI: /s y ( 收稿 : ; 修回 : ) ( 编辑邓强庭 )

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