复旦学报 医学版 年 月! 0%!%!%%%! % 0, *!%!! $ % %!$,! % %! % 0%!$%!$,! %!% %!!%$0 %! *%! %% % %%!%! $0 %! 0!%! 1! $,! $ %,! % 0 %!$!%% %%! $% *,%!% % $ %!,!$1!

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1 复旦学报 医学版 9 通过促进巨噬细胞 * 型极化在缺氧 复氧诱导的肝细胞损伤中的保护作用 朱 迪 李婷婷 陈青松 牟 童 汤成泳 重庆医科大学附属第一医院肝胆外科 药学部 重庆 摘要 目的 探讨, 通过促进巨噬细胞 型极化在缺氧 复氧 1! 1 $ % * 诱导的肝细胞损伤中的保护作用及其相关分子机制 方法 实时荧光定量 * ;* * 和 %! % 检测在不同极化类型的人单核巨噬细胞 中, * 和蛋白质水平 通过慢病毒转染构建稳定过表达, 的细胞株 ;* * 检测 * 和 (* 水平 流式细胞术检测 蛋白质水平 通过! 法将 细胞与人肝细胞 细胞共培养并构建 * 模型. 法及流式细胞术检测 细胞存活率及凋亡率, 检测细胞培养液中谷丙转氨酶 %! 和谷草转氨酶!%%%!0! 含量 染色观察细胞形态变化 %! % 检测 细胞中 及其磷酸化水平 结果 型巨噬细胞中, * 及蛋白质水平上调, 促进巨噬细胞 型极化, 诱导的 型巨噬细胞与 细胞共培养 在 * 状态下显著提高肝细胞存活率 并降低细胞凋亡率和 水平 减轻细胞损伤 %! % 提示过表达, 的 细胞中 蛋白质磷酸化水平上调 结论, 能促进巨噬细胞 型极化 并对 * 诱导的肝细胞损伤有保护作用 其机制可能与 信号通路有关 关键词, 巨噬细胞 缺氧 复氧 肝细胞损伤 中图分类号 *** 文献标识码 9!!!!! *9!,$ %$ $ $ ( $ $$,! $ $, $!!% ($!!$ $% %$% %!%%0% 0, %%! $% 1! 1 $ % *! %$! % 0 %!$ %! * %0! %;%%% * ;* * %! %! % %%% 0, *!% %!$ % 0! %! %%! %$ 0% % 0 *( * %%;* * 0!% %%0 % %!! %!! %! %% *!!% %%!% 0!%% 0%!!%%%!0! %!! 重庆市科委基金 1!! $%!%

2 复旦学报 医学版 年 月! 0%!%!%%%! % 0, *!%!! $ % %!$,! % %! % 0%!$%!$,! %!% %!!%$0 %! *%! %% % %%!%! $0 %! 0!%! 1! $,! $ %,! % 0 %!$!%% %%! $% *,%!% % $ %!,!$1! 1 $ % %%!!6! *,1,*,04 肝缺血再灌注损伤 %!!0!,*, 指肝脏因各种原因导致血流中断或不足 在恢复血供之后不仅不能使器官功能恢复 反而加重其功能障碍和结构损伤的现象 在肝外科及肝移植手术中,*, 是造成肝功能损害的重要因素 其损伤机制及脏器保护机制越来越受到重视 巨噬细胞是机体重要的固有免疫细胞 在不同的微环境下可极化为经典活化型 型 和替代活化型 型 巨噬细胞在肝 肾 心 肠 等器官缺血再灌注损伤中起保护作用 且 型极化可能在其中起重要作用, 是, 家族成员 可起到抑制固有免疫的作用 可能对巨噬细胞的极化起到潜在的影响 但其具体作用及机制 尚不明确 $ 等的研究提出对人肝细胞系 进行缺氧 复氧 1! 1 $ % * 处理可建立有效的,*, 体外实验模型 为了研究 基因与巨噬细胞极化的关系 探讨其对 * 诱导的肝细胞损伤的作用 本研究检测 基因在不同极化类型的人单核巨噬细胞系 的表达情况 将表达 基因和空载体的慢病毒转染至 细胞 与人肝细胞系 共培养 建立细胞 * 损伤模型 并进行相关功能和机制检测 探讨, 是否通过诱导巨噬细胞 型极化在 * 状态下对 细胞发挥保护作用 材料和方法 主要试剂和药品 和 细胞由重庆医科大学附属第一医院实验研究中心赠予 *, 培养基 胎牛血清购自美国 公司! 小室 孔径 购自美国!$ 公司. 试剂盒购自日本同仁化学研究所 1- 试剂盒购自江苏凯基生物技术股份公司 谷丙转氨酶 %! 及谷草转氨酶!%%%!0! 微板测试盒购自南京建成生物工程研究所 人重组,, 干扰素 %!0!, 及 购自生工生物工程 上海 股份有限公司 鼠抗, 单克隆抗体购自英国 公司 兔抗 单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司 佛波酯!!%% %% 及兔抗磷酸化!! 抗体购自美国 公司 兔抗 抗体购自重庆惠而利生物技术有限公司!!!%* 试剂盒购自.* 宝生物工程 大连 有限公司 ;* %! 1 试剂购自美国 5 中国公司 * 引物购自生工生物工程 上海 股份有限公司 *, 蛋白质裂解液 试剂盒 染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司 人, 重组慢病毒表达载体和对照载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司 重组质粒构建 和慢病毒包装由本研究小组前期完成 细胞培养 用含 4 胎牛血清的 *, 培养基在 84 ( 中培养 和 细胞株 细胞隔天加入 新鲜培养基并小心吹打混匀 细胞每天更换 新鲜培养基 稳定过表达 9 的细胞株构建 将 细胞接种于 孔板中 用人, 重组慢病毒表达载体 - 和对照载体 - 感染细胞 病毒接触细胞 后更换新鲜培养基 后 培养液

3 朱 迪 等, 通过促进巨噬细胞 型极化在缺氧 复氧诱导的肝细胞损伤中的保护作用 中加入质量浓度 $ 的嘌呤霉素并培养 周 在药物筛选下最后存活的细胞为稳定株 共培养及 8 模型的建立 将孔径为 的! 小室置于 孔板中 上下室分别加入 含有 的新鲜培养基 并在上室中加入 个左右的 细胞 孵育 将其诱导分化为 源性巨噬细胞 后镜下观察细胞已贴壁 弃培养基 用 清洗 次并更换新鲜培养基 将 细胞接种于 孔板中 孵育 使其充分贴壁 镜下观察细胞汇合度 4 4 左右时 将种有 源性巨噬细胞的! 小室放入接种有 细胞的 孔板中进行共培养 上下室分别用 清洗后 更换不含血清的 *, 培养基 将细胞置于三气培养箱 4 ( 4 ( 4 中缺氧培养 移至正常培养箱中复氧 构建 * 模型 巨噬细胞实验分组 将 细胞调整为 的细胞悬液 接种于 孔板中 每孔 并加入 避光孵育 镜下观察细胞已贴壁 表明 已分化为巨噬细胞 弃培养基 用 8 预热的 清洗 次 更换新鲜培养基 分为 组进行处理 组 加入, $ 和脂多糖! $ 孵育 使其极化为 型巨噬细胞 组 加入, $ 和,$ 孵育 使其极化为 型巨噬细胞 组 不作任何处理 为空白对照组 8 实验分组 将! 共培养的细胞分为 组建立 * 模型 空白对照组 不进行 * 处理 与转染 - 阴性对照病毒的 源性巨噬细胞共培养, 实验组 不进行 * 处理 与转染 - 病毒的 源性巨噬细胞共培养 * 处理组 进行 * 处理 与转染 - 阴性对照病毒的 源性巨噬细胞共培养 * - 实验组 进行 * 处理 与转染 - 病毒的 源性巨噬细胞共培养 69( 检测 水平 取经过处理的各组 细胞 根据! 试剂盒说明书提取总 * 并按!!%* 试剂盒说明书逆转录为 根据 ;* 反应混合物说明书 进行 ;* * 检测, * 水平 反应条件 8 下 8 下 8 下 共 个循环 8 下 为内参基因 以 % 值表示, * 水平 引物序列见表!!, * ( 表,69( 反应所用引物序列, 669( ; * * * * * *!!**! 法检测蛋白质水平 取经过处理的各组 细胞 按照 *, 蛋白质裂解液说明书提取细胞总蛋白 用 法测定蛋白质浓度 以每孔 $ 蛋白质进行 然后湿转至 - 膜上 4 脱脂奶粉封闭 加入一抗稀释液 稀释比例 8 孵育过夜 次日以 充分洗涤后加入二抗稀释液 稀释比例 8 孵育 充分洗涤后以 显影剂显色并进行灰度值分析 9 检测细胞存活率 分别将转染 - 和 - 的 细胞接种于 孔板并诱导分化为 源性巨噬细胞 后更换为不含血清的 *, 培养基 在细胞培养箱孵育 后吸取上清 $ 离心 去除残余细胞 收集上清备用 将 细胞接种于 孔板中 在细胞培养箱孵育 待细胞汇合率达 4 左右时进行 * 实验 分组同 * 实验分组 冲洗 次后 - 组加入 转染 - 的 源性巨噬细胞上清 - 组加入 转染 - 的 源性巨噬细胞上清 另设除零组 只加入培养基 不接种细胞 和空白组 加入 不含血清的 *, 培养基 不进行 * 处理 * 组建立 * 模型 方法同上 复氧结束后 每孔加入. 溶液 8 孵育 酶标仪检测 波长处吸光度值 细胞存活率 实验组 除零组 空白组 除零组 4

4 复旦学报 医学版 年 月 流式细胞仪检测细胞表面标记物表达 用 4 的胰蛋白酶消化经建模处理后的各组 细胞 $ 离心 收集细胞 洗涤 次 用 重悬细胞 以每 含 个细胞的比例分别加入 抗人 荧光抗体和 抗人 荧光抗体 混匀后避光冰上放置 每 轻柔震荡 洗涤 次 用 重悬细胞 使用流式细胞仪检测细胞荧光染色情况 流式细胞仪检测细胞凋亡 用 4 的胰蛋白酶消化经建模处理后的各组 细胞 $ 离心 收集细胞 按 1- 细胞凋亡试剂盒说明书处理细胞 使用流式细胞仪检测细胞凋亡率 检测 活力 取经建模处理后的各组 细胞培养液 $ 离心 去除残存细胞 收集上清 按 微板测试盒说明书操作 测定 活力 85 染色 取经建模处理后的各组 细胞 按照 染色试剂盒说明书操作 进行 染色 并于 倍光镜下观察 拍照 统计学分析 实验至少重复 次 采用 统计软件及!! 进行统计学分析 计量资料用 * 表示 多样本均数比较采用单因素方差分析 其中两两比较采用 法 为差异有统计学意义 结 果 * 型巨噬细胞中 9 及蛋白质水平上调 分别提取 和 型 源性巨噬细胞的总 * 和总蛋白 采用 ;* * 检测 和, * 水平 图 型巨噬细胞中 * 水平显著高于 型 和 型 型巨噬细胞中 * 水平显著高于 型 和 型 提示诱导分化成功, * 水平显著高于 型和 型 采用 %! % 检测, 蛋白质水平 图 型巨噬细胞中, 蛋白质水平显著高于 型 和 型 建立稳定过表达 9 的 8(9, 细胞株 将人, 重组慢病毒表达载体 - 和对照载体 - 转染入 细胞 采用 ;* * 和 %! % 检测, 表达水平 结果显示 - 细胞的, * 水平 图 和蛋白质水平 图 明显高于 - 细胞 差异有统计学意义 证明稳定过表达, 的 细胞株构建成功 9 促进巨噬细胞 * 型极化 使用 - 及 - 慢病毒转染 细胞 诱导其分化为 源性巨噬细胞后构建 * 模型 分别提取 - 组和 - 组细胞的总 * 采用 ;* * 检测, 型巨噬细胞标记物 * 和 型巨噬细胞标记物 ( 的 * 水平 并收集各组细胞采用流式细胞仪检测 型巨噬细胞表面标记物 和 型巨噬细胞表面标记物 蛋白质水平 ;* * 结果显示 - 组 和 * 的 * 水平高于 - 组 和 ( 的 * 水平低于 - 组 图 流式细胞术结果显示 - 组 荧光染色阳性率为 4 4 荧光染色阳性率为 4 4- 组 荧光染色阳性率为 4 4 荧光染色阳性率为 44 图 与 - 组相比 - 组 表达显著提高 同时 表达显著降低 以上结果证明, 表达上调可在 * 和蛋白质水平增加 型巨噬细胞标记物的表达水平 说明, 可促进巨噬细胞 型极化 9 诱导的 * 型巨噬细胞在 8 状态下提高肝细胞存活率 - 组和 - 组 源性巨噬细胞与 细胞共培养并构建 * 模型 通过. 检测 细胞存活率 结果显示 空白对照组, 实验组 * 处理组 *, 实验组细胞存活率分别为 和 44 如图 所示 与空白对照组相比 * 处理组和 *, 实验组细胞存活率显著降低 与 * 处理组相比 * - 实验组细胞存活率显著提高 9 诱导的 * 型巨噬细胞在 8 状态下降低肝细胞凋亡率 通过流式细胞术检测 细胞凋亡率 空白对照组, 实验组 * 处理组 *, 实验组细胞凋亡率分别为 和

5 *$ 通过促进巨噬细胞 *! 型极化在缺氧(复氧诱导的肝细胞损伤中的保护作用! 朱! 迪等! (!%! (! = (!! = 图 D!8B 型巨噬细胞中 O\ QN*9L5 及蛋白质水平. 4O\ QN. 8B*, (%, KD!*9L5,.!( K 图 Q!V9 状态下 O\ QN 诱导的 $V@ D 细胞!! 共培养对 \CB 细胞存活的影响, 4\CB!< % KQ!> QN!!$V@ D 4 <.KV9!!!O\ QN 诱导的 8B 型巨噬细胞在 V9 状态下降!!O\ 低 5\$ 5>$ 水 平! 比 较 各 组 细 胞 培 养 液 中 =P 和 =,P 水 平与 空 白 对 照 组 相 比?(B 处 理 组 和?(B.E *$ 实 验 组 细 胞 =P=,P 活 力 显 著 上 升! = $与?(B 处 理 组 相 比?(B.E *$ 实验组 =P 水平显 著 降 低! = 图 (=$同 时?(B.E *$ 实验 组 =,P 水 平 较?(B 处 理 组 也显著降低! = (图 (A! (!!= (!! = 图 B!O\ QN 促进巨噬细胞 8B 型极化 QN.! (, U,. 48B *, (%, KB!O\ ( K VS 染色 观 察 细 胞 形 态 学 变 化! 取经建模处理 后的各组! 细胞采用?9 染色法观察细胞形态学 变化在光镜下观察空白对照组和 *$ 实验组细 %R, %!R!图 % 与 空 白 对 照 组 相 比?(B 处理 组 和?(B. *$ 实 验 组 细 胞 凋 亡 率 显 胞生长状态好形状 较规 则呈 多角 形或 梭形与空 著上升! = $与?(B 处 理 组 相 比?(B. E *$ 实验组细胞凋亡率显著降低! = 态欠规则细胞核固缩碎裂培养 液中 有较多细胞碎 白对照组 相 比?(B 处 理 组 细 胞 皱 缩体 积 缩 小形 片存在与?(B 处理组相比?(B. *$ 实验组细

6 复旦学报!医学版!!$ 年 $ 月 %%! %! (! 胞形态学变化较小受损细胞明显减少!图 蛋白质及其磷 酸 化 水 平!图 $在 人 单 核 巨 噬 细 胞 O\ QN 促 进 $V@ D 细 胞 中 >$5$E 蛋 白 质 磷 酸 化! 通过 L 4 %Q. 检测 P?C 细胞中,P=P P?C 中相对于 EJ1 组过 表 达 *$ 的 E *$ 组显著促进,P=P 蛋白质磷酸化! = 1%.6 5$ A% *$6 5$ 1%?(B6 5$ O%?(B. *$6 5!!=% 图 P!V9 状态下 O\ QN 诱导的 $V@ D 细胞共培养对 \CB 细胞凋亡的影响 4\CB!< %O\ QN!!$V@ D 4 <.KV9 KP!5(( 图 I!V9 状态下 O\ QN 诱导的 $V@ D 细胞共培养对 \CB 细胞上清液中 5\$ 5>$ 水平的影响 5\$,.!5>$ 4\CB!< %O\ QN!!$V@ D 4 <.KV9 KI!$% 1%.6 5$ A% *$6 5$ 1%?(B6 5$ O%?(B. *$6 5!!=% 图 E!\CB 细胞形态学变化 VS% DCCa $ (% 4\CB VS% DCCa $ KE!8 K -%,.K

7 *$ 通过促进巨噬细胞 *! 型极化在缺氧(复氧诱导的肝细胞损伤中的保护作用! 朱! 迪等 (! 存活率$! % *$ 诱 导 的 *! 型 巨 噬 细 胞 在?(B 状态下降低肝细胞凋亡率$! ( *$ 诱 导的 *! 型 巨噬细胞在?(B 状态 下 降 低 =P =,P 水 平$! *$ 促 进 P?C 细 胞 中,P=P 蛋 白 质 磷 酸 化 本研究证明 *$ 能 够 诱 导 巨 噬 细 胞 *! 型 极 化 进而在?(B 状态下 抑 制 巨 噬 细 胞 介 导 的 细 胞 炎 性 反应从而发挥对细胞的保护 作用而 *$ 对巨噬 细胞极 化 的 诱 导 作 用 可 能 与,P=P 磷 酸 化 激 活 有关 *$ 是 近 年 新 发 现 的 细 胞 因 子属 于 家 族主要作为抗 炎 因 子 调 节 机 体 免 疫 既 往 研 究 证 明 *$ 主要通过两 种 不 同 的 机 制 发 挥 抗 炎 作 用 其一是 *$ 与 B(, DMDBB 结 合参 与 多 种 炎 症 相 关 信 号 通 路 的 调 控 从 而 起 到 抗 炎 作 用 $*, 其二则是通过与,*=O* 结合抑制一些炎症相关细 胞因 子 的 合 成 和 释 放 %-(, 此 外有 研 究 证 实 C, 可 增 加 *$ ;BJ= 转 录 稳 定 性 并 增 加 其 蛋, 白质水平 从 而 发 挥 更 强 的 抗 炎 作 用 本 研 究 发 图 N!O\ QN 对人单核巨噬细胞 $V@ D 中 >$5$E 蛋白质及其磷酸化水平的影响 4 4O\ QN ^(.. % 4 KN!S4 >$5$E,.!( >$5$E.$V@ D 现经 药 物 诱 导 极 化 的 *! 型 巨 噬 细 胞 与 * 型 比 较 *$ 表达显 著 上 调这 提 示 *$ 可 能 与 巨 噬 细胞 *! 型 极 化 密 切 相 关 同 时与 * 型 巨 噬 细 胞比较* 型巨噬细胞中 *$ 的蛋白质水平也有 一定上调这可能与 C, 增加其转录稳定性相关 讨!!! 论 J@, 1O 是 * 型 巨 噬 细 胞 的 表 面 标 记 物 同时 =BM 1O! 和 1O* 是 *! 型 巨 噬 细胞的表 面 标 记 物, 本 研 究 发 现 *$ 过 表 达 $, 缺血再灌注! ( (B由短暂 4-8; 5 H 4 % D 性缺血伴随再灌注 造 成是 各 种 病 理 状 况!如 栓 塞 的 巨 噬 细 胞 在?(B 状 态 下1O!1O* 和 =BM 的表达显著高于对照组 1O 和J@, 的表 中风休克外科手术 和 器 官 移 植 等期 间 器 官 损 伤 达显著低于对照组提示 *$ 在?(B 状态下促进 的关键机制再灌注早期产生的活性氧和氮物质引 发的炎性 反 应 是 造 成 细 胞 损 伤 的 重 要 因 素, 巨 巨噬细胞 *! 型极化并抑制了 * 型极化 细胞凋亡率细 胞 存 活 率 和 =P =,P 活 力 以 噬细胞作为机体重 要 的 免 疫 细 胞在 炎 性 反 应 介 导 及细胞形态 变 化,是 评 价 肝 细 胞 损 伤 情 况 的 重 要 的?DBD中起到 了 怎 样 的 作 用又 有 何 机 制 对 其 进 行调 控 仍 待 进 一 步 研 究 *$ 作 为 一 种 抗 炎 因 指标本 研 究 发 现在?(B 状 态 下! 细 胞 的 存 活率显著降低同 时 凋 亡 率 及 细 胞 上 清 液 中 =P 子其 对 脑肾心 D (B 损 伤 的 保 护 作 用 已 有 报 =,P 活力 显 著 提 高提 示! 细 胞 在?(B 状 态 下 受到严重损伤然而与过表达 *$ 的 P?C 源 道 -!, 但 是 *$ 通 过 影 响 巨 噬 细 胞 极 化 对?DBD的保护 作 用 及 其 机 制 在 国 内 外 却 鲜 见 报 道 因此本研究以?(B 处 理 共 培 养 的 P?C 和! 性巨噬细胞共 培 养 能 够 显 著 提 高?(B 状 态 下! 的存活率降低 凋 亡 率 及 细 胞 上 清 液 中 =P=,P 模拟肝缺血 再 灌 注 模 型探 讨 *$ 对 巨 噬 细 胞 极 活力提示 *$ 诱导的 *! 型巨噬细胞可能对! 化的影响及其对?DBD的 作用研 究结 果发 现%! 细胞产生保护作用 *! 型 巨 噬 细 胞 中 *$ ;BJ= 及 蛋 白 质 水 平 上 调$!! *$ 促进 巨 噬 细 胞 *! 型 极 化$! * *$ 诱导 的 *! 型 巨 噬 细 胞 在?(B 状 态 下 提 高 肝 细 胞 本 研 究 还 发 现 在 过 表 达 *$ 的 细 胞 中 5,P=P 水 平 较 对 照 组 显 著 上 调提 示,P=P 的 磷酸化激活可能与 *$ 的 表达 上调 有关 已有研

8 复旦学报 医学版 年 月 究证明 信号通路参与巨噬细胞 型极化 的调控 因此 我们猜测, 对巨噬细胞 型极化的调控可能与 的磷酸化激活有一定联系 为, 调控巨噬细胞 型极化提供了可能的理论依据 综上所述 本研究证明了, 能够诱导巨噬细胞 型极化 并通过构建共培养条件下的细胞 * 损伤模型证明了, 诱导的 型巨噬细胞能够在 * 状态下对肝细胞起保护作用 初步解释了, 调控巨噬细胞 型极化的可能机制 在后续的实验中 我们计划增加动物实验及 通路相关实验 以探究, 诱导巨噬细胞 型极化的确切机制及其在,*, 过程中的保护作用 参 考 文 献,. (-,!$ % % %! % % % %!!$ (.(,(,, ( - * %!$ 0%%!!!!%! % 0%! %!!0! - -* ( *!%!$!%% %! 0!!!0! 1 $ % % 1$ % 0!$!% % 5! $ ( 6,, % 0!$$!%%! 0 %!!%%%!% 0!!!!0!! %! 0% 0 % %,! %% % * %!! % 5!%!%,% %, *!0,!! %$% 0! %!$ (* ( * (,,! ;! %! %!, *, *,,** %!! %% %0% % 0 %!!$! % $ %! %, (,%!5! $ %!!% 1! 1 $ % %% % %, *,! %!! $! %!%$ $ $0!. $$ $ % %!! $ $ -!. ( (*- * %!!% 1 $$!% %!$$! 0 %!! %! % % %!!0%! % % % 0 %!%!$ % %1% % 6,,%, %! % 1! 0! 0 %! %5!!!0! % %!5$!%%! %!!! %!$! 0*(. %% -! ( (*, 0% %! 0 % % *.. (, 0!%!% % %! $ %!0 %! %5 (, * 0!%!% 0,! 0% %5,% 0%! (,, (1%!!$% %%! %% 0 1%! %!$,.. (* % 6 15$!% 0! %%! % 0!$ 0 %! %.,,.(,,.!! %!5!% 0 %!!$ %!% 6 *,%!0!! $ %! 0 %!5%! 0 %!!0!, 6 (! %!%!!$!! $ %$! % 0 %!%!$ $ $ % -! 收稿日期 编辑 王蔚

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