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1 2018 年 4 月第 38 卷第 4 期文章编号 : ( 2018 ) 基础医学与临床 Basic & Clinical Medicine April 2018 Vol.38 No.4 研究论文 sirna 靶向抗酶抑制剂 下调前列腺癌细胞 PC3 中鸟氨酸脱羧酶表达 金涛 1 ꎬ 李倩 2 ꎬ 欧洁 3 ꎬ 王艳林 2 2ꎬ 3 ꎬ 吴红艳 (1 三峡大学人民医院 ( 宜昌市第一人民医院 )ꎻ 2 三峡大学医学院肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室 ꎻ 3 三峡大学医学院免疫学系 ꎬ 湖北宜昌 ) 摘要 : 目的探讨抗酶抑制剂 (AZIN) 对前列腺癌细胞 PC3 鸟氨酸脱羧酶 (ODC) 表达水平及增殖的影响 ꎮ 方法将 sirna AZIN 转染前列腺癌 PC3 细胞 ꎬ 分别用 RT PCR 及 Western blot 检测抗酶 ( AZ) AZIN 及 ODC 在 mrna 和蛋白水平的表达 ꎬMTT 检测细胞增殖 ꎮ 结果 sirna AZIN 转染前列腺癌 PC3 细胞后 ꎬ AZIN RNA 表达水平降低 ( P< 0 01)ꎻPC3 细胞 AZIN 蛋白表达水平降低 (P<0 05)ꎬ 且使 ODC 的表达水平降低 (P<0 05)ꎻPC3 细胞增殖能力明显减弱 (P<0 05)ꎮ 结论 sirna AZIN 可下调前列腺癌细胞 PC3 中 ODC 的表达 ꎮ 关键词 : 抗酶抑制剂 ꎻ 鸟氨酸脱羧酶 ꎻ 抗酶 ꎻsiRNA 中图分类号 :R730 5 文献标志码 :A sirna mediated antizyme inhibitor down regulates the expression of ornithine decarboxylase of prostate cancer cell PC3 JIN Tao 1 ꎬ LI Qian 2 ꎬ OU Jie 3 ꎬ WANG Yan lin 2 2ꎬ 3 ꎬ WU Hong yan (1 People s Hospital of Three Gorges Universityꎬ the First People s Hospital of Yichangꎻ 2 Hubei Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapyꎬ Medical College of Three Gorges Universityꎻ 3 Dept. of Immunologyꎬ Medical College of Three Gorges Universityꎬ Yichang ꎬ China) Abstract: Objective To evaluate whether down regulating antizyme inhibitor( AZIN) can regulate the expression of ornithine decarboxylase( ODC) and the proliferation of prostate cancer cell PC3 or not.methods sirna AZIN transfected prostate cancer cell PC3ꎬ the level of antizyme(az)ꎬ AZIN and ODC were measured by RT PCR and westernblot. MTT was used to measure the proliferation of cells. Results The mrna level of AZIN declined( P< 0 01)ꎻ the protein level of AZIN and ODC declined( P <0 05). Knockdown of AZIN significantly inhibited the proliferation of PC3(P<0 05). Conclusions Transfecting sirna AZIN can decrease the level of AZINꎬ then the decline level of ODC inhibits the proliferation of PC3. Key words: antizyme inhibitorꎻ ornithine decarboxylaseꎻ antizymeꎻ sirna 鸟氨酸脱羧酶 (ornithine decarboxylaseꎬodc) 是 多胺合成的关键酶 [1 2] ꎮ 细胞内 ODC 活性增加与细 胞转化及肿瘤形成密切相关 [3] ꎮ 哺乳动物 ODC 的调控非常复杂 [3] ꎮ 细胞内存 收稿日期 : 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ) 通信作者 (corresponding author):wuhongyan@ ctgu.edu.cn

2 476 基础医学与临床 Basic & Clinical Medicine (4) 在一种天然的 ODC 非竞争性蛋白抑制因子 ꎬ 即抗酶 (antizymeꎬaz)ꎮ AZ 与 ODC 单体的结合可促进 ODC 亚基以非泛素化形式被 26S 蛋白酶体降解 ꎬ 降 [4 低 ODC 活性 5] ꎮ 抗酶抑制剂 (antizyme inhibitorꎬazin) 也参与对 ODC 的调控 [6 7] ꎬ 它可通过封闭 AZ 来稳定 ODC 水平 ꎮ AZIN 能与 AZ 高亲和性结合为杂二聚体 ꎬ 且 AZIN AZ 的亲和力远大于 AZ ODC 的亲和力 ꎮ 所以 AZIN 能竞争性结合 AZ ODC 复合体中的 AZꎬ 释放被 AZ 捕获的 ODC 亚基 ꎬ 恢复 ODC 的酶活性 ꎮ AZIN 在乳腺癌 肝癌及皮肤癌等多种肿瘤中表达上调 [6] ꎬ 本研究在确认前列腺癌细胞高表达 AZIN 的基础上 ꎬ 拟通过 sirna( small interfering RNA) 干扰 AZIN 的表达水平 ꎬ 探讨其对 ODC 表达水平及对前列腺癌细胞增殖的影响 ꎬ 为抗肿瘤治疗提供新策略 ꎮ 1 材料与方法 1 1 细胞 组织及试剂 PC3 细胞 ( 中国典型培养物保藏中心 )ꎻ 正常前列腺组织和前列腺癌组织分别来自前列腺癌根治术患者及意外死亡者 ꎻ AZIN ( Proteintech 公司 )ꎻ sirna AZIN 序列 : oligo 877: 5 GGAACCGGAUUU GCUUGUUTT 3 ( 正义 )ꎬ 5 AACAAGCAAAUCCGG UUCCTT 3 ( 反义 )ꎻ oligo 1006: 5 GGAGUGAAU AUCCUGACAUTT 3 ( 正义 )ꎬ 5 AUGUCAGGAUA UUCACUCCTT 3 ( 反义 ) ( 上海吉玛制药技术有限公司 )ꎻTrizol 和 BCA 蛋白浓度检测试剂盒 ( Thermo Fisher Scientific 公司 )ꎮ 1 2 方法 细胞培养 : 用含 10% 小牛血清的 RPMI1640 培养基在 37 和 5% CO 2 条件下培养人前列腺癌 PC3 细胞系 ꎮ Western blot 检测 AZIN 的表达 : 分别提取各组织及前列腺癌 PC3 细胞的总蛋白 ꎬ 用 BCA 蛋白浓度检测试剂盒测蛋白浓度 ꎬ 取等量蛋白进行 10% SDS PAGE 电泳 ꎬ 随后将蛋白转印到 PVDF 上 ꎬ 用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 溶液室温封闭 1 hꎬ4 一抗孵育过夜 ꎬTBST 洗膜 3 次 ꎬ 用相应的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育 1 hꎬtbst 洗膜 3 次后 ECL 显色发光检测相应条带 ꎮ β actin 作为内参照 ꎮ 细胞转染及分组 : 当人前列腺癌 PC3 细胞系增殖至 80% 时 ꎬ 用 lipofectamine2000 试剂严格按照步骤进行转染 ꎬ 实验分组 : 未转染的 PC3 细胞 AZIN sirna 877 转染组 AZIN sirna 1006 转染组和 Scrambled sirna 转染组 ꎮ 转染 48 h 后进行 RNA 干扰效率的检测 ꎮ RT PCR 检测细胞 AZ AZIN 和 ODC mrna 表达水平 : 用 Trizol 试剂裂解细胞 ꎬ 提取总 RNAꎬ 通过 cdna 合成试剂盒反转录合成 cdnaꎮ 分别扩增 AZ AZIN ODC 及 β actinꎮ AZ 的上游引物为 5 C CTCCACTGCTGTAGTAACCCG 3 ꎬ 下游引物为 5 C CAAAAAGCTGAAGGTTCGGA 3 ꎻAZIN 的上游引物为 5 ATGTGTGTTTGACATGGCTGGAG 3 ꎬ 下游引物为 5 GAGGCTCATCTTCCTTGTATTTCTTG 3 ꎻ ODC 的上游引物为 5 AAAGCAAAGTTGGTTTTGCGG ꎬ 下游引物为 5 CCTTGGCATCTGAGCGAGTA 3 ꎮ β actin 的上游引物为 5 GGCATCACACTTTCTACA ACG 3 ꎬ 下游引物为 5 GGCAGGAACATTAAAGG TTTC 3 ꎮ PCR 反应条件为在 94 预变性 5 min 后开始循环 ꎬ 然后 94 变性 30 sꎬ55 退火 30 sꎬ72 延伸 60 sꎬ30 个循环后 ꎬ 再于 72 延伸 5 min 结束扩增 ꎮ 所得的 PCR 产物经 1 5% 琼脂糖凝胶电泳检测分析 ꎮ Western blot 检测细胞 AZ AZIN 和 ODC 蛋白表达水平 : 细胞转染 48 h 后分别提取各组细胞的总蛋白 ꎬ 用 BCA 蛋白浓度检测试剂盒测蛋白浓度 ꎬ 去等量蛋白进行 10% SDS PAGE 电泳 ꎬ 随后将蛋白转印到硝酸纤维膜上 ꎬ 用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 溶液室温封闭 1 hꎬ4 一抗孵育过夜 ꎬTBST 洗膜 3 次 ꎬ 用相应的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育 1 hꎬtbst 洗膜 3 次后 ECL 显色发光检测相应条带 ꎮ β actin 作为内参照 ꎮ MTT 检测细胞增殖 : 将处于对数增殖期的 PC3 细胞计数后接种于 96 孔板 ꎬ 转染 sirnaꎬ 每组设 4 个复孔 ꎬ 转染 4 h 后换成完全培养基 ꎬ37 继续培养 和 72 hꎬ 弃上清液 ꎬ 加 MTT 溶液 ꎬ 使其终浓度为 200 mg / Lꎬ 37 孵育 4 h 后加 DMSO 150 μlꎬ 振荡混匀后测量 570 nm 处的吸光度值 ꎬ 分别得到 和 72 h 数据 ꎮ 1 3 统计学分析实验数据用 SPSS( version 10 0) 软件进行统计

3 金涛 sirna 靶向抗酶抑制剂下调前列腺癌细胞 PC3 中鸟氨酸脱羧酶表达 477 学分析 ꎮ 采用均数比较的 t 检验处理实验结果 ꎬ 比较各组资料差异的显著性 ꎮ 2 结果 2 1 前列腺癌组织及前列腺癌细胞 AZIN 表达量增加与正常前列腺组织相比 ꎬ 前列腺癌组织及前列 腺癌 PC3 细胞 AZIN 的蛋白表达量明显增加 ( P < 0 05)( 图 1)ꎮ 2 2 sirna AZIN 在 mrna 水平下调 AZIN 表达相对于空白组 ( no sirna ) 和阴性对照组 (sirna2) 均可降低 AZIN RNA 表达水平 ( P<0 01) ( 图 2)ꎮ A:AZIN protein expression was detected by Western blotꎬ 1 normal prostate tissueꎬ 2 prostate cancer tissueꎬ 3 prostate PC3 cellsꎻ B: relative expression of AZINꎻ P<0 05 compared with normal prostate tissue 图 1 前列腺癌组织及前列腺癌 PC3 细胞 AZIN 表达量增加 Fig 1 Expression of AZIN in prostate cancer tissue and prostate PC3 cells increased(x±sꎬ n = 3) P<0 01 compared with no sirna and scramble sirna 图 2 sirna AZIN 在 mrna 水平下调 AZIN 表达 Fig 2 sirna AZIN down regulated the mrna level of AZIN(x±sꎬ n = 3)

4 478 基础医学与临床 Basic & Clinical Medicine (4) P<0 05 compared with no sirna and scramble sirna 图 3 sirna AZIN 在蛋白水平下调 AZIN 和 ODC 的表达 Fig 3 sirna AZIN down regulated the protein level of AZIN and ODC(x±sꎬ n = 3) 2 3 sirna AZIN 在蛋白水平下调 AZIN 和 ODC 的表达相对于空白组 ( no sirna ) 和阴性对照组 (sirna2) 均可降低 AZIN 蛋白表达水平 (P<0 05)ꎬ 且使 ODC 的表达水平降低 (P<0 05)( 图 3)ꎮ 2 4 AZIN 表达下调影响前列腺癌 PC3 细胞的增殖能力相对于空白组 ( no sirna ) 和阴性对照组 (sirna2) 转染组细胞增殖能力减弱 ꎬ 且随着时间的延长 ꎬsiRNA 组增殖能力明显减弱 ( P < 0 05) ( 图 4)ꎮ 3 讨论迄今 ꎬAZIN 在多胺合成中的作用尚不完全清楚 ꎮ 和 ODC 一样 ꎬ 高水平的 AZIN 促进多胺的产生及细胞增殖 ꎮ 本研究用 RNA 干扰 AZIN 的表达 ꎬ 检测 ODC 表达水平的变化以及细胞抑制情况 ꎮ 结果显示转染 sirna AZIN 的前列腺癌 PC3 细胞 AZIN P < 0 05ꎬ P < 0 01 compared with no sirna and scramble sirna 图 4 AZIN 表达下调影响前列腺癌 PC3 细胞的增殖 Fig 4 Expression of AZIN down regulates the prolifer ation of PC3(x±sꎬ n = 4) mrna 和蛋白表达量显著下调 ꎬ 导致 ODC 的表达水平明显下调 ꎬ 且转染组细胞的增殖明显受到抑制 ꎮ ODC 表达上调和多胺在细胞的积聚与肿瘤细胞转化密切相关 [8] ꎮ ODC 的表达受多种因素的调节 ꎬ 其中 ODC / 多胺 / AZ 负反馈调节通路发挥重要作用 ꎮ 细胞内的 AZ 活性受到 AZIN 的调控 ꎬ 因为

5 金涛 sirna 靶向抗酶抑制剂下调前列腺癌细胞 PC3 中鸟氨酸脱羧酶表达 479 AZIN 与 AZ 的亲和力比 AZIN 和 ODC 的亲和力高 ꎬ 可使 ODC 从 ODC 和 AZ 的复合物中解离出来 ꎮ 最终导致 ODC 的产生量增加 ꎬ 此外 ꎬAZIN 还可稳定新合成的 ODCꎮ 本实验结果发现 ꎬsiRNA 下调 AZIN 的表达后 ꎬ AZ 在 mrna 和蛋白水平的表达都无明显变化 ꎬ 可能是 AZIN 降低了 AZ 的活性 ꎬ 但对 AZ 的表达量无 明显影响 ꎬ 但 AZIN 的表达下调使 ODC 的表达量降低 ꎬ 最终抑制前列腺癌 PC3 细胞的增殖 ꎮ 总之 ꎬ 本结果表明 ꎬ 用 sirna AZIN 可有效减少前列腺癌细胞中 AZIN 的表达水平 ꎬ 最终导致 ODC 表达量的降低及细胞抑制 ꎮ 提示调节 AZIN 可作为肿瘤 ꎬ 尤其是前列腺癌治疗的潜在靶标 ꎮ 参考文献 : [1] 吴红艳 ꎬ 黄亚 ꎬ 王艳林. 多胺的合成代谢与肿瘤治疗 [ J]. 基础医学与临床 ꎬ2016ꎬ 36: [2] Ramani Dꎬ De Bandt JPꎬ Cynober L. Aliphatic polyamines in physiology and diseases [ J ]. Clin Nutrꎬ 2014ꎬ 33: [3] Nowotarski SLꎬ Woster PMꎬ Casero RA. Polyamines and cancer: implications for chemotherapy and chemoprevention [J]. Expert Rev Mol Medꎬ 2013ꎬ 15:e3. doi: / erm [4] Bercovich Zꎬ Snapir Zꎬ Keren Paz Aꎬ et al. Antizyme affects cell proliferation and viability solely through regulating cellular polyamines [ J]. J Biol Chemꎬ 2011ꎬ 286: [5] Olsen RRꎬ Zetter BR. Evidence of a role for antizyme and antizyme inhibitor as regulators of human cancer [ J]. Mol Cancer Resꎬ 2011ꎬ 9: [6] Qiu Sꎬ Liu Jꎬ Xing F. Antizyme inhibitor 1: a potential carcinogenic molecule [ J].Cancer Sciꎬ 2016ꎬ 21. doi: / cas [7] Silva TMꎬ Cirenajwis Hꎬ Wallace HMꎬ et al. A role for antizyme inhibitor in cell proliferation [ J]. Amino Acidsꎬ 2015ꎬ 47: [8] Shukla Dave Aꎬ Castillo Martin Mꎬ Chen Mꎬ et al. Ornithine decarboxylase is sufficient for prostate tumori gen esis via androgen receptor signaling[j]. Am J Patholꎬ 2016ꎬ 186: 新闻点击 心力衰竭蛋白质与早期脑部损伤有关据美国 WebMD 医学新闻网 ( ) 报道 ꎬ 一篇新研究认为 ꎬ 特定心脏病蛋白质的高血中浓度与脑部损伤相关 ꎮ N 端前 B 型利钠胜肽 (NT probnp) 是应对心脏壁压力而释放到血液中的一种蛋白质 ꎮ 当心力衰竭恶化时 ꎬ 血中的 NT probnp 值上升 ꎬ 当心力衰竭状况缓解时 ꎬ 此数值则降低 ꎮ 之前的研究发现 ꎬ 心脏病和脑部疾病之间有关联 ꎬ 但是不清楚 NT probnp 的作用 ꎮ 荷兰的研究者探讨近 名中年与年长的无痴呆症心脏病患者 ꎬ 发现血中 NT probnp 值与 MRI 测得的脑部损伤之间有明确关联 ꎬ 但是 ꎬ 这篇研究并未证实这个蛋白质的浓度较高时会引起脑部损伤 ꎮ 这篇研究在线发表于 2016 年 12 月 7 日的 «放射医学»(Radiology)ꎮ

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