86 中华普通外科学文献 ( 电子版 )2018 年 4 月第 12 卷第 2 期 Chin Arch Gen Surg (Electronic Edition), April 2018, Vol. 12, No.2 或抑癌基因的生物学功能, 使其成为肿瘤基因治疗的新靶点 最新研究表明,microR

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1 85 论著 microrna-21 通过上皮间质转化促进胆管癌细胞侵袭转移的研究 曹良启李越何南魏章均张大伟杨学伟 摘要 目的探讨 microrna-21(mir-21) 对胆管癌 RBE 细胞侵袭转移能力的影响及其内在机制 方法 mir-21 及其抑制基因片段 (mir-21i) 通过慢病毒载体感染胆管癌 RBE 细胞, RT-PCR 用于检测 RBE 细胞中 mir-21 表达 ;Transwell 体外侵袭实验和细胞划痕试验用于检测 RBE 细胞侵袭及转移能力 ;Western blotting 用于检测 PTEN 蛋白和上皮间质转化 (EMT) 特征性蛋白 E-cadherin N-cadherin Vimentin 表达情况 结果 mir-21 过表达促进 RBE 细胞侵袭和转移, mir-21 低表达抑制 RBE 细胞的侵袭和转移 mir-21 过表达能够降低 PTEN 蛋白和 E-cadherin 蛋白, 增强 N-cadherin 和 Vimentin 蛋白的表达 ; 转染 mir-21i 抑制基因组 (mir-21i) 组则有相反的效果, 而转染空白基因组 ( 对照组 ) 相应蛋白表达无明显变化 结论 mir-21 起到癌基因的作用, 可增强胆管癌细胞侵袭和转移能力, 其机制是通过调节抑癌基因 PTEN 及改变 EMT 相关蛋白的变化 这些发现为胆管癌侵袭转移的分子机制提供新的科学依据 关键词 胆管肿瘤 ; 微 RNAs; 基因, 抑制 ; 上皮 - 间质转化 ;PTEN MicroRNA-21 promoting the invasion and metastasis of cholangiocarcinoma through epithelialmesenchymal transition Cao Liangqi, Li Yue, He Nan, Wei Zhangjun, Zhang Dawei, Yang Xuewei. Department of Hepatobiliary Surgery, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou , China Corresponding author: Cao Liangqi, clq0829@163.com Abstract Objective To investigate the effect of microrna-21 (mir-21) on the invasion and metastasis of cholangiocarcinoma RBE cells, as well as its underlying mechanisms. Methods Cholangiocarcinoma RBE cells were transfected mir-21 or mir-21 inhibitor (mir-21i) mediated in lentivirus. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to examine the expression of mir-21. Transwell chambers and wound-healing assay were applied to measure the invasive and metastatic effects of RBE cells. Western blotting analysis was used to assess the expression of PTEN protein and epithelial-mesenchymal transition (EMT) related proteins, including E-cadherin, N-cadherin, and Vimentin. Results The over-expression of mir-21 promoted invasion and metastasis of cholangiocarcinoma RBE cells, mir-21 inhibitor suppressed these effects. Furthermore, it has been found that the over-expression of mir-21 up-regulated PTEN and E-cadherin proteins, and down-regulated N-cadherin and Vimentin proteins. However, these data were not observed in the control group. Conclusions mir-21 acts as an oncogene, promotes invasion and metastasis of cholangiocarcinoma cells through PTEN and EMT. These findings provide new scientific basis. Key words Bile duct neoplasms; MicroRNAs; Genes, suppressor; Epithelial-mesenchymal transition; PTEN 胆管癌是指起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤, DOI: /cma.j.issn 基金项目 : 广东省自然科学基金项目 (2015A ); 广东省科技计划项目 (2014A ) 作者单位 : 广州医科大学附属第二医院肝胆外科通信作者 : 曹良启, clq0829@163.com 约占消化道肿瘤的 3% 近年来随着诊断水平的不断提高, 全球发病率呈上升趋势, 在我国尤为突出 [1] 胆管癌具有起病隐匿 发展迅速 预后差等特点 microrna 是一类内源性非编码 RNA, 长 19~25 个核苷酸, 可通过调控其靶基因参与细胞的信号传导, 影响肿瘤的发生和发展, 发挥着类似于癌基因

2 86 中华普通外科学文献 ( 电子版 )2018 年 4 月第 12 卷第 2 期 Chin Arch Gen Surg (Electronic Edition), April 2018, Vol. 12, No.2 或抑癌基因的生物学功能, 使其成为肿瘤基因治疗的新靶点 最新研究表明,microRNA-21(miR-21) 在胆管癌细胞中呈高表达状态, 在胆管癌组织中敏感度和特异度高达 95% 以上, 可以影响胆管癌细胞的生物学活性, 提示 mir-21 有可能成为胆管癌早期诊断 演进和术后疗效跟踪 随访评价一个新 [2] 的标志物, 但机制不清 本研究旨在探讨 mir-21 对胆管癌细胞侵袭转移能力的影响及其内在机制 材料与方法一 药品和试剂胆管癌 RBE 细胞购自上海细胞生物所, 慢病毒载体购自广州汉恒生物有限公司 DMEM 完全培养液和新生牛血清购于美国 Gibco 公司 100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素购于武汉博士德生物公司, 噻唑蓝 MTT 购于美国 Amresco 公司 RNA 提取试剂 Trizol 购于美国 Invitrogen 公司,RT- PCR 反应试剂盒购予美国 Promega 公司,PCR 反应试剂盒购于日本 TaKaRa 公司 兔抗人钙黏附蛋白 E(calcium adherent protein E, E-cadherin) 单克隆抗体 兔抗人波形蛋白 Vimentin 单克隆抗体 兔抗人钙黏附蛋白 N(calcium adherent protein N, N-cadherin) 单克隆抗体 兔抗人磷酸酯酶 PTEN(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten) 单克隆抗体 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 ( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 兔源单克隆抗体 辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP) 标记鼠抗兔二抗, 均为上海玉博生物科技有限公司产品 二 细胞培养 按照本课题组常规的细胞培养方法进行, 胆管癌 RBE 细胞贴壁生长, 培养于含 10% 新生牛血清 100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素的 DMEM 培养液中, 置于含 5% CO 2 的 37 培养箱中 常规消化传代, 取对数生长期的细胞进行实验 三 mir-21 转染构建稳定表达的胆管癌细胞株整个实验分 5 组 :( 1)miR-21 过表达组 (mir- 21 组 ):mir-21 基因片段通过慢病毒感染胆管癌 RBE 细胞使其过表达 ;(2)miR-21 过表达空白对照组 ( mir-21 NC 组 ), 与 mir-21 组同样条件, 转染空白慢病毒载体的 RBE 细胞作为阴性对照 ;(3)RBE 细胞组, 正常培养无转染任基因 ;(4)miR-21 抑制组 ( mir-21i 组 ): 用 mir-21 抑制基因片段通过慢病毒载体感染胆管癌 RBE 细胞 ;(5)miR-21i 空白 对照组 (mir-21i NC 组 ): 与 mir-21i 组同样条件, 转染空白慢病毒载体的 RBE 细胞作为阴性对照 转染前先测定 RBE 细胞最佳感染复数 (multiplicity of infection, MOI) 将对数生长的 RBE 细胞, 取 个 / 孔接种于 24 孔板上, 后放置 5% CO 2 培养箱中过夜 达到 30%~40% 细胞融合度时细胞进行病毒转染 取 24 孔板内相邻 4 孔细胞, 按 MOI 值 =30 加入慢病毒至完全培养基内, 并加入终浓度 5 ng/ml Polybrene 提高转染效率, 摇匀后放入 CO 2 培养箱 48 h 后于荧光显微镜观察, 当转染率达 90% 时, 消化转移接种于 6 孔板继续培养 对 RBE 细胞进行嘌呤霉素耐药性实验 选取 10 mg/l 嘌呤霉素, 每 48 小时更换培养液, 并持续在培养液中按 10 mg/l 浓度加入嘌呤霉素,2 周后置于荧光显微镜下观察, 见未成功转染的细胞即不含绿色萤光蛋白 (green fluorescent protein,gfp) 的细胞基本死亡, 剩下均为成功转染病毒的 RBE 细胞为转染成功 将成功筛选过的细胞继续培养, 培养至细胞融合度 80%~90% 时消化接种于细胞培养瓶内, 传代保存 四 RT-PCR 检测慢病毒转染细胞 mir-21 含量取不同处理后的细胞, 用 Trizol 试剂一步法提取细胞总 RNA, 按照试剂盒说明书完成 RT- PCR 过程 mir-21 及内参引物均购于广州恒研生物有限公司, 其 mir-21 基因上游引物序列为 :5 -TCGCTAGCTTATCAGACTGA-3, 下游引物序列为 :5 -GTGCAGGGTCCGAGGT-3 ; 内参 U6 基因上游引物序列为 : 5 -CGCTTCGGCAGCACATATAC-3, 下游引物序列为 5 -TTCACGAATTTGC GTGTCAT-3 PCR 反应条件 :95 预变性 20 s,95 变性 3 s,60 退火 30 s,40 个循环 采用 2 -ΔΔCt 法计算目的基因的表达, 实验结果为 3 次独立重复试验平均值, 一般认为 2 -ΔΔCt >2.0 或 0.5 表达有差异 五 细胞划痕试验携带工作浓度为 20 nmol/l mir-21 和 30 nmol/l mir-21i 及其阴性对照基因的慢病毒稳定转染 RBE 细胞分别接种于 24 孔板上, 每组设置 3 个复孔, 置于培养箱内培养, 待细胞融合度达 80%~90% 时, 使用枪头对准 24 孔板下端中央部位向上轻推形成划痕 磷酸盐缓冲液 (phosphate buffer solution, PBS) 冲洗 2~3 遍, 充分洗去所刮擦下来的细胞, 后加入无血清培养基培养, 以 0 h 作为对照,

3 87 之后放入 5% CO 2 培养箱中培养,24 h 48 h 分别取 出, 用荧光显微镜拍照, 根据划痕后的图片, 计算各 组细胞的迁移率 六 Transwell 体外侵袭实验 取对数生长期 RBE 细胞, 用无血清 DMEM 培 养基洗 3 次, 接种 个细胞于已行 Matrigel 包被的 Transwell 小室中 每组 3 个复孔, 培养 24 h 后自 24 孔板中取出 Transwell 小室,PBS 液轻轻冲 洗 3 次, 用棉签小心擦净小室内部的细胞, 然后将 小室置于 4% 甲醛固定 20 min, 取出后放入 0.1% 结晶紫染色 15 min ; 沿小室底部边缘剪下滤膜, 倒 置显微镜下观察穿过 Matrigel 及微孔至滤膜反 面的细胞 实验重复 3 次, 置于高倍镜 (200 ) 下观察计数转移至下室的细胞数量, 并计算侵袭 转移率 七 Western blotting 法检测上皮间质转化 (epithelial-mesenchymal transition, EMT) 相关蛋白 及 PTEN 基因蛋白表达 实验分组同上, 各组处理 24 h 后的细胞, 预冷 的 PBS 液洗 3 遍, 用 RIPA 裂解缓冲液和蛋白酶抑 制剂提取总蛋白, 用 BCA 法测定蛋白浓度, 取 50 μg 总蛋白上样, 行十二烷基磺酸钠 - 聚丙烯酞胺凝胶 电泳 ( SDS-PAGE) 并原位电转印至 PVDF 膜 ; 膜经 封闭液 (0.1% PBST+5% 脱脂奶粉 ) 处理 2 h 后, 一 抗 E-cadherin N-cadherin Vimentin PTEN GAPDH 抗体按比例稀释为 ,4 孵育过夜 膜经漂洗后再与 二抗 ( ) 常温孵育 2 h, 发光 显影 观察结果 八 统计学处理 采用 SPSS 19.0 软件进行数据分析,miR-21 表达含量 PTEN 蛋白和 EMT 相关蛋白表达实验 数据以 表示, 进行完全随机设计的单因素方 差分析, 多个样本均数间的两两比较采用 Student- Newman-Keuls q 检验 P<0.05 表示差异有统计学 意义 结 果 一 RT-PCR 检测转染慢病毒后各组细胞 mir-21 表达含量 以慢病毒为载体转染 RBE 细胞 48 h 后, 效果 显著 mir-21 组 RBE 细胞 mir-21 呈过表达, 而 mir-21i 组细胞后呈低表达, 差异有统计学意义 (P<0.05); 而 mir-21i NC 组 mir-21 表达无明显 变化 ( 图 1) 图 1 mir-21 转染后在各组的表达情况 mir-21 为 mir- 21 过表达组 ;mir-21 NC 为 mir-21 过表达空白对照组 ; RBE 为无转染的 RBE 细胞组 ;mir-21i 为转染 mir-21 抑制片段基因组 ;mir-21i NC 为 mir-21i 空白对照组 ; 与 RBE 细胞组比较, * P<0.05 二 mir-21 表达对 RBE 细胞迁移 侵袭能力的影响细胞培养 48 h 后细胞侵袭和迁移能力大大改变 过表达 mir-21 的 RBE 细胞侵袭能力和迁移能力增强 (P<0.05), 而低表达 mir-21 的 RBE 细胞能力大大减弱 (P<0.05), 与常规 RBE 细胞的侵袭 ( 图 2A) 和迁移 ( 图 2B) 能力差异有统计学意义 三 mir-21 对 EMT 相关蛋白表达的影响细胞培养 24 h 后观察 :mir-21 过表达组 RBE 细胞,E-cadherin 表达明显低于阴性对照及空白对照组,N-cadherin Vimentin 表达明显高于阴性对照及空白对照组 mir-21 抑制组其结果明显相反, E-cadherin 蛋白表达明显高于阴性对照及空白对照组,N-cadherin Vimentin 蛋白表达明显低于阴性对照及空白对照组 ( 图 3) 四 mir-21 对 PTEN 蛋白表达的影响细胞培养 24 h 后观察 : 过表达 mir-21 下调抑癌基因 PTEN 的表达, 阴性对照无改变,miR-21 抑制基因组则上调 PTEN 的表达 阴性对照和正常 RBE 细胞组无变化 在胆管癌细胞内证实 mir-21 调节抑癌基因 PTEN 的表达 ( 图 4) 讨论 mir-21 被认为是涉及人类恶性肿瘤最突出的 mirna 之一, 已被列为潜在的致癌基因, 在结直 [4-5] 肠癌 肺癌 前列腺癌和成胶质细胞瘤中被上调 研究表明,miR-21 通过下调抑癌基因 PTEN, 从而 [6] 促进肝癌的增生 迁移和侵袭 而 mir-21 在胆管癌细胞中的研究鲜有报道, 本研究成功地通过慢病毒将 mir-21 转染至胆管癌 RBE 细胞, 转染后的 RBE 细胞与对照组相比,miR-21 过表达, 显著

4 88 中华普通外科学文献 电子版 2018 年 4 月第 12 卷第 2 期 Chin Arch Gen Surg Electronic Edition, April 2018, Vol. 12, No.2 A 的侵袭和迁移 进一步拓宽了 mir-21 的表达在胆 管癌细胞生物学中的意义 我们进一步深入研究发现 在与侵袭和迁移 有关的 EMT 蛋白表达影响方面 mir-21 过表达 组 能 够 导 致 E-cadherin 表 达 下 调 N-cadherin 图2 各组细胞的侵袭和迁移情况 B A 为细胞的侵袭能力 100 B 为相对迁移细胞数 mir-21 为 mir-21 过 表达组 mir-21 NC 为 mir-21 过表达空白对照组 RBE 为 无 转 染 的 RBE 细 胞 组 mir-21i 为 转 染 mir-21 抑 制 片 段 基 因 组 mir-21i NC 为 mir-21i 空 白 对 照 组 与 RBE 细胞组比较 *P<0.05 Vimentin 表 达 上 调 反 之 转 染 mir-21 抑 制 基因 E-cadherin 表 达 上 调 N-cadherin Vimentin 表 达 下调 细胞发生 EMT 时 会出现 E-cadherin 表达 的减少 细胞角蛋白细胞骨架转化为 Vimentin 为 主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等 通过 EMT 上皮失去了细胞极性 失去与基底膜的 连接等上皮表型 迁移与侵袭能力 抗凋亡能力和 降解细胞外基质的能力均得到明显提升 7-9 研究 发现在肝癌细胞中 mir-21 抑制 PTEN 和 hsulf-1 基因表达 导致 AKT/ERK 信号通路活化和肝癌细 胞 EMT 从 而 促 进 肿 瘤 细 胞 生 长 侵 袭 和 转移活 动 10 Wang 等 11 研究发现 mir-21 的表达水平在肝 内胆管细胞癌患者血清中显著上调 进一步通过体 内外实验又发现抑制 mir-21 的表达可以抑制癌细 胞的增殖 诱导癌细胞的周期阻滞和凋亡 PTPN14 图3 mir-21 对 EMT 相关蛋白 E-cadherin N-cadherin 及 Vimentin 表达的影响 mir-21 为 mir-21 过表达组 和 PTEN 被鉴定为 mir-21 的靶基因 mir-21 的 表达水平与肝内胆管细胞癌患者的临床病理特征 mir-21 NC 为 mir-21 过表达空白对照组 RBE 为无转 密切相关 表达水平越高 生存率越低 预后越差 因组 mir-21i NC 为 mir-21i 空白对照组 实在胆管细胞癌中 PTEN 基因也是 mir-21 的靶 染 的 RBE 细 胞 组 mir-21i 为 转 染 mir-21 抑 制 片 段 基 我们也证实了 mir-21 抑制 PTEN 蛋白的表达 证 点 12 有关 PTEN 上调或下调是通过哪一条信号通 路来影响胆管细胞癌的 EMT 生物学活动 则是我 们今后研究的方向 总之 本研究证实 mir-21 在胆管癌中充当致 癌基因的角色 过表达 mir-21 促进胆管癌细胞 图4 mir-21 对 PTEN 蛋白表达的影响 mir-21 为 mir- 21 过表达组 mir-21 NC 为 mir-21 过表达空白对照组 RBE 为 无 转 染 的 RBE 细 胞 组 mir-21i 为 转 染 mir-21 抑制片段基因组 mir-21i NC 为 mir-21i 空白对照组 增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力 而转染 mir-21 抑制基因则减弱肿瘤细胞迁移及侵袭能力 所以 mir-21 在胆管癌也不例外 促进胆管上皮细胞癌 迁移和侵袭 低表达 mir-21 则抑制其迁移和侵袭 mir-21 可以通过下调抑癌基因 PTEN 诱导 EMT 化来增强胆管癌细胞的侵袭和迁移能力 这项研 究揭示了 mir-21 作为胆管癌治疗领域一个新靶 点 为胆管癌治疗的提供新的理论依据 参 考 文 献 1 Squadroni M, Tondulli L, Gatta G, et al. Cholangiocarcinoma[J].

5 89 Crit Rev Oncol Hematol, 2017, 116: [2] Correa-Gallego C, Maddalo D, Doussot A, et al. Circulating plasma levels of microrna-21 and microrna-221 are potential diagnostic markers for primary intrahepatic cholangiocarcinoma[j]. PLoS One, 2016, 11(9): e 曹良启, 王闯, 薛平, 等. 15- 脱氧 - 前列腺素 J2 激活过氧化物酶体增殖物激活受体信号抑制肝癌细胞侵袭转移的实验研究 [J/CD]. 中华普通外科学文献 ( 电子版 ), 2015, 9(5): [4] Xiong B, Cheng Y, Ma L, et al. MiR-21 regulates biological behavior through the PTEN/PI-3 K/Akt signaling pathway in human colorectal cancer cells[j]. Int J Oncol, 2013, 42(1): [5] Zhou Y, Sheng B, Xia Q, et al. Association of long non-coding RNA H19 and microrna-21 expression with the biological features and prognosis of non-small cell lung cancer[j]. Cancer Gene Ther, 2017, 24(8): [6] He C, Dong X, Zhai B, et al. MiR-21 mediates sorafenib resistance of hepatocellular carcinoma cells by inhibiting autophagy via the PTEN/Akt pathway[j]. Oncotarget, 2015, 6(30): [7] Xue H, Tian GY. MiR-429 regulates the metastasis and EMT of HCC cells through targeting RAB23[J]. Arch Biochem Biophys, 2018, 637: [8] Huang Y, Chen Y, Lin X, et al. Clinical significance of SLP-2 in hepatocellular carcinoma tissues and its regulation in cancer cell proliferation, migration, and EMT[J]. Onco Targets Ther, 2017, 10: [9] De Craene B, Berx G. Regulatory networks defining EMT during cancer initiation and progression[j]. Nat Rev Cancer, 2013, 13(2): [10]Bao L, Yan Y, Xu C, et al. MicroRNA-21 suppresses PTEN and hsulf-1 expression and promotes hepatocellular carcinoma progression through AKT/ERK pathways[j]. Cancer Lett, 2013, 337(2): [11]Wang LJ, He CC, Sui X, et al. MiR-21 promotes intrahepatic cholangiocarcinoma proliferation and growth in vitro and in vivo by targeting PTPN14 and PTEN[J]. Oncotarget, 2015, 6(8): [12]He Q, Cai L, Shuai L, et al. Ars2 is overexpressed in human cholangiocarcinomas and its depletion increases PTEN and PDCD4 by decreasing microrna-21[j]. Mol Carcinog, 2013, 52(4): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 姚亚楠 ) 曹良启, 李越, 何南, 等. microrna-21 通过上皮间质转化促进胆管癌细胞侵袭转移的研究 [J/CD]. 中华普通外科学文献 ( 电 子版 ), 2018, 12(2):

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