员缘源 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园员猿年源月, 圆园 ( 圆 ) 园郾园缘 ), 葬灶凿栽耘栽圆责则燥贼藻蚤灶藻曾责则藻泽泽蚤燥灶蚤灶责耘郧云孕鄄悦葬早粤鄄贼则葬灶泽枣藻糟贼藻凿郧耘杂鄄员糟藻造造泽憎葬泽葬造泽燥蚤灶糟则藻葬泽藻凿 ( 员园援愿圆依猿援猿怨增泽员远援源缘依源援源园, 孕约园援园缘

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1 中国肿瘤生物治疗杂志摇澡贼贼责 : 辕辕憎憎憎援遭蚤燥贼澡藻则援燥则早悦澡蚤灶允悦葬灶糟藻则月蚤燥贼澡藻则, 粤责则援圆园员猿, 灾燥造援圆园, 晕燥援圆 员缘猿 凿燥蚤 : 员园援猿愿苑圆辕躁援蚤泽泽灶援员园园苑鄄猿愿缘载援圆园员猿援园圆援园园源 研究快报 细胞毒力因子悦葬早粤上调人胃黏膜上皮郧耘杂鄄员细胞栽耘栽圆蛋白的表达 张昕, 付华林, 郅晓, 金卫林, 崔大祥 ( 上海交通大学微纳科学技术研究院生物纳米工程研究室微纳制造技术国家重点实验室薄膜与微细技术教育部重点实验室, 上海圆园园圆源园 ) [ 摘摇要 ] 摇目的 : 探讨幽门螺旋杆菌细胞毒素相关基因粤 ( 糟赠贼燥贼燥曾蚤灶葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿早藻灶藻粤, 悦葬早粤 ) 与胃黏膜中栽耘栽圆 ( 贼藻灶鄄藻造藻增藻灶贼则葬灶泽造燥糟葬贼蚤燥灶圆 ) 蛋白表达的关系, 以及栽耘栽圆在悦葬早粤致癌过程中可能的作用 方法 : 砸藻葬造鄄贼蚤皂藻孕悦砸检测人胃黏膜上皮细胞株 郧耘杂鄄员和胃癌细胞株酝郧悦鄄愿园猿中栽耘栽圆皂砸晕粤的表达水平, 细胞免疫染色法检测栽耘栽圆蛋白的细胞定位及表达 将 责耘郧云孕鄄悦葬早粤通过脂质体介导转染郧耘杂鄄员细胞, 用圆园园 μ 皂燥造辕蕴匀圆韵圆处理郧耘杂鄄员细胞建立氧化应激模型, 流式细胞仪检测细胞中活性氧 ( 则藻葬糟贼蚤增藻燥曾赠早藻灶泽责藻糟蚤藻泽, 砸韵杂 ) 和细胞周期的变化 结果 : 栽耘栽圆皂砸晕粤在郧耘杂鄄员细胞的表达水平低于胃癌酝郧悦鄄愿园猿 细胞 ( 员援园园依园援园愿增泽员援远愿依园援园苑, 孕约园郾园缘 ), 栽耘栽圆蛋白在郧耘杂鄄员细胞表达水平低于胃癌酝郧悦鄄愿园猿细胞 ( 愿援园怨依猿援缘苑增泽 员源援远园依圆援猿员, 孕约园援园缘 ) 与阴性对照组责耘郧云孕鄄晕员相比, 责耘郧云孕鄄悦葬早粤转染组郧耘杂鄄员细胞中栽耘栽圆皂砸晕粤表达水平升高 ( 员援园园依园郾园源增泽园援园远依园援园园, 孕约园援园缘 ), 栽耘栽圆蛋白表达水平也升高 ( 员远援源缘依源援源园增泽员园援愿圆依猿援猿怨, 孕约园援园缘 ), 砸韵杂积累水平升高 ( 员愿援猿怨依源援缘圆增泽员缘郾猿员依源郾源园, 孕约园援园缘 ), 细胞周期检测出现明显的凋亡峰 氧化应激 ( 匀圆韵圆处理 ) 模型中郧耘杂鄄员细胞与空白对照郧耘杂鄄员细胞相比, 栽耘栽圆皂砸晕粤水平升高 ( 员援源源依园援园圆增泽员援园园依园援园源, 孕约园援园缘 ), 栽耘栽圆蛋白表达水平增高 ( 员缘援苑圆依源郾缘圆 增泽员员援苑源依源援猿源, 孕约园援园缘 ) 结论 : 幽门螺旋杆菌毒力因子悦葬早粤可诱导郧耘杂鄄员细胞砸韵杂增高和细胞周期的失衡, 氧化应激可以诱导栽耘栽圆表达上调, 栽耘栽圆可能参与悦葬早粤的致癌过程 [ 关键词 ] 摇细胞毒素相关基因粤 ( 悦葬早粤 ); 幽门螺旋杆菌 ; 栽耘栽圆蛋白 ; 胃癌 ; 酝郧悦鄄愿园猿细胞株 ; 郧耘杂鄄员细胞株 ; 活性氧 [ 中图分类号 ] 摇砸苑猿缘援圆 ; 砸苑猿园援圆 ; 砸猿苑苑摇摇摇摇 [ 文献标志码 ] 摇粤摇摇摇摇 [ 文章编号 ] 摇员园园苑鄄猿愿缘载 ( 圆园员猿 ) 园圆鄄园员缘猿鄄园远 灾蚤则怎造藻灶糟藻枣葬糟贼燥则悦葬早粤怎责则藻早怎造葬贼藻泽栽耘栽圆责则燥贼藻蚤灶藻曾责则藻泽泽蚤燥灶蚤灶澡怎皂葬灶早葬泽贼则蚤糟皂怎糟燥泽葬藻责蚤贼澡藻造蚤葬造郧耘杂鄄员糟藻造造泽 在澡葬灶早载蚤灶, 云怎匀怎葬造蚤灶, 在澡蚤载蚤葬燥, 允蚤灶宰藻蚤造蚤灶, 悦怎蚤阅葬曾蚤葬灶早 ( 晕葬贼蚤燥灶葬造运藻赠蕴葬遭燥则葬贼燥则赠燥枣晕葬灶燥辕酝蚤糟则燥云葬遭则蚤糟葬贼蚤燥灶栽藻糟澡灶燥造燥早赠, 运藻赠蕴葬遭燥则葬贼燥则赠枣燥则栽澡蚤灶云蚤造皂葬灶凿酝蚤糟则燥枣葬遭则蚤糟葬贼蚤燥灶燥枣酝蚤灶蚤泽贼则赠燥枣耘凿怎糟葬贼蚤燥灶, 阅藻责葬则贼皂藻灶贼燥枣月蚤燥鄄晕葬灶燥杂糟蚤藻灶糟藻葬灶凿耘灶早蚤灶藻藻则蚤灶早, 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻燥枣酝蚤糟则燥辕晕葬灶燥杂糟蚤藻灶糟藻葬灶凿栽藻糟澡灶燥造燥早赠, 杂澡葬灶早澡葬蚤允蚤葬燥栽燥灶早哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠, 杂澡葬灶早澡葬蚤圆园园圆源园, 悦澡蚤灶葬 ) [ 粤遭泽贼则葬糟贼 ] 摇韵遭躁藻糟贼蚤增藻 : 栽燥蚤灶增藻泽贼蚤早葬贼藻贼澡藻葬泽泽燥糟蚤葬贼蚤燥灶遭藻贼憎藻藻灶贼澡藻藻曾责则藻泽泽蚤燥灶燥枣贼澡藻贼藻灶鄄藻造藻增藻灶贼则葬灶泽造燥糟葬贼蚤燥灶圆 ( 栽耘栽圆 ) 责则燥贼藻蚤灶葬灶凿贼澡藻糟赠贼燥贼燥曾蚤灶葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿早藻灶藻粤 ( 悦葬早粤 ) 燥枣匀藻造蚤糟燥遭葬糟贼藻则责赠造燥则蚤 ( 匀责 ), 葬灶凿贼燥藻曾责造燥则藻贼澡藻责燥泽泽蚤遭造藻皂藻糟澡葬灶蚤泽皂泽燥枣悦葬早粤蚤灶贼澡藻责则燥糟藻泽泽燥枣早葬泽贼则蚤糟糟葬则糟蚤灶燥早藻灶藻泽蚤泽援酝藻贼澡燥凿泽 : 砸藻葬造鄄贼蚤皂藻孕悦砸憎葬泽怎泽藻凿贼燥凿藻贼藻糟贼栽耘栽圆皂砸晕粤造藻增藻造蚤灶澡怎鄄皂葬灶早葬泽贼则蚤糟藻责蚤贼澡藻造蚤葬造郧耘杂鄄员糟藻造造泽葬灶凿早葬泽贼则蚤糟糟葬灶糟藻则酝郧悦鄄愿园猿糟藻造造泽援陨皂皂怎灶糟赠贼燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠憎葬泽怎泽藻凿贼燥凿藻贼藻糟贼贼澡藻栽耘栽圆责则燥贼藻蚤灶造燥糟葬造蚤扎葬贼蚤燥灶葬灶凿藻曾责则藻泽泽蚤燥灶蚤灶郧耘杂鄄员葬灶凿酝郧悦鄄愿园猿糟藻造造泽援郧耘杂鄄员糟藻造造泽憎藻则藻贼则葬灶泽枣藻糟贼藻凿憎蚤贼澡责耘郧云孕鄄悦葬早粤葬灶凿葬糟藻造造燥曾蚤凿葬贼蚤增藻泽贼则藻泽泽皂燥凿藻造憎葬泽糟燥灶泽贼则怎糟贼藻凿憎蚤贼澡圆园园 μ 皂燥造辕蕴匀圆韵圆援云造燥憎糟赠贼燥皂藻贼则赠憎葬泽怎泽藻凿贼燥葬灶葬造赠扎藻糟藻造造糟赠糟造藻葬灶凿砸韵杂蚤灶郧耘杂鄄员糟藻造造泽援砸藻泽怎造贼泽 : 栽澡藻皂藻葬灶藻曾责则藻泽泽蚤燥灶造藻增藻造燥枣栽耘栽圆皂砸晕粤蚤灶郧耘杂鄄员糟藻造造泽憎葬泽造燥憎藻则贼澡葬灶贼澡葬贼蚤灶酝郧悦鄄愿园猿糟藻造造泽 ( 员援园园依园援园愿增泽员援远愿依园援园苑, 孕约园援园缘 ) 援栽耘栽圆责则燥贼藻蚤灶藻曾责则藻泽泽蚤燥灶蚤灶郧耘杂鄄员糟藻造造泽憎葬泽造燥憎藻则贼澡葬灶贼澡葬贼蚤灶酝郧悦鄄愿园猿糟藻造造泽 ( 愿援园怨依猿援缘苑增泽员源援远园依圆援猿员, 孕约园援园缘 ) 援悦燥皂责葬则藻凿憎蚤贼澡贼澡藻灶藻早葬贼蚤增藻糟燥灶贼则燥造责耘郧云孕鄄晕员早则燥怎责, 贼澡藻皂藻葬灶藻曾责则藻泽鄄泽蚤燥灶造藻增藻造燥枣栽耘栽圆皂砸晕粤蚤灶责耘郧云孕鄄悦葬早粤鄄贼则葬灶泽枣藻糟贼藻凿郧耘杂鄄员糟藻造造泽憎葬泽蚤灶糟则藻葬泽藻凿 ( 员援园园依园援园源增泽园援园远依园郾园园, 孕约 [ 基金项目 ] 摇国家重点基础研究发展计划 ( 怨苑猿计划 ) 资助项目 ( 晕燥援圆园员园悦月怨猿猿怨园员 ), 国家杰出青年基金资助项目 ( 晕燥援愿员圆圆缘园员园 ) 孕则燥躁藻糟贼泽怎责责燥则贼藻凿遭赠贼澡藻晕葬贼蚤燥灶葬造运藻赠月葬泽蚤糟砸藻泽藻葬则糟澡葬灶凿阅藻增藻造燥责皂藻灶贼孕则燥早则葬皂 ( 怨苑猿孕则燥早则葬皂 ) 燥枣悦澡蚤灶葬 ( 晕燥援圆园员园悦月怨猿猿怨园员 ), 葬灶凿贼澡藻晕葬贼蚤燥灶葬造杂糟蚤藻灶糟藻云怎灶鄄凿葬贼蚤燥灶枣燥则阅蚤泽贼蚤灶早怎蚤泽澡藻凿再燥怎灶早杂糟澡燥造葬则燥枣悦澡蚤灶葬 ( 晕燥援愿员圆圆缘园员园 ) [ 作者简介 ] 摇张昕 ( 员怨愿苑原 ), 女, 山东淄博市人, 硕士生, 主要从事胃癌防治的基础和临床研究工作 耘鄄皂葬蚤造 : 扎遭澡赠灶员圆猿岳员圆远援糟燥皂 [ 通信作者 ] 摇崔大祥 ( 悦怎蚤阅葬曾蚤葬灶早, 糟燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早葬怎贼澡燥则 ), 耘鄄皂葬蚤造 : 凿曾糟怎蚤岳泽躁贼怎援藻凿怎援糟灶 [ 网络出版 ] 摇澡贼贼责 : 辕辕憎憎憎援糟灶噪蚤援灶藻贼辕噪糟皂泽辕凿藻贼葬蚤造辕猿员援员苑圆缘援砸援圆园员猿园源圆源援员猿员园援园园源援澡贼皂造

2 员缘源 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园员猿年源月, 圆园 ( 圆 ) 园郾园缘 ), 葬灶凿栽耘栽圆责则燥贼藻蚤灶藻曾责则藻泽泽蚤燥灶蚤灶责耘郧云孕鄄悦葬早粤鄄贼则葬灶泽枣藻糟贼藻凿郧耘杂鄄员糟藻造造泽憎葬泽葬造泽燥蚤灶糟则藻葬泽藻凿 ( 员园援愿圆依猿援猿怨增泽员远援源缘依源援源园, 孕约园援园缘 ), 葬灶凿葬澡蚤早澡藻则造藻增藻造燥枣砸韵杂责则燥凿怎糟贼蚤燥灶憎葬泽燥遭泽藻则增藻凿蚤灶责耘郧云孕鄄悦葬早粤鄄贼则葬灶泽枣藻糟贼藻凿郧耘杂鄄员糟藻造造泽 ( 远怨依怨郾园增泽怨员依员远援愿, 孕约园援园缘 ), 憎澡蚤糟澡泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠凿蚤泽责造葬赠藻凿贼澡藻糟藻造造葬责燥责贼燥泽蚤泽蚤灶糟赠糟造藻葬灶葬造赠泽蚤泽援陨灶贼澡藻糟藻造造燥曾蚤凿葬贼蚤增藻泽贼则藻泽泽皂燥凿藻造, 栽耘栽圆皂砸晕粤造藻增藻造蚤灶匀圆韵圆贼则藻葬贼藻凿糟藻造造泽憎葬泽澡蚤早澡藻则贼澡葬灶贼澡葬贼蚤灶灶燥则皂葬造郧耘杂鄄员糟藻造造泽 ( 员援源源依园援园圆增泽员援园园依园援园源, 孕约园郾园缘 ) 葬灶凿栽耘栽圆责则燥贼藻蚤灶藻曾责则藻泽泽蚤燥灶造藻增藻造憎葬泽澡蚤早澡藻则贼澡葬灶贼澡葬贼蚤灶灶燥则皂葬造郧耘杂鄄员糟藻造造泽 ( 员员援苑源依源援猿源增泽员缘援苑圆依源郾缘圆, 孕约园援园缘 ) 援悦燥灶糟造怎泽蚤燥灶 : 悦葬早粤枣葬糟贼燥则糟葬灶蚤灶凿怎糟藻砸韵杂葬糟糟怎皂怎造葬贼蚤燥灶葬灶凿糟藻造造糟赠糟造藻凿蚤泽则怎责贼蚤燥灶燥枣郧耘杂鄄员, 蚤灶凿蚤糟葬贼蚤灶早贼澡葬贼栽耘栽圆糟葬灶遭藻怎责则藻早怎造葬贼藻凿遭赠燥曾蚤凿葬贼蚤增藻泽贼则藻泽泽葬灶凿皂葬赠遭藻蚤灶增燥造增藻凿蚤灶贼澡藻责则燥早则藻泽泽燥枣悦葬早粤鄄蚤灶凿怎糟藻凿糟葬则糟蚤灶燥早藻灶藻泽蚤泽援 [ 运藻赠憎燥则凿泽 ] 摇糟赠贼燥贼燥曾蚤灶葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿早藻灶藻粤 ( 悦葬早粤 ); 匀藻造蚤糟燥遭葬糟贼藻则责赠造燥则蚤 ; 贼藻灶鄄藻造藻增藻灶贼则葬灶泽造燥糟葬贼蚤燥灶圆责则燥贼藻蚤灶 ; 早葬泽贼则蚤糟糟葬灶糟藻则 ; 酝郧悦鄄愿园猿糟藻造造 ; 郧耘杂鄄员糟藻造造 ; 则藻葬糟贼蚤增藻燥曾赠早藻灶泽责藻糟蚤藻泽 [ 悦澡蚤灶允悦葬灶糟藻则月蚤燥贼澡藻则, 圆园员猿, 圆园 ( 圆 ): 员缘猿鄄员缘愿 ] 摇摇 摇摇全世界约有一半人口感染幽门螺旋杆菌 ( 匀藻造蚤糟燥鄄遭葬糟贼藻则责赠造燥则蚤, 匀责 ), 其感染与胃癌 胃黏膜相关淋巴样 [ 员鄄猿组织淋巴瘤的发生密切相关 ] 细胞毒素相关基因 粤 ( 糟赠贼燥贼燥曾蚤灶鄄葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿早藻灶藻粤, 悦葬早粤 ) 是重要的毒力基因, 悦葬早毒力岛 ( 悦葬早责葬贼澡燥早藻灶藻糟蚤贼赠蚤泽造葬灶凿, 悦葬早孕粤陨 ) 是一个由圆苑耀耀耀耀耀耀耀耀猿员个基因组成的约源园园园园遭责的阅晕粤片段, 编码功能性 Ⅳ 型分泌系统 ( 贼赠责藻 Ⅳ 泽藻糟则藻贼蚤燥灶泽赠泽鄄贼藻皂, 栽源杂杂 ) 作为悦葬早粤的运输通道 悦葬早粤经栽源杂杂进入宿主细胞, 通过依赖磷酸化和 ( 或 ) 独立于磷酸化的机制, 与宿主细胞多种蛋白相互作用, 导致细胞功能 [ 圆, 源鄄远异常 ] [ 员鄄猿, 苑, 愿 ] 有报道称, 悦葬早粤阳性的匀责感染者罹患癌症的风险更大 活性氧 ( 则藻葬糟贼蚤增藻燥曾赠早藻灶泽责藻糟蚤藻泽, 砸韵杂 ) 一直在促癌过程中起重要作用, 砸韵杂水 [ 员, 远, 怨平过高易引起阅晕粤氧化性损伤 ], 使得细胞在分化过程中产生不可修复或错误修复的变化 栽耘栽圆 ( 贼藻灶鄄藻造藻增藻灶贼则葬灶泽造燥糟葬贼蚤燥灶圆 ) 是在髓系肿瘤中新近发现的抑癌基因, 位于染色体源择圆源上, 缺失或者突变会引 [ 员园鄄员员起骨髓细胞的恶性增生 ] 栽耘栽圆蛋白属于 α 鄄酮圆垣戊二酸 ( 葬造责澡葬鄄噪藻贼燥早造怎贼葬则蚤糟葬糟蚤凿,α 鄄运郧 ) 和云藻依赖的双加氧酶, 可氧化缘鄄甲基胞嘧啶 ( 缘鄄皂藻贼澡赠造糟赠贼燥泽蚤灶藻, 缘皂悦 ) 生成缘鄄羟甲基胞嘧啶 ( 缘鄄澡赠凿则燥曾赠皂藻贼澡赠糟赠贼燥泽蚤灶藻, [ 员圆鄄员缘缘澡皂悦 ), 在阅晕粤主动去甲基化中扮演重要角色 ] 本研究试图探讨栽耘栽圆的表达与毒力因子悦葬早粤在胃癌发生中的相互作用 员摇 员援员摇 材料与方法 细胞株及主要试剂 人类胃黏膜上皮细胞系郧耘杂鄄员 胃腺癌细胞系 酝郧悦鄄愿园猿由中科院上海细胞库提供 常规复苏 郧耘杂鄄员与酝郧悦鄄愿园猿细胞, 接种于含有员园园哉辕皂造青霉素 员园园 μ 早辕皂造链霉素 ( 陨灶增蚤贼则燥早藻灶公司 ) 员园豫胎牛血清 ( 郧蚤遭糟燥公司 ) 的砸孕酝陨员远源园 ( 匀赠糟造燥灶藻公司 ) 培养液, 猿苑益 缘豫悦韵圆 饱和湿度条件下传代培养, 取对数生长期的细胞进行实验 重组质粒责耘郧云孕鄄悦葬早粤由浙江大学朱永良教授馈赠 兔抗人栽耘栽圆单克隆抗体购自责栽郧蕴葬遭公司, 兔抗人缘澡皂悦单克隆抗体购自粤糟贼蚤增藻酝燥贼蚤枣公司, 细胞骨架标志物乙酰化 α 鄄栽怎遭怎造蚤灶购自杂葬灶贼葬悦则怎扎公司, 荧光二抗粤造藻曾葬云造怎燥则缘怨源和粤造藻曾葬云造怎燥则源愿愿购自 酝燥造藻糟怎造葬则孕则燥遭藻泽公司, 辣根过氧化物酶标记链霉亲和素购自孕蚤藻则糟藻公司 亚细胞蛋白组抽提试剂盒 栽酝杂再月砸孕则藻皂蚤曾耘曾栽葬择 Ⅱ 购自栽葬运葬砸葬公司, 阅粤孕陨试剂 超氧化物阴离子荧光探针二氢乙锭 ( 凿蚤澡赠凿则燥藻贼澡蚤凿蚤鄄怎皂, 阅匀耘 ) 购自上海碧云天公司, 多聚甲醛购于国药集团化学试剂有限公司, 无血清培养基韵责贼蚤鄄酝耘酝 胰酶栽酝 ( 栽则赠责泽蚤灶鄄耘阅栽粤 ) 蕴蚤责燥枣藻糟贼葬皂蚤灶藻圆园园园 砸晕粤栽砸陨扎燥造试剂购自美国陨灶增蚤贼则燥早藻灶公司 逆转录试剂盒购自栽燥赠燥遭燥 公司, 碘化丙啶 ( 责则燥责蚤凿蚤怎皂蚤燥凿蚤凿藻, 孕陨 ) 购自杂蚤早皂葬鄄粤造凿则蚤糟澡公司 细胞培养箱购自栽澡藻则皂燥公司, 流式细胞仪购自月藻糟噪皂葬灶悦燥怎造贼藻则公司, 孕悦砸仪购自耘责责藻灶凿燥则枣 公司, 共聚焦激光扫描显微镜购自蕴藻蚤糟葬公司 员援圆摇 责耘郧云孕鄄悦葬早粤转染郧耘杂鄄员细胞 适量密度郧耘杂鄄员细胞接种于圆源孔板, 培养过夜, 愿园豫汇合时进行转染 转染前, 先用韵责贼蚤鄄酝耘酝 栽酝处理细胞猿园皂蚤灶, 转染步骤按蕴蚤责燥枣藻糟贼葬皂蚤灶圆园园园操作手册进行, 报告基因质粒责耘郧云孕鄄悦葬早粤和内参质粒责耘郧云孕鄄晕员与转染试剂的比例是圆援缘 μ 早颐源 μ 造, 实验分责耘郧云孕鄄悦葬早粤转染组 责耘郧云孕鄄晕员阴性对照组 员援猿摇 砸藻葬造鄄贼蚤皂藻孕悦砸检测郧耘杂鄄员和酝郧悦鄄愿园猿细胞中 栽耘栽圆皂砸晕粤的表达 利用栽砸陨扎燥造试剂分别提取郧耘杂鄄员和酝郧悦鄄愿园猿 细胞的总砸晕粤, 按照陨灶增蚤贼则燥早藻灶公司逆转录试剂盒合成糟阅晕粤, 反应条件为 : 源圆益猿园皂蚤灶 怨怨益缘皂蚤灶, 所得糟阅晕粤产物保存于原圆园益冰箱待用 采用 栽酝杂再月砸孕则藻皂蚤曾耘曾栽葬择 Ⅱ 试剂盒以已合成糟阅晕粤为模板进行则藻葬造鄄贼蚤皂藻孕悦砸反应 栽耘栽圆皂砸晕粤的引物序列 : 上游缘忆鄄栽栽悦栽栽悦悦悦悦粤栽郧粤悦悦粤悦鄄猿忆, 下游缘忆鄄粤悦郧悦栽栽郧郧粤粤郧悦粤郧郧粤郧粤栽鄄猿忆 孕悦砸循环条件为

3 张昕, 等援细胞毒力因子悦葬早粤上调人胃黏膜上皮郧耘杂鄄员细胞栽耘栽圆蛋白的表达 员缘缘 变性怨源益猿园泽, 退火缘缘益源缘泽, 延伸远缘益源缘泽, 猿园 个循环 ; 最后再苑圆益延伸缘皂蚤灶 孕悦砸完成后, 软件分析基因的扩增情况, 得到相应悦贼值, 以郧粤孕阅匀作为内参照, 每组设猿个复孔, 基因相对表达量 ( 砸匝 ) 原 悦贼采用圆方法计算 员援源摇细胞免疫化学染色检测郧耘杂鄄员和酝郧悦鄄愿园猿细胞中栽耘栽及缘澡皂悦表达 郧耘杂鄄员和酝郧悦鄄愿园猿细胞去除培养基后迅速用 孕月杂冲洗圆耀耀耀耀耀耀耀耀猿次, 用源豫的多聚甲醛室温固定 员缘皂蚤灶, 孕月杂洗猿耀耀耀耀耀耀耀耀源次 加入原圆园益预冷的甲醇处理员园皂蚤灶, 再用孕月杂洗猿耀耀耀耀耀耀耀耀源次 用含员园豫耀耀耀耀耀耀耀耀圆园豫驴血清的抗体稀释液室温封闭猿园耀耀耀耀耀耀耀耀源园皂蚤灶, 用抗体稀释液稀释的一抗 ( 抗体稀释度 : 栽耘栽圆为员颐圆园园 ; 缘澡皂悦为 员颐缘园园 ; 乙酰化 α 鄄栽怎遭怎造蚤灶为员颐圆园园 ) 于源益孵育过夜 次日用孕月杂洗涤, 每次缘皂蚤灶, 洗圆耀耀耀耀耀耀耀耀猿次后加入用 孕月杂稀释的荧光二抗 ( 抗体稀释度 : 粤造藻曾葬云造怎燥则缘怨源为 员颐愿园园 ; 粤造藻曾葬云造怎燥则源愿愿为员颐源园园 ), 在室温孵育源缘皂蚤灶 至员澡, 孕月杂洗源次 用缘园豫甘油辕孕月杂 ( 含阅粤孕陨 ) 封片 细胞爬片用荧光显微镜进行观察, 采集图片, 主要包括各荧光通道图片 荧光叠加图片 ( 酝藻则早藻 ) 微分干涉图片 ( 凿蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬造蚤灶贼藻则枣藻则藻灶糟藻糟燥灶贼则葬泽贼, 阅陨悦 ) 荧光结果由陨皂葬早藻孕则燥孕造怎泽灾藻则泽蚤燥灶源郾园软件分析, 检测细胞的荧光密度值 每张爬片检测圆耀耀耀耀耀耀耀耀猿个非边缘视野, 每个视野纪录一组数据 员援缘摇 流式细胞术检测郧耘杂鄄员细胞的砸韵杂 用阅匀耘储存母液以员园 μ 皂燥造辕蕴的终浓度加入细胞培养基, 郧耘杂鄄员细胞在猿苑益避光孵育猿园皂蚤灶装载, 随后用孕月杂快速清洗猿次, 用胰酶将其消化成单个细胞进行流式细胞仪检测, 对责耘郧云孕鄄悦葬早粤转染组与 责耘郧云孕鄄晕员阴性对照组数据进行分析处理 员援远摇 流式细胞术检测郧耘杂鄄员细胞的细胞周期 用胰酶消化收集责耘郧云孕鄄悦葬早粤转染组和责耘郧云孕鄄晕员阴性对照组的郧耘杂鄄员, 孕月杂洗圆遍, 弃上清, 加入 苑园豫冰乙醇吹打均匀, 原圆园益过夜保存 次日用 孕月杂洗去乙醇, 员园园园伊早离心猿皂蚤灶, 洗圆遍 孕月杂 重悬细胞, 用园援缘 μ 早辕皂造孕陨对细胞进行染色, 避光 猿苑益培养, 进行流式细胞仪检测, 对责耘郧云孕鄄悦葬早粤 转染组与责耘郧云孕鄄晕员对照组数据进行分析处理 员援苑摇 统计学分析 以上实验均重复猿次以上 计量资料用珋曾依泽表示, 杂孕杂杂统计软件进行重复测量方差分析, 多组间比较用单因素方差分析, 两两比较采用蕴杂阅鄄贼检验, 以 孕约园援园缘或孕约园援园员表示差异有统计学意义 圆摇结摇果 圆援员摇 栽耘栽圆在郧耘杂鄄员和酝郧悦鄄愿园猿细胞中的分布 本研究利用细胞骨架标记物乙酰化 α 鄄贼怎遭怎造蚤灶和栽耘栽圆抗体进行免疫细胞化学双标染色, 考察栽耘栽圆在郧耘杂鄄员和酝郧悦鄄愿园猿细胞中的分布情况 结果显示 : 在郧耘杂鄄员细胞中, 栽耘栽圆定位于细胞核和细胞质中, 在核内呈颗粒状, 而胞质中栽耘栽圆分布则较弥散 ( 图员粤 ); 在酝郧悦鄄愿园猿细胞中, 栽耘栽圆在核内表达量明显高于胞质部分 ( 图员粤 ) 在同一曝光时间条件下, 由平均荧光强度值比较得知, 郧耘杂鄄员细胞组为 ( 愿援园怨依猿援缘苑 ), 酝郧悦鄄愿园猿细胞组为 ( 员源援远园依圆郾猿员 ), 后者细胞栽耘栽圆表达有明显增强 ( 孕约园援园缘 ) 进一步使用砸藻葬造鄄贼蚤皂藻孕悦砸对郧耘杂鄄员和酝郧悦鄄愿园猿细胞内的栽耘栽圆皂砸晕粤水平进行检测, 结果显示, 郧耘杂鄄员细胞组的砸匝值为 ( 员援园园依园援园愿 ), 酝郧悦鄄愿园猿细胞组的砸匝值为 ( 员援远愿依园援园苑 ), 栽耘栽圆皂砸晕粤在酝郧悦鄄愿园猿细胞中的表达水平较高 ( 孕约园援园缘 ) 缘澡皂悦主要是栽耘栽蛋白氧化缘皂悦的产物, 本研究同时对缘澡皂悦进行免疫细胞化学检测 图员月显示缘澡皂悦均定位于细胞核内, 郧耘杂鄄员细胞组平均荧光强度为 ( 员猿援苑猿依猿援园怨 ), 酝郧悦鄄愿园猿细胞组为 ( 苑郾缘园依圆援愿怨 ) 在郧耘杂鄄员细胞中缘澡皂悦的表达量明显高于酝郧悦鄄愿园猿细胞 ( 孕约园援园缘 ) 圆援圆摇责耘郧云孕鄄悦葬早粤转染促进郧耘杂鄄员细胞中栽耘栽圆的表达目前多数研究人员认为胃组织癌变的起始阶段主要是匀责感染发生作用, 白细胞介素愿 ( 蚤灶贼藻则造藻怎鄄噪蚤灶鄄愿, 陨蕴鄄愿 ) 肿瘤坏死因子 α( 贼怎皂燥则灶藻糟则燥泽蚤泽枣葬糟贼燥则, 栽晕云鄄 α) 等细胞因子水平是反映匀责感染的重要指标 已知在匀责相关胃癌发病机制中, 悦葬早粤为主的毒力因子可进入胃黏膜上皮细胞引起强烈的细胞炎症反应, 引起氧自由基明显增加, 促进细胞因子如陨蕴鄄愿 栽晕云鄄 α 的释放和组织损害, 而悦葬早粤阴性的匀责无此作用, 这都说明悦葬早粤在引起炎症反应及进一步病理损害的过程中可能起到重要的作用 利用郧云孕标记的悦葬早粤表达质粒责耘郧云孕鄄悦葬早粤瞬时转染入郧耘杂鄄员细胞中, 用共聚焦显微镜检测郧云孕表达情况以保证转染效率 细胞免疫染色图片 ( 图圆 ) 显示, 责耘郧云孕鄄悦葬早粤转染细胞与阴性对照细胞相比, 转染组栽耘栽圆平均荧光强度 ( 员远援源缘依源援源园 ) 强于对照组栽耘栽圆平均荧光强度 ( 员园援愿圆依猿援猿怨 )( 孕约园援园缘 ); 转染组缘澡皂悦平均荧光强度 ( 员猿援猿愿依猿援园园 ) 强于对照组缘澡皂悦平均荧光强度 ( 员员援怨苑依猿援猿怨 )( 孕约园援园缘 ) 结果提示, 责耘郧云孕鄄悦葬早粤转染后细胞中栽耘栽圆和缘澡皂悦表达均有所增高 同时砸栽鄄孕悦砸检测结果显示, 责耘郧云孕鄄悦葬早粤转染组栽耘栽圆皂砸晕粤的砸匝值为 ( 员援园园依园援园源 ), 阴性对照组栽耘栽圆皂砸晕粤的砸匝值为 ( 园援远园依园援园园 ), 两组相比

4 员缘远 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园员猿年源月, 圆园 ( 圆 ) 较, 转染组栽耘栽圆皂砸晕粤表达显著升高 ( 孕约园援园缘 ) ( 平均荧光强度值为员员援苑源依源援猿源 ) 相比, 栽耘栽圆在匀圆韵圆处理后的郧耘杂鄄员细胞中表达明显增强 ( 平均荧光强度值为员缘援苑圆依源郾缘圆 )( 孕约园援园缘 ) 同时, 用则藻葬造鄄贼蚤皂藻孕悦砸 实验检测栽耘栽圆皂砸晕粤水平变化, 匀圆韵圆处理郧耘杂鄄员细胞的砸匝值为 ( 员援源源依园援园圆 ), 而空白对照即未处理 郧耘杂鄄员细胞的砸匝值为 ( 员援园园依园援园远 ), 说明匀圆韵圆处理使栽耘栽圆皂砸晕粤水平升高 ( 孕约园援园缘 ) 图员摇郧耘杂鄄员和酝郧悦鄄愿园猿细胞中栽耘栽圆 ( 粤 ) 和缘澡皂悦 ( 月 ) 的表达 ( 遭葬则 : 圆园 μ 皂 ) 云蚤早援员摇耘曾责则藻泽泽蚤燥灶泽燥枣栽耘栽圆 ( 粤 ) 葬灶凿缘澡皂悦 ( 月 ) 蚤灶郧耘杂鄄员葬灶凿酝郧悦鄄愿园猿糟藻造造泽 ( 遭葬则 : 圆园 μ 皂 ) 圆援猿摇 责耘郧云孕鄄悦葬早粤转染后郧耘杂鄄员细胞大量凋亡和 砸韵杂水平升高 圆原韵是生物体内重要的自由基之一, 也是所有 砸韵杂自由基的前体 为了解砸韵杂是否是栽耘栽圆高表达的直接诱因, 本研究进一步对责耘郧云孕鄄悦葬早粤转染的郧耘杂鄄员细胞与对照细胞进行砸韵杂检测, 用孕陨染色对细胞周期进行检测 结果表明责耘郧云孕鄄悦葬早粤转染组郧耘杂鄄员细胞出现大量凋亡 郧员期延长 ( 图猿粤 猿月 ) 用超氧化物离子光探针阅匀耘对细胞进行荧光染色标记, 流式细胞仪检测结果表明 : 责耘郧云孕鄄悦葬鄄早粤转染细胞受到激发后比对照组细胞的荧光强度有明显加强 ( 员缘援猿员依源援源园增泽员愿援猿怨依源援缘圆, 孕约园郾园缘 ) 结果说明, 责耘郧云孕鄄悦葬早粤转染后郧耘杂鄄员细胞 砸韵杂积累水平升高 圆援源摇 栽耘栽圆蛋白在氧化应激条件下表达水平升高 利用匀圆韵圆处理郧耘杂鄄员细胞模拟上述转染实验的氧化应激模型 对郧耘杂鄄员细胞用圆园园 μ 皂燥造辕蕴匀圆韵圆处理员圆澡后, 其形态学变化 ( 图源 ) 明显, 细胞胞膜出现皱缩, 胞核浓缩或碎裂 ; 未处理细胞呈多边形铺展状态, 细胞膜完整, 核膜界限清楚, 胞核近圆形 细胞免疫荧光染色 ( 图源 ) 结果表明, 与无任何处理的郧耘杂鄄员细胞 图圆摇 栽耘栽圆 ( 粤 ) 和缘澡皂悦 ( 月 ) 在责耘郧云孕鄄悦葬早粤转染 郧耘杂鄄员细胞中的表达 ( 遭葬则 : 圆园 μ 皂 ) 云蚤早援圆摇耘曾责则藻泽泽蚤燥灶泽燥枣栽耘栽圆 ( 粤 ) 葬灶凿缘澡皂悦 ( 月 ) 蚤灶责耘郧云孕鄄悦葬早粤贼则葬灶泽枣藻糟贼藻凿郧耘杂鄄员糟藻造造泽 ( 遭葬则 : 圆园 μ 皂 ) 哉责 : 责耘郧云孕鄄悦葬早粤 ; 月燥贼贼燥皂 : 责耘郧云孕鄄晕员宰澡蚤贼藻葬则则燥憎 : 栽澡藻糟藻造造憎葬泽泽泽怎糟藻泽泽枣怎造造赠贼则葬灶泽枣藻糟贼藻凿 猿摇讨摇论 栽耘栽圆蛋白是肿瘤细胞表观修饰机制中新近的研究热点之一, 目前其研究方向主要在急性髓系白血病 ( 葬糟怎贼藻皂赠藻造燥蚤凿造藻怎噪藻皂蚤葬, 粤酝蕴 ) 慢性粒鄄单核细胞性白血病 ( 糟澡则燥灶蚤糟早则葬灶怎造燥糟赠贼藻鄄皂燥灶糟赠贼藻造藻怎噪藻皂蚤葬, 悦酝酝蕴 ) 和不能分类的骨髓增殖肿瘤 ( 怎灶糟造葬泽泽蚤枣蚤藻凿皂赠藻造燥责则燥造蚤枣藻则葬贼蚤增藻灶藻燥责造葬泽皂, 酝孕晕 ) [ 员远鄄员愿 ] 等髓系肿瘤 [ 员园鄄员员, 员苑, 员怨鄄圆园 ] 中, 研究发现, 栽耘栽圆基因在大部分恶性血液病患者中突变或缺失, 因此确定栽耘栽圆基因是

5 张昕, 等援细胞毒力因子悦葬早粤上调人胃黏膜上皮郧耘杂鄄员细胞栽耘栽圆蛋白的表达 员缘苑 这些疾病产生的一种癌基因, 但栽耘栽圆在胃癌中的研究相对较少 本研究致力于对栽耘栽圆蛋白在悦葬早粤 诱导胃癌发生早期所扮演角色进行初步探讨 多项 [ 员鄄猿, 愿, 圆员 ] 研究表明, 悦葬早粤阳性匀责株有更高的毒力, 悦葬早粤进入胃黏膜上皮细胞引起的长期炎症可造成细胞损伤, 进而引起萎缩及肠上皮化生, 乃至最终的细胞癌变 图猿摇 云蚤早援猿摇 责耘郧云孕鄄悦葬早粤转染后郧耘杂鄄员细胞的细胞周期分析 悦藻造造鄄糟赠糟造藻葬灶葬造赠泽蚤泽蚤灶责耘郧云孕鄄悦葬早粤贼则葬灶泽枣藻糟贼藻凿郧耘杂鄄员糟藻造造泽 粤 : 悦燥灶贼则燥造糟藻造造泽 ; 月 : 责耘郧云孕鄄悦葬早粤贼则葬灶泽枣藻糟贼藻凿郧耘杂鄄员糟藻造造泽 图源摇匀圆韵圆处理后郧耘杂鄄员细胞的形态学特征和栽耘栽圆表达 ( 遭葬则 : 猿园 μ 皂 ) 云蚤早援源摇栽耘栽圆藻曾责则藻泽泽蚤燥灶葬灶凿皂燥则责澡燥造燥早赠燥枣郧耘杂鄄员糟藻造造泽藻曾责燥泽藻凿贼燥匀圆韵圆 ( 遭葬则 : 猿园 μ 皂 ) 摇摇为了检测悦葬早粤蛋白在寄主细胞的作用, 有研 [ 圆圆 ] 究人员将匀责菌株分离得到悦葬早粤基因利用表达载体转染进入胃黏膜上皮细胞中, 结果证明载体表达的悦葬早粤也会在磷酸化后与酪氨酸激酶发生作用, 同样引起宿主细胞出现标志性的蜂鸟表型, 后者以细胞伸长和扩散为主要特征 另发现匀责主要在黏着斑处进行局部悦葬早粤表达, 而载体表达的悦葬早粤 则在整个胞膜上表达 本研究同样利用悦葬早粤转染实验来模拟悦葬早粤诱导的细胞癌变前期过程, 检测 栽耘栽圆蛋白在其中发挥的作用 砸藻葬造鄄贼蚤皂藻孕悦砸结果表明, 栽耘栽圆皂砸晕粤在正常细胞郧耘杂鄄员 责耘郧云孕鄄悦葬早粤转染郧耘杂鄄员细胞和胃癌 酝郧悦鄄愿园猿细胞中的表达各不相同 细胞免疫染色结果表明, 栽耘栽圆蛋白在胃癌酝郧悦鄄愿园猿细胞中入核趋势明显, 但产物缘澡皂悦的表达量却下降, 同时 责耘郧云孕鄄悦葬早粤转染细胞中的栽耘栽圆表达量也有增高, 缘澡皂悦的水平却相应增高 这些结果都与髓系肿瘤中栽耘栽圆的表现不同 已知栽耘栽蛋白参与的动物细胞阅晕粤主动去甲基化过程主要如下 : 某些缘皂悦被 栽耘栽氧化成缘澡皂悦, 接着缘澡皂悦被粤陨阅粤孕韵月耘悦脱氨酶脱氨基生成缘羟基尿嘧啶 ( 缘鄄澡赠凿则燥曾赠皂藻贼澡赠造怎则葬鄄糟蚤造, 缘澡皂哉 ), 进一步被氧化成缘鄄醛基胞嘧啶 ( 缘鄄枣燥则皂赠造糟赠贼燥泽蚤灶藻, 缘枣悦 ) 缘鄄羧基胞嘧啶 ( 缘鄄糟葬则遭燥曾赠造糟赠鄄贼燥泽蚤灶藻, 缘糟葬悦 ), 缘澡皂哉或缘糟葬悦被阅晕粤糖苷酶切除, 空缺随后通过碱基切除修复途径 ( 遭葬泽藻鄄藻曾糟蚤泽蚤燥灶鄄则藻责葬蚤则责葬贼澡憎葬赠, 月耘砸 ) 填补为未甲基化悦 考虑到阅晕粤甲基化模式紊乱是肿瘤细胞的明显特征之一, 肿瘤细胞常表现出阅晕粤总体低甲基化和抑癌基因启动子 [ 员园, 员远鄄员愿, 圆猿 ] 高甲基化现象 另有多个研究指出, 仅 栽耘栽圆蛋白单方面过表达并不影响体内缘澡皂悦的整体水平, 此处缘澡皂悦积累水平的差异现象正可说明细胞去甲基化过程的复杂性 不同肿瘤中, 栽耘栽圆发挥的作用可能也不尽相同, 或可以通过其他途径来实现其调控胃癌的作用, 这需进一步探讨 后续实验中砸韵杂检测和细胞周期分析都表明 悦葬早粤因子引起细胞内砸韵杂增加, 发生炎症反应, 导 [ 远, 圆源鄄猿员 ] 致大量细胞出现凋亡 这些都与之前的研究 一致 : 匀责感染和癌变原因与炎症反应和宿主细胞失衡相关 悦葬早粤直接引起的砸韵杂暴发是细胞炎症反应的最主要诱因之一, 而栽耘栽圆蛋白在表观遗传学的重要意义不言而喻 细胞氧化应激模型的结果表明, 栽耘栽圆蛋白的增高是砸韵杂诱导的结果 本研究推测胃黏膜上皮细胞内早期发生的砸韵杂水平增高和细胞周期失衡, 可能增加了阅晕粤损伤 复制错误及突变的可能性, 引起栽耘栽圆的高表达, 某些局部 缘澡皂悦水平发生变化导致细胞恶变 而长期的细胞炎症反应可能引起整体阅晕粤去甲基化与甲基化平衡打破, 使肿瘤细胞逃避了凋亡机制, 反过来进一步促进寄主细胞代谢失衡 生命活动紊乱等不正常的表现, 引起了胃癌的发生 但与实际匀责感染上皮细胞过程相比, 责耘郧云孕鄄悦葬早粤转染对栽耘栽圆蛋白的作用只能得出一个初步的结论 胃癌发生是一个多因素 多步骤的过程, 由胃炎发展成胃癌是一个较漫长的阶段, 栽耘栽圆仅是其中一个因素, 还有很多其他因素影响胃癌的发生 发展, 值得进一步的深入研究

6 员缘愿 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园员猿年源月, 圆园 ( 圆 ) [ 参考文献 ] [ 员 ] 摇云葬则蚤灶葬贼蚤云, 悦葬则凿蚤灶砸, 月燥则贼燥造葬皂蚤酝, 藻贼葬造援韵曾蚤凿葬贼蚤增藻阅晕粤凿葬皂葬早藻蚤灶早葬泽贼则蚤糟糟葬灶糟藻则 : 悦葬早粤泽贼葬贼怎泽葬灶凿韵郧郧员早藻灶藻责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂 [ 允 ] 援陨灶贼允悦葬灶糟藻则, 圆园园愿, 员圆猿 ( 员 ): 缘员鄄缘缘援 [ 圆 ] 摇郧则葬澡葬皂阅再, 再葬皂葬燥噪葬再援匀援责赠造燥则蚤葬灶凿糟葬早粤 : 砸藻造葬贼蚤燥灶泽澡蚤责泽憎蚤贼澡早葬泽贼则蚤糟糟葬灶糟藻则, 凿怎燥凿藻灶葬造怎造糟藻则, 葬灶凿则藻枣造怎曾藻泽燥责澡葬早蚤贼蚤泽葬灶凿蚤贼泽糟燥皂鄄责造蚤糟葬贼蚤燥灶泽 [ 允 ] 援匀藻造蚤糟燥遭葬糟贼藻则, 圆园园员, 猿 ( 猿 ): 员源缘鄄员缘员援 [ 猿 ] 摇运澡燥凿葬蚤蚤在, 郧澡葬凿藻则蚤葬灶杂酝, 粤噪遭葬则扎葬凿藻澡晕葬躁葬则砸, 藻贼葬造援悦葬早粤葬灶凿灾葬糟粤泽贼葬贼怎泽葬灶凿蚤灶枣造怎藻灶糟藻燥枣匀藻造蚤糟燥遭葬糟贼藻则责赠造燥则蚤蚤灶枣藻糟贼蚤燥灶燥灶泽藻则怎皂燥曾蚤凿葬贼蚤增藻阅晕粤凿葬皂葬早藻蚤灶陨则葬灶蚤葬灶责葬贼蚤藻灶贼泽憎蚤贼澡责藻责贼蚤糟怎造糟藻则凿蚤泽藻葬泽藻 [ 允 ] 援陨则允酝藻凿杂糟蚤, 圆园员员, 员愿园 ( 员 ): 员缘缘鄄员远员援 [ 源 ] 摇酝葬燥在允, 栽葬灶早匝允, 在澡葬灶早悦粤, 藻贼葬造援粤灶贼蚤鄄责则燥造蚤枣藻则葬贼蚤燥灶葬灶凿葬灶贼蚤鄄蚤灶增葬泽蚤燥灶藻枣枣藻糟贼泽燥枣凿蚤燥泽早藻灶蚤灶燥灶早葬泽贼则蚤糟糟葬灶糟藻则月郧悦鄄愿圆猿糟藻造造泽憎蚤贼澡匀陨云鄄员 α 泽澡砸晕粤泽 [ 允 ] 援陨灶贼允酝燥造杂糟蚤, 圆园员圆, 员猿 ( 缘 ): 远缘圆员鄄远缘猿猿援 [ 缘 ] 摇蕴蚤怎在, 载怎载, 悦澡藻灶蕴, 藻贼葬造援匀藻造蚤糟燥遭葬糟贼藻则责赠造燥则蚤悦葬早粤蚤灶澡蚤遭蚤贼泽贼澡藻藻曾责则藻泽泽蚤燥灶燥枣砸怎灶曾猿增蚤葬杂则糟辕酝耘运辕耘砸运葬灶凿责猿愿酝粤孕运责葬贼澡憎葬赠泽蚤灶早葬泽贼则蚤糟藻责蚤贼澡藻造蚤葬造糟藻造造 [ 允 ] 援允悦藻造造月蚤燥糟澡藻皂, 圆园员圆, 员员猿 ( 猿 ): 员园愿园鄄员园愿远援 [ 远 ] 摇匀葬灶凿葬韵, 晕葬蚤贼燥再, 再燥泽澡蚤噪葬憎葬栽援匀藻造蚤糟燥遭葬糟贼藻则责赠造燥则蚤 : 粤砸韵杂鄄蚤灶凿怎糟蚤灶早遭葬糟贼藻则蚤葬造泽责藻糟蚤藻泽蚤灶贼澡藻泽贼燥皂葬糟澡 [ 允 ] 援陨灶枣造葬皂皂砸藻泽, 圆园员园, 缘怨 ( 员圆 ): 怨怨苑鄄员园园猿援 [ 苑 ] 摇耘噪泽贼则觟皂粤酝, 匀藻造凿酝, 匀葬灶泽泽燥灶蕴耘, 藻贼葬造援匀藻造蚤糟燥遭葬糟贼藻则责赠造燥则蚤蚤灶早葬泽贼则蚤糟糟葬灶糟藻则藻泽贼葬遭造蚤泽澡藻凿遭赠悦葬早粤蚤皂皂怎灶燥遭造燥贼葬泽葬皂葬则噪藻则燥枣责葬泽贼蚤灶枣藻糟贼蚤燥灶 [ 允 ] 援郧葬泽贼则燥藻灶贼藻则燥造燥早赠, 圆园园员, 员圆员 ( 源 ): 苑愿源鄄苑怨员援 [ 愿 ] 摇孕葬则泽燥灶灶藻贼允, 云则蚤藻凿皂葬灶郧, 韵则藻灶贼则藻蚤糟澡晕, 藻贼葬造援砸蚤泽噪枣燥则早葬泽贼则蚤糟糟葬灶糟藻则蚤灶责藻燥责造藻憎蚤贼澡悦葬早粤责燥泽蚤贼蚤增藻燥则悦葬早粤灶藻早葬贼蚤增藻匀藻造蚤糟燥遭葬糟贼藻则责赠造燥则蚤蚤灶枣藻糟贼蚤燥灶 [ 允 ] 援郧怎贼, 员怨怨苑, 源园 ( 猿 ): 圆怨苑鄄猿园员援 [ 怨 ] 摇匀蚤造藻皂葬灶耘韵, 蕴蚤怎允, 粤造遭蚤贼葬则酝, 藻贼葬造援陨灶贼则蚤灶泽蚤糟燥曾蚤凿葬贼蚤增藻泽贼则藻泽泽蚤灶糟葬灶糟藻则糟藻造造泽 : 粤遭蚤燥糟澡藻皂蚤糟葬造遭葬泽蚤泽枣燥则贼澡藻则葬责藻怎贼蚤糟泽藻造藻糟贼蚤增蚤贼赠 [ 允 ] 援悦葬灶糟藻则悦澡藻皂燥贼澡孕澡葬则皂, 圆园园源, 缘猿 ( 猿 ): 圆园怨鄄圆员怨援 [ 员园 ] 酝怎造造蚤早澡葬灶悦郧援栽耘栽圆皂怎贼葬贼蚤燥灶泽蚤灶皂赠藻造燥凿赠泽责造葬泽蚤葬葬灶凿皂赠藻造燥蚤凿皂葬鄄造蚤早灶葬灶糟蚤藻泽 [ 允 ] 援晕葬贼郧藻灶藻贼, 圆园园怨, 源员 ( 苑 ): 苑远远鄄苑远苑援 [ 员员 ] 运蚤皂再匀, 孕蚤藻则泽糟蚤葬灶藻噪阅, 酝蚤贼贼藻造遭则燥灶灶酝, 藻贼葬造援栽耘栽圆责则燥皂燥贼藻则皂藻贼澡赠造葬贼蚤燥灶蚤灶造燥憎鄄早则葬凿藻凿蚤枣枣怎泽藻早造蚤燥皂葬泽造葬糟噪蚤灶早陨阅匀员辕圆皂怎贼葬贼蚤燥灶泽 [ 允 ] 援允悦造蚤灶孕葬贼澡燥造, 圆园员员, 远源 ( 员园 ): 愿缘园鄄愿缘圆援 [ 员圆 ] 陨贼燥杂澡蚤灶泽怎噪藻, 杂, 阅忆粤造藻泽泽蚤燥粤悦, 栽葬则葬灶燥增葬韵灾, 藻贼葬造援砸燥造藻燥枣栽藻贼责则燥贼藻蚤灶泽蚤灶缘皂悦贼燥缘澡皂悦糟燥灶增藻则泽蚤燥灶, 耘杂鄄糟藻造造泽藻造枣鄄则藻灶藻憎葬造葬灶凿蚤灶鄄灶藻则糟藻造造皂葬泽泽泽责藻糟蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 [ 允 ] 援晕葬贼怎则藻, 圆园员园, 源远远 ( 苑猿员园 ): 员员圆怨鄄员员猿猿援 [ 员猿 ] 运燥澡运孕, 再葬遭怎怎糟澡蚤粤, 砸葬燥杂, 藻贼葬造援栽藻贼员葬灶凿栽藻贼圆则藻早怎造葬贼藻缘鄄澡赠凿则燥曾赠皂藻贼澡赠造糟赠贼燥泽蚤灶藻责则燥凿怎糟贼蚤燥灶葬灶凿糟藻造造造蚤灶藻葬早藻泽责藻糟蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶蚤灶皂燥怎泽藻藻皂遭则赠燥灶蚤糟泽贼藻皂糟藻造造泽 [ 允 ] 援悦藻造造杂贼藻皂悦藻造造, 圆园员员, 愿 ( 圆 ): 圆园园鄄圆员猿援 [ 员源 ] 悦蚤皂皂蚤灶燥蕴, 粤遭凿藻造鄄宰葬澡葬遭韵, 蕴藻增蚤灶藻砸燥泽泽蕴, 藻贼葬造援栽耘栽枣葬皂蚤造赠责则燥贼藻蚤灶泽葬灶凿贼澡藻蚤则则燥造藻蚤灶泽贼藻皂糟藻造造凿蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬贼蚤燥灶葬灶凿贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 [ 允 ] 援悦藻造造杂贼藻皂悦藻造造, 圆园员员, 怨 ( 猿 ): 员怨猿鄄圆园源援 [ 员缘 ] 陨贼燥杂, 杂澡藻灶蕴, 阅葬蚤匝, 藻贼葬造援栽藻贼责则燥贼藻蚤灶泽糟葬灶糟燥灶增藻则贼缘鄄皂藻贼澡赠造糟赠鄄贼燥泽蚤灶藻贼燥缘鄄枣燥则皂赠造糟赠贼燥泽蚤灶藻葬灶凿缘鄄糟葬则遭燥曾赠造糟赠贼燥泽蚤灶藻 [ 允 ] 援杂糟蚤藻灶糟藻, 圆园员员, 猿猿猿 ( 远园源苑 ): 员猿园园鄄员猿园猿援 [ 员远 ] 蕴蚤在, 悦葬蚤载, 悦葬蚤悦蕴, 藻贼葬造援阅藻造藻贼蚤燥灶燥枣栽藻贼圆蚤灶皂蚤糟藻造藻葬凿泽贼燥凿赠泽鄄则藻早怎造葬贼藻凿澡藻皂葬贼燥责燥蚤藻贼蚤糟泽贼藻皂糟藻造造泽葬灶凿泽怎遭泽藻择怎藻灶贼凿藻增藻造燥责皂藻灶贼燥枣皂赠藻造燥蚤凿皂葬造蚤早灶葬灶糟蚤藻泽 [ 允 ] 援月造燥燥凿, 圆园员员, 员员愿 ( 员苑 ): 源缘园怨鄄源缘员愿援 [ 员苑 ] 运燥酝, 匀怎葬灶早再, 允葬灶噪燥憎泽噪葬粤酝, 藻贼葬造援陨皂责葬蚤则藻凿澡赠凿则燥曾赠造葬贼蚤燥灶燥枣缘鄄皂藻贼澡赠造糟赠贼燥泽蚤灶藻蚤灶皂赠藻造燥蚤凿糟葬灶糟藻则泽憎蚤贼澡皂怎贼葬灶贼栽耘栽圆 [ 允 ] 援晕葬贼怎则藻, 圆园员园, 源远愿 ( 苑猿圆缘 ): 愿猿怨鄄愿源猿援 [ 员愿 ] 孕则燥灶蚤藻则耘, 粤造皂蚤则藻悦, 酝燥噪则葬灶蚤匀, 藻贼葬造援陨灶澡蚤遭蚤贼蚤燥灶燥枣栽耘栽圆鄄皂藻凿蚤葬鄄贼藻凿糟燥灶增藻则泽蚤燥灶燥枣缘鄄皂藻贼澡赠造糟赠贼燥泽蚤灶藻贼燥缘鄄澡赠凿则燥曾赠皂藻贼澡赠造糟赠贼燥泽蚤灶藻凿蚤泽鄄贼怎则遭泽藻则赠贼澡则燥蚤凿葬灶凿早则葬灶怎造燥皂燥灶燥糟赠贼蚤糟凿蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬贼蚤燥灶燥枣澡怎皂葬灶澡藻皂鄄葬贼燥责燥蚤藻贼蚤糟责则燥早藻灶蚤贼燥则泽 [ 允 ] 援月造燥燥凿, 圆园员员, 员员愿 ( 怨 ): 圆缘缘员鄄圆缘缘缘援 [ 员怨 ] 阅藻造澡燥皂皂藻葬怎云, 阅怎责燥灶贼杂, 灾葬造造藻灾阅, 藻贼葬造援酝怎贼葬贼蚤燥灶蚤灶栽耘栽圆蚤灶皂赠藻造燥蚤凿糟葬灶糟藻则泽 [ 允 ] 援晕藻憎耘灶早造酝藻凿, 圆园园怨, 猿远园 ( 圆圆 ): 圆圆愿怨鄄圆猿园员援 [ 圆园 ] 蕴葬灶早藻皂藻蚤躁藻则杂酝悦, 运怎蚤责藻则砸孕, 月藻则藻灶凿泽酝, 藻贼葬造援粤糟择怎蚤则藻凿皂怎贼葬鄄贼蚤燥灶泽蚤灶栽耘栽圆葬则藻糟燥皂皂燥灶蚤灶皂赠藻造燥凿赠泽责造葬泽贼蚤糟泽赠灶凿则燥皂藻泽 [ 允 ] 援晕葬贼郧藻灶藻贼, 圆园园怨, 源员 ( 苑 ): 愿猿愿鄄愿源圆援 [ 圆员 ] 月造葬泽藻则酝允, 孕藻则藻扎鄄孕藻则藻扎郧陨, 运造藻葬灶贼澡燥怎泽匀, 藻贼葬造援陨灶枣藻糟贼蚤燥灶憎蚤贼澡匀藻造蚤糟燥遭葬糟贼藻则责赠造燥则蚤泽贼则葬蚤灶泽责燥泽泽藻泽泽蚤灶早糟葬早粤蚤泽葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿憎蚤贼澡葬灶蚤灶糟则藻葬泽藻凿则蚤泽噪燥枣凿藻增藻造燥责蚤灶早葬凿藻灶燥糟葬则糟蚤灶燥皂葬燥枣贼澡藻泽贼燥皂葬糟澡 [ 允 ] 援悦葬灶糟藻则砸藻泽, 员怨怨缘, 缘缘 ( 员园 ): 圆员员员鄄圆员员缘援 [ 圆圆 ] 匀蚤早葬泽澡蚤匀, 栽泽怎贼泽怎皂蚤砸, 酝怎贼燥杂, 藻贼葬造援杂匀孕鄄圆贼赠则燥泽蚤灶藻责澡燥泽责澡葬鄄贼葬泽藻葬泽葬灶蚤灶贼则葬糟藻造造怎造葬则贼葬则早藻贼燥枣匀藻造蚤糟燥遭葬糟贼藻则责赠造燥则蚤悦葬早粤责则燥贼藻蚤灶 [ 允 ] 援杂糟蚤藻灶糟藻, 圆园园圆, 圆怨缘 ( 缘缘缘缘 ): 远愿猿鄄远愿远援 [ 圆猿 ] 宰蚤造造蚤葬皂泽运, 悦澡则蚤泽贼藻灶泽藻灶允, 匀藻造蚤灶运援阅晕粤皂藻贼澡赠造葬贼蚤燥灶 : 栽耘栽责则燥鄄贼藻蚤灶泽鄄早怎葬则凿蚤葬灶泽燥枣悦责郧蚤泽造葬灶凿泽?[ 允 ] 援耘酝月韵则藻责燥则贼泽, 圆园员员, 员猿 ( 员 ): 圆愿鄄猿缘援 [ 圆源 ] 云燥则皂葬灶阅, 晕藻憎藻造造阅, 云怎造造藻则贼燥灶云, 藻贼葬造援粤泽泽燥糟蚤葬贼蚤燥灶遭藻贼憎藻藻灶蚤灶枣藻糟贼蚤燥灶憎蚤贼澡匀藻造蚤糟燥遭葬糟贼藻则责赠造燥则蚤葬灶凿则蚤泽噪燥枣早葬泽贼则蚤糟糟葬灶糟藻则 : 耘增蚤鄄凿藻灶糟藻枣则燥皂葬责则燥泽责藻糟贼蚤增藻蚤灶增藻泽贼蚤早葬贼蚤燥灶 [ 允 ] 援月则蚤贼酝藻凿允, 员怨怨员, 猿园圆 ( 远苑愿愿 ): 员猿园圆鄄员猿园缘援 [ 圆缘 ] 云燥曾允郧, 宰葬灶早栽悦援陨灶枣造葬皂皂葬贼蚤燥灶, 葬贼则燥责澡赠, 葬灶凿早葬泽贼则蚤糟糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援允悦造蚤灶陨灶增藻泽贼, 圆园园苑, 员员苑 ( 员 ): 远园鄄远怨援 [ 圆远 ] 郧怎蚤造枣燥则凿孕, 匀燥责噪蚤灶泽允, 匀葬则则葬憎葬赠允, 藻贼葬造援耘鄄糟葬凿澡藻则蚤灶早藻则皂造蚤灶藻皂怎贼葬贼蚤燥灶泽蚤灶枣葬皂蚤造蚤葬造早葬泽贼则蚤糟糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援晕葬贼怎则藻, 员怨怨愿, 猿怨圆 ( 远远苑源 ): 源园圆鄄源园缘援 [ 圆苑 ] 运澡葬灶扎燥凿藻杂杂, 运澡葬灶扎燥凿藻杂阅, 阅葬噪澡葬造藻郧晕援杂藻则怎皂葬灶凿责造葬泽皂葬糟燥灶鄄糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶燥枣燥曾蚤凿葬灶贼葬灶凿葬灶贼蚤燥曾蚤凿葬灶贼泽蚤灶责葬贼蚤藻灶贼泽燥枣匀藻造蚤糟燥遭葬糟贼藻则责赠造燥则蚤早葬泽贼则蚤贼蚤泽葬灶凿蚤贼泽糟燥则则藻造葬贼蚤燥灶憎蚤贼澡早葬泽贼则蚤糟糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援悦葬灶糟藻则蕴藻贼贼, 圆园园猿, 员怨缘 ( 员 ): 圆苑鄄猿员援 [ 圆愿 ] 酝葬藻凿葬运, 悦澡怎灶早再, 韵早葬憎葬再, 藻贼葬造援孕则燥早灶燥泽贼蚤糟增葬造怎藻燥枣增葬泽糟怎造葬则藻灶凿燥贼澡藻造蚤葬造早则燥憎贼澡枣葬糟贼燥则藻曾责则藻泽泽蚤燥灶蚤灶早葬泽贼则蚤糟糟葬则糟蚤灶燥皂葬 [ 允 ] 援悦葬灶糟藻则, 员怨怨远, 苑苑 ( 缘 ): 愿缘愿鄄愿远猿援 [ 圆怨 ] 韵澡允阅, 运葬则葬皂杂酝, 郧燥则凿燥灶允陨援陨灶贼则葬糟藻造造怎造葬则匀藻造蚤糟燥遭葬糟贼藻则责赠造燥则蚤蚤灶早葬泽贼则蚤糟藻责蚤贼澡藻造蚤葬造责则燥早藻灶蚤贼燥则泽 [ 允 ] 援孕则燥糟晕葬贼造粤糟葬凿杂糟蚤哉杂粤, 圆园园缘, 员园圆 ( 员源 ): 缘员愿远鄄缘员怨员援 [ 猿园 ] 韵灶燥匀, 运燥灶凿燥匀, 郧燥贼燥凿葬栽, 藻贼葬造援耘灶凿燥泽糟燥责蚤糟皂怎糟燥泽葬造则藻泽藻糟贼蚤燥灶枣燥则贼则藻葬贼皂藻灶贼燥枣藻葬则造赠早葬泽贼则蚤糟糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援郧怎贼, 圆园园员, 源愿 ( 圆 ): 圆圆缘鄄圆圆怨援 [ 猿员 ] 杂怎扎怎噪蚤匀, 酝燥则蚤酝, 杂藻贼燥运, 藻贼葬造援孕燥造葬责则藻扎蚤灶糟葬贼贼藻灶怎葬贼藻泽贼澡藻匀藻造蚤鄄糟燥遭葬糟贼藻则责赠造燥则蚤鄄蚤灶凿怎糟藻凿早葬泽贼则蚤糟皂怎糟燥泽葬造造藻怎糟燥糟赠贼藻葬糟贼蚤增葬贼蚤燥灶蚤灶皂燥灶鄄早燥造蚤葬灶早藻则遭蚤造泽鄄葬泽贼怎凿赠怎泽蚤灶早蚤灶贼则葬增蚤贼葬造增蚤凿藻燥皂蚤糟则燥泽糟燥责赠 [ 允 ] 援粤造蚤鄄皂藻灶贼孕澡葬则皂栽澡藻则葬责, 圆园园圆, 员缘 ( 缘 ): 苑员缘鄄苑圆缘援 [ 收稿日期 ] 摇圆园员猿原园员原园缘 [ 修回日期 ] 摇圆园员猿原园猿原员园 [ 本文编辑 ] 摇王莹, 黄静怡