猿猿圆 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园员缘年远月, 圆圆 ( 猿 ) [ 运藻赠憎燥则凿泽 ] 摇允粤运鄄杂栽粤栽泽蚤早灶葬造责葬贼澡憎葬赠 ; 杂栽粤栽猿 ; 则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则 ; 蚤灶增葬泽蚤燥灶 ; 皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽 ; 责则燥造蚤枣藻则葬贼蚤燥灶 [ 悦澡蚤灶允悦葬灶糟藻则月蚤燥贼

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1 中国肿瘤生物治疗杂志摇澡贼贼责 : 辕辕憎憎憎援遭蚤燥贼澡藻则援燥则早悦澡蚤灶允悦葬灶糟藻则月蚤燥贼澡藻则, 允怎灶圆园员缘, 灾燥造援圆圆, 晕燥援猿 猿猿员 凿燥蚤 : 员园援猿愿苑圆辕躁援蚤泽泽灶援员园园苑鄄猿愿缘载援圆园员缘援园猿援园园怨 临床研究 允粤运鄄杂栽粤栽信号通路与人直肠癌发生发展的关系 蔡勋全, 潘勤聪, 沈强, 陈凤媛, 袁胜忠 ( 上海市第五人民医院消化科, 上海圆园园园源园 ) [ 摘摇要 ] 摇目的 : 探究正常直肠组织和直肠癌组织中允粤运鄄杂栽粤栽信号通路重要成员以及通路下游重要蛋白的表达变化情况及其临床意义, 并通过体外实验观察杂栽粤栽猿对直肠癌细胞侵袭 转移以及增殖的影响 方法 : 收集圆园员猿年缘月员日至圆园员源年缘月员日在本院行手术切除并经病理证实为直肠癌患者的癌组织和非直肠癌 ( 痔疮 肛瘘肛裂 结肠炎 肠息肉等 ) 患者正常直肠组织各缘园份, 采用宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早法检测组织中杂栽粤栽猿 责鄄杂栽粤栽猿及允粤运鄄杂栽粤栽信号通路下游悦赠糟造蚤灶阅员 月糟造圆的表达, 分析杂栽粤栽猿蛋白表达与直肠癌临床病理特征关系 以慢病毒介导的杂栽粤栽猿鄄泽澡砸晕粤转染直肠癌细胞悦燥造燥猿圆园, 采用酝栽栽法和栽则葬灶泽憎藻造造侵袭和迁移实验检测泽澡鄄砸晕粤干扰杂栽粤栽猿表达对直肠癌悦燥造燥猿圆细胞增殖 侵袭和转移的影响 结果 : 与正常组织相比, 直肠癌组织中杂栽粤栽猿蛋白的表达显著升高 ( 孕约园援园员 ), 责鄄杂栽粤栽猿 悦赠糟造蚤灶阅员和月糟造圆蛋白的表达也明显高于正常直肠组织 ( 孕约园援园缘 ); 杂栽粤栽猿蛋白表达水平与直肠癌分化程度 淋巴转移有关 ( 孕约园援园缘 ), 而与肿瘤大小无关 ( 孕跃园援园缘 ) 慢病毒介导的泽澡砸晕粤转染悦燥造燥猿圆园细胞可有效抑制其杂栽粤栽猿和责鄄杂栽粤栽猿表达, 沉默杂栽粤栽猿后悦燥造燥猿圆园细胞的增殖和侵袭转移能力显著下降 ( 孕约园援园缘 ) 结论 : 杂栽粤栽猿能通过影响允粤运鄄杂栽粤栽信号通路下游重要蛋白的表达, 促进直肠癌的增殖 侵袭和转移, 研究结果为直肠癌的防治提供潜在的新靶点 [ 关键词 ] 摇允粤运鄄杂栽粤栽信号通路 ; 杂栽粤栽猿 ; 直肠癌 ; 侵袭 ; 转移 ; 增殖 [ 中图分类号 ] 摇砸苑猿缘援猿 ; 砸苑猿园援圆摇摇摇摇 [ 文献标志码 ] 摇粤摇摇摇摇 [ 文章编号 ] 摇员园园苑鄄猿愿缘载 ( 圆园员缘 ) 园猿鄄园猿猿员鄄园远 悦燥则则藻造葬贼蚤燥灶遭藻贼憎藻藻灶允粤运鄄杂栽粤栽泽蚤早灶葬造责葬贼澡憎葬赠葬灶凿贼澡藻凿藻增藻造燥责皂藻灶贼燥枣澡怎皂葬灶则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则 悦葬蚤载怎灶择怎葬灶, 孕葬灶匝蚤灶糟燥灶早, 杂澡藻灶匝蚤葬灶早, 悦澡藻灶云藻灶早赠怎葬灶, 再怎葬灶杂澡藻灶早扎澡燥灶早 ( 阅藻责葬则贼皂藻灶贼燥枣郧葬泽贼则燥藻灶贼藻则燥造燥早赠, 杂澡葬灶早澡葬蚤云蚤枣贼澡孕藻燥责造藻 泽匀燥泽责蚤贼葬造, 杂澡葬灶早澡葬蚤圆园园园源园, 悦澡蚤灶葬 ) [ 粤遭泽贼则葬糟贼 ] 摇韵遭躁藻糟贼蚤增藻 : 栽燥泽贼怎凿赠贼澡藻责燥泽泽蚤遭造藻则燥造藻枣燥则贼澡藻允粤运鄄杂栽粤栽泽蚤早灶葬造蚤灶早责葬贼澡憎葬赠蚤灶贼澡藻责葬贼澡燥早藻灶藻泽蚤泽燥枣则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则援酝藻贼澡燥凿泽 : 悦葬灶糟藻则燥怎泽葬灶凿灶燥灶鄄糟葬灶糟藻则燥怎泽 ( 糟燥灶贼则燥造 ) 贼蚤泽泽怎藻泽责藻糟蚤皂藻灶泽憎藻则藻糟燥造造藻糟贼藻凿葬贼泽怎则早蚤糟葬造则藻泽藻糟贼蚤燥灶枣则燥皂缘园则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则责葬贼蚤藻灶贼泽葬灶凿缘园灶燥灶鄄则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则责葬贼蚤藻灶贼泽, 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠, 憎澡燥憎藻则藻葬凿皂蚤贼贼藻凿贼燥燥怎则澡燥泽责蚤贼葬造遭藻贼憎藻藻灶酝葬赠, 圆园员猿葬灶凿酝葬赠, 圆园员源援蕴藻增藻造泽燥枣杂栽粤栽猿, 责鄄杂栽粤栽猿葬灶凿贼澡藻贼憎燥皂葬躁燥则责则燥贼藻蚤灶皂燥造藻糟怎造藻泽, 糟赠糟造蚤灶阅员葬灶凿月糟造圆, 凿燥憎灶泽贼则藻葬皂燥枣贼澡藻允粤运鄄杂栽粤栽泽蚤早灶葬造责葬贼澡憎葬赠蚤灶贼澡藻泽藻糟造蚤灶蚤糟葬造泽责藻糟蚤皂藻灶泽憎藻则藻葬泽泽藻泽泽藻凿遭赠宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早葬灶葬造赠泽蚤泽葬灶凿憎藻则藻葬灶葬造赠扎藻凿泽贼葬贼蚤泽贼蚤糟葬造造赠枣燥则贼澡藻蚤则糟燥则则藻造葬贼蚤燥灶泽憎蚤贼澡贼澡藻糟造蚤灶蚤糟葬造责葬贼澡燥造燥早蚤糟葬造枣藻葬贼怎则藻泽燥枣贼澡藻责葬贼蚤藻灶贼泽援栽燥枣怎则贼澡藻则藻增葬造怎葬贼藻贼澡藻蚤灶枣造怎藻灶糟藻燥枣杂栽粤栽猿燥灶则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则糟藻造造早则燥憎贼澡, 贼澡藻责则燥造蚤枣藻则葬贼蚤增藻葬糟贼蚤增蚤贼赠葬灶凿蚤灶增葬泽蚤燥灶葬遭蚤造蚤贼赠燥枣糟燥造燥灶蚤糟糟葬则糟蚤灶燥皂葬悦燥造燥猿圆园糟藻造造泽葬枣贼藻则泽蚤砸晕粤鄄皂藻凿蚤葬贼藻凿泽蚤造藻灶糟蚤灶早燥枣贼澡藻杂栽粤栽猿早藻灶藻憎葬泽葬泽泽藻泽泽藻凿遭赠酝栽栽栽则葬灶泽憎藻造造皂蚤早则葬贼蚤燥灶葬泽泽葬赠泽, 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援砸藻泽怎造贼泽 : 蕴藻增藻造泽燥枣杂栽粤栽猿憎藻则藻泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠澡蚤早澡藻则蚤灶则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则泽责藻糟蚤皂藻灶泽贼澡葬灶蚤灶灶燥灶鄄糟葬灶糟藻则燥怎泽糟燥灶贼则燥造泽责藻糟蚤皂藻灶泽 ( 孕约园郾园员 ), 泽燥憎藻则藻造藻增藻造泽燥枣责鄄杂栽粤栽猿, 糟赠糟造蚤灶阅员葬灶凿月糟造圆 ( 孕约园援园缘 ) 援杂栽粤栽猿责则燥贼藻蚤灶造藻增藻造泽蚤灶糟葬灶糟藻则燥怎泽泽责藻糟蚤皂藻灶泽憎藻则藻泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠糟燥则则藻造葬贼藻凿憎蚤贼澡贼澡藻凿蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬贼蚤燥灶凿藻早则藻藻葬灶凿造赠皂责澡葬贼蚤糟皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽燥枣则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则 ( 孕约园援园缘 ), 遭怎贼灶燥贼憎蚤贼澡贼澡藻贼怎皂燥则泽蚤扎藻 ( 孕跃园援园缘 ) 援杂栽粤栽猿泽蚤造藻灶糟蚤灶早则藻泽怎造贼藻凿蚤灶泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼凿藻糟则藻葬泽藻泽蚤灶悦燥造燥猿圆园糟藻造造责则燥造蚤枣藻则葬贼蚤燥灶, 蚤灶增葬泽蚤燥灶葬灶凿皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽 ( 孕约园援园缘 ) 援悦燥灶糟造怎泽蚤燥灶 : 杂栽粤栽猿蚤泽蚤灶增燥造增藻凿蚤灶贼澡藻责则燥造蚤枣藻则葬贼蚤燥灶, 蚤灶增葬泽蚤燥灶葬灶凿皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽燥枣糟燥造燥则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则贼澡则燥怎早澡葬允粤运鄄杂栽粤栽泽蚤早灶葬造蚤灶早鄄凿藻责藻灶凿藻灶贼皂藻糟澡葬灶蚤泽皂葬灶凿贼澡怎泽皂葬赠泽藻则增藻葬泽葬责燥贼藻灶贼蚤葬造贼澡藻则葬责藻怎贼蚤糟贼葬则早藻贼枣燥则糟燥造燥则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则援 [ 作者简介 ] 摇蔡勋全 ( 员怨愿园原 ), 男, 上海市人, 博士生, 主治医师, 主要从事消化道肿瘤的基础与临床研究, 耘鄄皂葬蚤造 : 糟葬蚤曾怎灶择怎葬灶园员岳员圆远援糟燥皂 [ 通信作者 ] 摇潘勤聪 ( 孕葬灶匝蚤灶糟燥灶早, 糟燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早葬怎贼澡燥则 ), 耘鄄皂葬蚤造 : 责葬灶择蚤灶糟燥灶早岳员远猿援糟燥皂 [ 优先发表 ] 摇澡贼贼责 : 辕辕憎憎憎援糟灶噪蚤援灶藻贼辕噪糟皂泽辕凿藻贼葬蚤造辕猿员援员苑圆缘援砸援圆园员缘园远员缘援员远猿缘援园园远援澡贼皂造

2 猿猿圆 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园员缘年远月, 圆圆 ( 猿 ) [ 运藻赠憎燥则凿泽 ] 摇允粤运鄄杂栽粤栽泽蚤早灶葬造责葬贼澡憎葬赠 ; 杂栽粤栽猿 ; 则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则 ; 蚤灶增葬泽蚤燥灶 ; 皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽 ; 责则燥造蚤枣藻则葬贼蚤燥灶 [ 悦澡蚤灶允悦葬灶糟藻则月蚤燥贼澡藻则, 圆园员缘, 圆圆 ( 猿 ): 猿猿员鄄猿猿远 ] 摇摇 摇摇直肠癌因其位置深入盆腔, 解剖关系复杂, 手术 [ 员不易彻底, 术后复发率较高 ] 我国直肠癌发病年龄中位数在源缘岁左右, 青年人发病率有升高的趋 [ 圆势 ] 目前认为, 直肠癌的病因是动物脂肪和蛋白 [ 猿质摄入过高 食物纤维摄入不足 ] 对直肠癌的信号通路的研究有助于加强对直肠癌发生机制的认识, 也可为直肠癌的防治提供新靶点 允粤运鄄杂栽粤栽信号通路是近年来发现的一条参与细胞的增殖 分化 凋亡等许多重要生物学过程的信 [ 源号转导通路 ], 其主要由酪氨酸激酶相关受体 酪氨酸激酶允粤运和转录因子杂栽粤栽三个成分组成 信号通路的激活主要是配体与受体结合导致受体二聚化, 二聚化受体激活允粤运, 允粤运将杂栽粤栽磷酸化, 杂栽粤栽形成二聚体, 暴露出入核信号, 杂栽粤栽进入核 [ 缘内, 调节基因表达 ] [ 远 ] 研究发现, 杂栽粤栽猿在人体结直肠癌组织和细胞系中异常活化, 因此, 本课题主要探讨直肠癌发生过程中允粤运鄄杂栽粤栽信号通路发挥的调控作用, 旨在为临床上直肠癌的防治提供新的靶点 员摇 员援员摇 材料与方法 研究对象和标本来源 收集圆园员猿年缘月员日至圆园员源年缘月员日本院收治并经病理确诊为直肠癌患者缘园例作为实验组 ( 分别在手术中钳取距癌灶边缘圆耀耀耀缘糟皂处的肿瘤组织 ), 其中男性猿园例 女性圆园例, 平均年龄 ( 源园援圆猿依圆援缘猿 ) 岁 ; 直肠癌患者标本栽员期源例, 栽圆 期员猿例, 栽猿期猿猿例 ; 晕园期圆源例, 晕员期员猿例, 晕圆 期员猿例 ; 酝园期源源例, 酝员期远例 同时收集非直肠癌 ( 痔疮 肛瘘肛裂 结肠炎 肠息肉等 ) 患者缘园例作为对照组 ( 肛肠镜检查和活检时钳取距病灶边缘 圆耀耀耀缘糟皂处的正常组织 ), 其中男性圆愿例 女性圆圆 例, 平均年龄 ( 源员援源依员援源圆 ) 岁 所有患者在直肠镜检查前均未进行放 化疗, 手术 ( 实验组 ) 或直肠镜检查 ( 对照组 ) 时立即取材, 标本经常规处理后, 一部分进行病理组织学观察, 一部分冻存于原愿园益保存待用 本研究经本院伦理委员会批准 ( 圆园员猿鄄园源鄄园远 ), 家属或患者签署知情同意书 员援圆摇 细胞株和主要实验材料 人直肠癌悦燥造燥猿圆园细胞株购自上海拜力生物科技有限公司, 以员园豫云月杂的砸陨酝孕员远源园培养基于 缘豫悦韵圆 猿苑益正常培养, 每猿凿换液员次, 员周员颐猿 传代员次 杂阅杂鄄孕粤郧耘上样缓冲液 月悦粤试剂盒 酝栽栽试剂盒均购自上海博谷生物科技有限公司, 杂栽粤栽猿抗体 责鄄杂栽粤栽猿抗体 悦赠糟造蚤灶阅员抗体 月糟造圆抗体均购自悦藻造造杂蚤早灶葬造蚤灶早栽藻糟澡灶燥造燥早赠 ( 悦杂栽 ) 公司, 栽则葬灶鄄泽憎藻造造培养皿购于悦燥则灶蚤灶早公司 员援猿摇宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早检测癌组织和正常组织中杂栽粤栽猿 责鄄杂栽粤栽猿 悦赠糟造蚤灶阅员 月糟造圆的表达采用月悦粤工作液对样品组织匀浆进行定量, 在样品中加入杂阅杂鄄孕粤郧耘上样缓冲液 沸水浴中猿皂蚤灶后上样, 电泳 电转仪转膜怨园皂蚤灶 用缘豫脱脂牛奶封闭, 随后于摇床上孵育一抗员澡, 洗膜猿次, 缘皂蚤灶辕次 ; 孵育二抗圆澡, 洗膜猿次, 员园皂蚤灶辕次 用自 [ 苑动显影仪显影, 并分析条带灰度 ] 细胞实验重复猿次, 组织样本全部测定 员援源摇杂栽粤栽猿鄄泽澡砸晕粤慢病毒构建与病毒滴定靶向人杂栽粤栽猿鄄泽澡砸晕粤引物序列为云 : 缘忆鄄栽郧悦粤郧鄄悦粤郧悦栽郧粤粤悦粤粤悦粤栽郧栽栽鄄悦粤粤郧粤郧粤悦粤栽郧栽栽郧栽栽悦粤郧悦栽郧悦栽郧悦栽栽栽栽栽栽悦鄄猿忆, 砸 : 缘忆鄄栽悦郧粤郧粤粤粤粤粤粤鄄郧悦粤郧鄄悦粤郧悦栽郧粤粤悦粤粤悦粤栽郧栽悦栽悦栽栽郧粤粤悦粤栽郧栽栽郧栽栽悦粤郧悦栽郧悦栽郧悦粤鄄猿忆 孕悦砸扩增 : 将员员 μ 造双蒸水 员圆援缘 μ 造孕悦砸酝葬泽贼藻则 员 μ 造正向引物 员 μ 造反向引物 员 μ 造阅晕粤模板混匀后加入孕悦砸管中 放入孕悦砸仪, 设定变性 退火 延伸温度和时间, 分别为 :( 员 ) 怨缘益猿园园泽 ;( 圆 ) 怨缘益猿园泽 ;( 猿 ) 缘愿益猿园泽 ;( 源 ) 苑圆益猿园 ( 泽圆至源步骤, 猿缘循环 );( 缘 ) 苑圆益猿园泽 ;( 远 ) 源益员园园园泽 载澡燥 Ⅰ 和匀责葬 Ⅰ 双酶切责杂蚤糟燥砸载体, 在栽源阅晕粤连接酶的作用下与孕悦砸退火产物连接, 构建重组质粒, 转化感受态大肠杆菌阅匀缘 α, 筛选阳性克隆, 提取质粒, 双酶切鉴定阳性质粒并送测序, 测序鉴定重组质粒责杂蚤糟燥砸鄄杂栽粤栽猿鄄泽澡砸晕粤 把包装了责杂蚤糟燥砸鄄杂栽粤栽猿鄄泽澡砸晕粤 ( 员园 μ 早 ) 责酝阅蕴早辕责砸砸耘 ( 远援缘猿 μ 早 ) 责砸杂灾鄄砸耘灾 ( 圆援猿圆 μ 早 ) 责酝阅圆郧 ( 猿援缘缘 μ 早 ) 和员园园 μ 造无血清无双抗的阅酝耘酝于圆缘园 μ 造耘责管内轻柔漩涡混匀, 再加入远苑援圆 μ 造载鄄贼则藻皂藻郧耘晕耘匀孕阅晕粤栽则葬灶泽枣藻糟贼蚤燥灶砸藻葬早藻灶贼, 混匀后加入对数培养匀耘运圆怨猿细胞培养苑圆澡 猿缘园园伊早离心, 收集细胞上清液, 园援源缘 μ 皂滤膜过滤后, 然后远园园园伊早离心圆援缘澡, 并用孕月杂重悬, 病毒滴定后于原愿园益保存备用 员援缘摇慢病毒介导泽澡鄄砸晕粤干扰杂栽粤栽猿在悦燥造燥猿圆园结肠癌细胞中的表达杂栽粤栽猿鄄泽澡砸晕粤慢病毒转染按照说明书进行 悦燥造燥猿圆园细胞置于无血清培养基与缘园 员园园 圆园园酝韵陨

3 蔡勋全, 等援允粤运鄄杂栽粤栽信号通路与人直肠癌发生发展的关系 杂栽粤栽猿鄄泽澡砸晕粤共孵育远澡, 弃掉培养基, 加入含员园豫云月杂的砸陨酝孕员远源园继续培养源愿澡, 转染后细胞用与 宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早和栽则葬灶泽憎藻造造糟澡葬皂遭藻则检测 员援远摇宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早方法检测慢病毒杂栽粤栽猿鄄泽澡砸鄄晕粤感染后悦燥造燥猿圆园细胞杂栽粤栽猿的表达 收集转染后细胞并提取蛋白, 采用月悦粤工作液对样品进行定量, 在样品中加入上样缓冲液 沸水浴中猿皂蚤灶后上样, 电泳 电转仪转膜, 用缘豫脱脂牛奶封闭, 随后于摇床上孵育一抗员澡, 洗膜猿次, 缘皂蚤灶辕次, 孵育二抗圆澡, 洗膜猿次, 员园皂蚤灶辕次 用自动显影仪显影, 并分析条带灰度进行定量 员援苑摇酝栽栽法检测沉默杂栽粤栽猿表达对悦燥造燥猿圆园细胞增殖的影响 收集对数期细胞, 调整细胞悬液浓度, 每孔加入 员园园 μ 造, 铺板, 使待测细胞密度为员园园园耀耀耀员园园园园个辕 孔 ; 缘豫悦韵圆 猿苑益孵育, 至细胞单层铺满孔底 ( 怨远 孔平底板 ), 加入浓度梯度的药物, 在缘豫悦韵圆 猿苑益 条件下孵育源愿澡, 每孔加入圆园 μ 造酝栽栽溶液 ( 缘皂早辕皂造, 即园援缘豫酝栽栽 ), 继续培养源澡 终止培养, 吸去孔内培养液, 加入阅酝杂韵员缘缘 μ 造辕孔, 待结晶充分溶解后, 酶标仪检测缘苑园灶皂波长处各孔的光密度 ( 阅 ) [ 愿值 ] 细胞存活率( 豫 ) 越 ( 实验组阅值辕对照组阅 值 ) 伊员园园豫 做标准曲线孔, 根据样品阅值和标准曲线, 计算样品细胞数 实验重复猿次 员援愿摇 栽则葬灶泽憎藻造造法检测沉默杂栽粤栽猿表达对悦燥造燥猿圆园 细胞侵袭和转移能力的影响 酝葬贼则蚤早藻造胶预冷为液态, 在冰上将无血清培养基与酝葬贼则蚤早藻造胶员颐愿混合, 混匀后每孔加入栽则葬灶泽憎藻造造 小室中, 在室温下风干缘澡 每孔加入员园园 μ 造无血清培养基水化基底膜, 猿苑益温箱中放置猿园皂蚤灶 调缘整细胞密度为圆援缘伊员园个辕皂造, 取圆园园 μ 造加入小室内, 底部培养室内加入缘园园 μ 造含圆园豫云月杂的高糖完全培养基 在猿苑益 缘豫悦韵圆条件培养猿远皂蚤灶 弃小室内液体, 用棉棒擦掉小室底部内面细胞, 将小室侵入怨缘豫乙醇固定缘皂蚤灶, 加入源早辕蕴结晶紫圆园园 μ 造染色员园皂蚤灶 以每个视野的平均细胞数表示肿 [ 怨瘤细胞的侵袭能力 ] 实验重复猿次 员援怨摇 统计学处理 采用杂孕杂杂员苑援园统计软件, 计数数据以百分率表示, 计量数据以珋曾依泽表示, 样本间率的比较以及 圆晕园 晕员 晕圆三组间与杂栽粤栽猿表达量的比较采用 χ 检验, 对杂栽粤栽猿 责鄄杂栽粤栽猿 悦赠糟造蚤灶阅员 月糟造圆蛋白量的比较采用单因素方差分析, 细胞侵袭率之间的比较采用独立贼检验或者单因素方差分析 以孕约园援园缘 或孕约园援园员表示差异有统计学意义 猿猿猿 圆摇结摇果圆援员摇责鄄杂栽粤栽猿 悦赠糟造蚤灶阅员 月糟造圆蛋白在直肠癌组织高表达宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早检测结果 ( 图员, 表员 ) 显示, 与正常组织相比, 直肠癌组责鄄杂栽粤栽猿蛋白表达水平显著升高 ( 孕约园援园员 ), 悦赠糟造蚤灶阅员蛋白表达水平也明显升高 ( 孕约园援园缘 ), 而月糟造圆表达水平却显著降低 ( 孕约园援园缘 ) 图员摇直肠癌组织和正常直肠组织中责鄄杂栽粤栽猿 悦赠糟造蚤灶阅员 月糟造圆的表达情况云蚤早援员摇耘曾责则藻泽泽蚤燥灶泽燥枣责鄄杂栽粤栽猿, 悦赠糟造蚤灶阅员葬灶凿月糟造圆蚤灶则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则贼蚤泽泽怎藻泽葬灶凿灶燥则皂葬造则藻糟贼葬造贼蚤泽泽怎藻泽粤 : 责鄄杂栽粤栽猿 ; 月 : 悦赠糟造蚤灶阅员 ; 悦 : 月糟造圆圆援圆摇责鄄杂栽粤栽猿蛋白表达与临床病理特征关系临床因素分析结果 ( 表圆 ) 表明, 与晕园组相比, 猿组分期直肠癌中晕员组 晕圆组责鄄杂栽粤栽猿蛋白的表达水平明显升高 ( 孕约园援园缘 ) 栽分期中, 责鄄杂栽粤栽猿在栽圆和栽猿期中高表达 ( 孕约园援园缘 ), 且责鄄杂栽粤栽猿与直肠癌分化程度 淋巴转移有关 ( 孕约园援园缘 ), 但与年龄, 性别 肿瘤大小和酝分期无关 ( 孕跃园援园缘 ) 圆援猿摇杂栽粤栽猿鄄泽澡砸晕粤慢病毒转染后悦燥造燥猿圆园中杂栽粤栽猿 责鄄杂栽粤栽猿的表达分别转入杂栽粤栽猿鄄泽澡砸晕粤慢病毒不同浓度缘园 员园园 圆园园酝韵陨干扰源愿澡后, 用宰藻泽贼藻则灶遭造燥贼贼蚤灶早法检测杂栽粤栽猿在悦燥造燥猿圆园的表达情况, 结果显示, 杂栽粤栽猿鄄泽澡砸晕粤慢病毒转染后, 悦燥造燥猿圆园中杂栽粤栽猿和责鄄杂栽粤栽猿

4 猿猿源 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园员缘年远月, 圆圆 ( 猿 ) 表员摇责鄄杂栽粤栽猿 悦赠糟造蚤灶阅员 月糟造圆在直肠癌组织以及正常直肠组织中的表达情况 ( 珔曾依泽 ) 栽葬遭援员摇耘曾责则藻泽泽蚤燥灶泽燥枣责鄄杂栽粤栽猿, 悦赠糟造蚤灶阅员葬灶凿月糟造圆蚤灶则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则贼蚤泽泽怎藻泽葬灶凿灶燥则皂葬造则藻糟贼葬造贼蚤泽泽怎藻泽 ( 珔曾依泽 ) 孕则燥贼藻蚤灶 栽燥贼葬造泽葬皂责造藻 孕燥泽蚤贼蚤增藻泽葬皂责造藻 晕燥则皂葬造则藻糟贼葬造贼蚤泽泽怎藻泽 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶增葬造怎藻 砸藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则贼蚤泽泽怎藻泽 孕 责鄄杂栽粤栽猿缘园源猿员员援苑园缘依园援员怨圆约园援园员 悦赠糟造蚤灶阅员缘园猿怨员圆援员圆猿依园援员圆远约园援园缘 月糟造圆缘园猿苑员园援源愿远依园援园猿圆约园援园缘 表圆摇责鄄杂栽粤栽猿蛋白表达情况与直肠癌临床病理特征的关系栽葬遭援圆摇砸藻造葬贼蚤燥灶泽澡蚤责遭藻贼憎藻藻灶责鄄杂栽粤栽猿责则燥贼藻蚤灶藻曾责则藻泽泽蚤燥灶葬灶凿糟造蚤灶蚤糟葬造责葬贼澡燥造燥早蚤糟葬造枣藻葬贼怎则藻泽蚤灶则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则贼蚤泽泽怎藻泽栽燥贼葬造泽葬皂责造藻孕燥泽蚤贼蚤增藻泽葬皂责造藻孕燥泽蚤贼蚤增藻则葬贼藻云藻葬贼怎则藻 ( 豫 ) 郧藻灶凿藻则 载圆孕 摇 酝葬造藻 猿园 圆缘 愿猿援猿 园援园苑 园援愿怨 摇 云藻皂葬造藻 圆园 员愿 怨园援园 粤早藻 ( 贼辕葬 ) 摇! 源缘 猿园 圆远 愿远援苑 园援园远 园援怨猿 摇 约源缘 圆园 员苑 愿缘 阅蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬贼蚤燥灶 摇 匀蚤早澡 员缘 员园 远远援苑 苑援猿远 园援园圆 摇 酝燥凿藻则葬贼藻 圆园 员愿 怨园援园 摇 孕燥燥则 蕴赠皂责澡葬贼蚤糟皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽 员缘 员缘 员园园援园 摇 孕燥泽蚤贼蚤增藻 源园 猿苑 怨圆援缘 员缘援缘员 园援园园 摇 晕藻早葬贼蚤增藻 栽怎皂燥则泽蚤扎藻 员园 远 远园援园 摇! 缘糟皂 圆圆 圆园 怨园援怨 员援猿猿 园援员圆 摇 约缘糟皂 栽泽贼葬早藻 圆愿 圆猿 愿圆援员 摇 栽员 源 员 圆缘援园 员远援缘缘 园援园园 摇 栽圆 员猿 员园 苑远援怨 摇 栽猿 猿猿 猿圆 怨远援苑 晕泽贼葬早藻 摇 晕园 圆源 员园 源员援苑 员圆援猿缘 园援园园 摇 晕员 员猿 员员 愿源援远 摇 晕圆 员猿 员圆 怨圆援猿 酝泽贼葬早藻 摇 酝园 源源 圆怨 远缘援怨 园援园愿 园援园苑 摇 酝员 远 源 远远援苑 表达均降低 ( 孕约园援园缘 ) 其中, 图圆粤显示, 空白对照组杂栽粤栽猿的表达量 [ 标准化后 ( 杂栽粤栽猿辕 β 鄄葬糟贼蚤灶 )] 为员 ; 阴性对照组杂栽粤栽猿表达量为 ( 园援怨远圆依园援园圆猿 ), 两者差异无统计学意义 分别转染杂栽粤栽猿鄄泽澡砸晕粤 慢病毒缘园 员园园 圆园园酝韵陨时, 与阴性对照组相比, 杂栽粤栽猿表达量明显降低 [( 园援园愿圆依园援园园怨 ) ( 园郾员圆圆依园援园员圆 ) ( 园援园远愿员依园援园园苑 ) 增泽 ( 园援怨远圆依园郾园圆猿 ), 均孕约园援园缘 ] 图圆月显示, 空白对照组

5 蔡勋全, 等援允粤运鄄杂栽粤栽信号通路与人直肠癌发生发展的关系责鄄杂栽粤栽猿的表达量 [ 标准化后 ( 责鄄杂栽粤栽猿辕 β 鄄葬糟贼蚤灶 )] 为员 ; 阴性对照组责鄄杂栽粤栽猿表达量为 ( 园援怨苑远依园援园员远 ), 两者差异无统计学意义 分别转染杂栽粤栽猿鄄泽澡砸晕粤慢病毒缘园 员园园 圆园园酝韵陨时, 与阴性对照组相比, 猿猿缘 杂栽粤栽猿表达量明显降低 [( 园援员远愿依园援园员员 ) ( 园援员源猿依园援园园怨 ) ( 园援员源愿依园援园员猿 ) 增泽 ( 园援怨苑远依园郾园员远 ), 均孕约园援园缘 ] 云蚤早援圆摇 图圆摇 杂栽粤栽猿鄄泽澡砸晕粤慢病毒转染后悦燥造燥猿圆园细胞中杂栽粤栽猿和责鄄杂栽粤栽猿的表达 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶泽燥枣杂栽粤栽猿葬灶凿责鄄杂栽粤栽猿葬枣贼藻则贼则葬灶泽枣藻糟贼蚤燥灶憎蚤贼澡杂栽粤栽猿鄄泽澡砸晕粤造藻灶贼蚤增蚤则怎泽蚤灶悦燥造燥猿圆园糟藻造造泽 圆援源摇沉默干扰杂栽粤栽猿对悦燥造燥猿圆园细胞增殖的影响酝栽栽法检测结果 ( 表猿 ) 显示, 沉默杂栽粤栽猿后, 悦燥造燥猿圆园细胞数量明显减少 ( 孕约园援园缘 ) 圆援缘摇沉默杂栽粤栽猿对悦燥造燥猿圆园细胞侵袭的影响栽则葬灶泽憎藻造造法检测结果 ( 图猿 ) 显示, 空白对照组 ( 源愿远依圆怨 ) 和阴性对照组 ( 源缘圆依猿源 ) 相比, 两者差异无统计学意义 不同浓度 ( 缘园 员园园 圆园园酝韵陨 ) 慢病毒介导泽澡鄄砸晕粤干扰杂栽粤栽猿表达组 ( 杂栽粤栽猿鄄泽澡砸晕粤组 ) 与阴性对照组相比, 细胞穿膜数明显减少 [( 圆猿苑依员猿 ) ( 员怨猿依圆缘 ) ( 圆缘员依员愿 ) 增泽 ( 源缘圆依猿源 ), 均孕约园郾园缘 ], 提示肿瘤细胞的侵袭能力降低 表猿摇 慢病毒介导泽澡鄄砸晕粤干扰杂栽粤栽猿基因 对悦燥造燥猿圆园细胞增殖的影响 ( 珔曾依泽, 豫 ) 栽葬遭援猿摇 耘枣枣藻糟贼燥枣造藻灶贼蚤增蚤则怎泽皂藻凿蚤葬贼藻凿杂栽粤栽猿鄄泽澡砸晕粤 燥灶贼澡藻责则燥造蚤枣藻则葬贼蚤燥灶燥枣悦燥造燥猿圆园糟藻造造泽 ( 珔曾依泽, 豫 ) 灾蚤则怎泽贼蚤贼藻则 ( 酝韵陨 ) 悦藻造造责则燥造蚤枣藻则葬贼蚤燥灶 ( 豫 ) 孕 悦燥灶贼则燥造 员园园援园园依园援园园 杂栽粤栽猿鄄泽澡砸晕粤缘园 愿圆援怨远依缘援员圆 园援园圆 杂栽粤栽猿鄄泽澡砸晕粤员园园 苑缘援远愿依源援园愿 园援园猿 杂栽粤栽猿鄄泽澡砸晕粤圆园园 远愿援源源依猿援员源 园援园猿 图猿摇干扰杂栽粤栽猿基因抑制悦燥造燥猿圆园细胞侵袭 ( 伊圆园园 ) 云蚤早援猿摇运灶燥糟噪凿燥憎灶杂栽粤栽猿蚤灶澡蚤遭蚤贼藻凿悦燥造燥猿圆园糟藻造造泽蚤灶增葬泽蚤燥灶 ( 伊圆园园 ) 猿摇讨摇论中国在世界上属于直肠癌低发地区, 但其发生 [ 员圆鄄员猿率在不少地区有程度不等的增加趋势 ] 而直肠癌中晚期因癌肿得不到有效地控制就会发生转移, 直肠癌转移到其他的器官和组织, 是造成直肠癌 患者死亡的最主要的原因之一 允粤运鄄杂栽粤栽信号对直肠癌的转移和侵袭有重要作用 杂栽粤栽在肿瘤发生和进展中的作用主要表现为酪氨酸激酶选择性激活杂栽粤栽蛋白致癌, 而杂栽粤栽突变体能阻断酪氨酸激酶诱导的杂栽粤栽依赖性转录和活化, 杂栽粤栽异常激活会导致肿瘤进程中细胞增

6 猿猿远 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园员缘年远月, 圆圆 ( 猿 ) [ 员源殖 ] 本研究表明, 直肠癌组织中杂栽粤栽猿的含量和磷酸化水平远远高于非直肠癌组织 ( 孕约园援园员 ); 同时悦赠糟造蚤灶阅员 月糟造圆还在直肠癌组织中的表达明显高于正常肠道组织 ( 孕约园援园缘 ) 本研究还发现, 杂栽粤栽猿蛋白的表达水平与直肠癌的分化程度 淋巴转移有关 ( 孕约园援园缘 ); 而与肿瘤大小无关 ( 孕跃园援园缘 ); 沉默杂栽粤栽猿后, 悦燥造燥猿圆园细胞的增殖能力有不同程度的抑制 ( 孕约园援园缘 ) 且肿瘤细胞的侵袭转移能力降低 ( 孕约园郾园缘 ) 摇摇由实验结果分析可知, 杂栽粤栽猿基因在人直肠癌组织和细胞系中异常活化, 提示杂栽粤栽猿的过度激活可能在直肠癌的发生发展中起到了重要的作用, 并且与直肠癌的侵袭和转移有密切的关系 在允粤运鄄杂栽粤栽信号通路中, 允粤运激活后催化受体上的酪氨酸残基发生磷酸化修饰, 继而这些磷酸化的酪氨酸位点与周围的氨基酸序列形成 停泊位点, 同时含有杂匀圆结构域的杂栽粤栽蛋白被招募到这个 停泊位点 最后, 激酶允粤运催化结合在受体上的杂栽粤栽蛋白发生磷酸化修饰, 活化的杂栽粤栽蛋白以二聚体的形式进入细胞核内与靶基因结合, 调控基因的转 [ 员缘录 ] 推测分析, 一方面可能是杂栽粤栽猿直接与糟赠糟鄄造蚤灶阅员启动子结合而启动转录, 或者杂栽粤栽猿与月糟造圆启动子结合而启动转录 ; 另一方面, 阻断允粤运鄄杂栽粤栽信号通路不仅能抑制肿瘤细胞的侵袭转移能力, 还能促进凋亡, 悦赠糟造蚤灶阅员 月糟造圆等抗凋亡蛋白在允粤运鄄杂栽粤栽信号通路被激活的状态下表达明显上调, 抑制允粤运鄄杂栽粤栽信号通路即刻下调抗凋亡蛋白的表达, 使肿瘤细胞的凋亡增加 ; 也有研究表明, 杂栽粤栽猿的活化能增加金属基质蛋白酶的表达, 这说明杂栽粤栽猿参与肿瘤的浸润和转移 本研究表明, 允粤运鄄杂栽粤栽信号通路对直肠癌的发生发展发挥了重要的调控作用, 杂栽粤栽猿能促进直肠癌的增殖以及侵袭转移, 为临床上直肠癌的防治提供了潜在的靶点 [ 参考文献 ] [ 员 ] 摇月则葬糟藻赠栽, 酝葬贼澡藻憎允援酝藻贼葬泽贼葬贼蚤糟蚤灶贼则葬皂怎糟燥泽葬造糟燥造燥则藻糟贼葬造葬凿藻灶燥糟葬则鄄糟蚤灶燥皂葬粤糟葬泽藻贼燥泽怎责责燥则贼则藻增蚤藻憎燥枣糟怎则则藻灶贼糟燥灶糟藻责贼泽 ( 葬灶凿泽贼葬早蚤灶早 ) 燥枣藻葬则造赠糟燥造燥则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援匀蚤泽贼燥责葬贼澡燥造燥早赠, 圆园员源, 怨圆 ( 圆 ): 员源鄄员远援 [ 圆 ] 摇粤噪遭葬则粤, 月澡葬贼贼蚤粤月, 运澡葬贼贼葬噪杂, 藻贼葬造援韵怎贼糟燥皂藻燥枣则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则 蚤灶责葬贼蚤藻灶贼泽葬早藻凿猿园赠藻葬则泽燥则造藻泽泽蚤灶贼澡藻责葬噪蚤泽贼葬灶蚤责燥责怎造葬贼蚤燥灶 [ 允 ] 援粤泽蚤葬灶孕葬糟允悦葬灶糟藻则孕则藻增, 圆园员园, 员缘 ( 员缘 ): 远猿猿怨鄄远猿源圆援 [ 猿 ] 摇酝怎则责澡赠晕, 晕燥则葬贼栽, 云藻则则葬则蚤孕, 藻贼葬造援阅蚤藻贼葬则赠枣蚤遭则藻蚤灶贼葬噪藻葬灶凿则蚤泽噪泽燥枣糟葬灶糟藻则泽燥枣贼澡藻糟燥造燥灶葬灶凿则藻糟贼怎皂蚤灶贼澡藻耘怎则燥责藻葬灶责则燥泽责藻糟鄄贼蚤增藻蚤灶增藻泽贼蚤早葬贼蚤燥灶蚤灶贼燥糟葬灶糟藻则葬灶凿灶怎贼则蚤贼蚤燥灶 ( 耘孕陨悦 )[ 允 ] 援孕蕴燥杂韵晕耘, 圆园员圆, 苑 ( 远 ): 藻猿怨猿远员援 [ 源 ] 摇宰葬灶早杂宰, 杂怎灶再酝援栽澡藻陨蕴鄄远辕允粤运辕杂栽粤栽猿责葬贼澡憎葬赠 : 责燥贼藻灶贼蚤葬造贼澡藻则葬责藻怎贼蚤糟泽贼则葬贼藻早蚤藻泽蚤灶贼则藻葬贼蚤灶早糟燥造燥则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则 ( 砸藻增蚤藻憎 )[ 允 ] 援陨灶贼允韵灶糟燥造, 圆园员源, 源源 ( 源 ): 员园猿圆鄄员园源园援 [ 缘 ] 摇杂造葬贼贼藻则赠酝蕴, 蕴怎灶凿早则藻藻灶粤, 运葬凿造怎遭葬则杂粤, 藻贼葬造援允粤运辕杂栽粤栽辕杂韵悦杂鄄泽蚤早灶葬造蚤灶早责葬贼澡憎葬赠葬灶凿糟燥造燥灶葬灶凿则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援酝燥造悦葬则糟蚤灶燥早, 圆园员猿, 缘圆 ( 圆 ): 员缘缘鄄员远远援 [ 远 ] 摇酝燥灶灶蚤藻灶云, 在葬噪蚤匀, 月燥则早悦, 藻贼葬造援孕则燥早灶燥泽贼蚤糟增葬造怎藻燥枣责澡燥泽责澡燥鄄则赠造葬贼藻凿杂栽粤栽猿蚤灶葬凿增葬灶糟藻凿则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则 : 粤泽贼怎凿赠枣则燥皂员园源云则藻灶糟澡责葬贼蚤藻灶贼泽蚤灶糟造怎凿藻凿蚤灶贼澡藻耘韵砸栽悦圆圆怨圆员贼则蚤葬造 [ 允 ] 援允悦造蚤灶孕葬贼澡燥造, 圆园员园, 远猿 ( 员园 ): 愿苑猿鄄远苑愿援 [ 苑 ] 摇杂澡蚤灶允杂, 栽怎贼栽郧, 匀燥灾, 藻贼葬造援孕则藻凿蚤糟贼蚤增藻皂葬则噪藻则泽燥枣则葬凿蚤燥贼澡藻则葬责赠鄄蚤灶凿怎糟藻凿则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则则藻早则藻泽泽蚤燥灶 [ 允 ] 援允悦造蚤灶孕葬贼澡燥造, 圆园员员, 员圆 ( 源 ): 员猿员鄄员猿缘援 [ 愿 ] 摇运蚤皂悦匀, 匀怎澡允宰, 运蚤皂匀砸, 藻贼葬造援陨灶凿藻贼藻则皂蚤灶葬贼藻责怎造皂燥灶葬则赠灶燥凿鄄怎造藻泽蚤灶糟燥造燥则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则 : 云燥造造燥憎鄄怎责早怎蚤凿藻造蚤灶藻泽遭葬泽藻凿燥灶葬则蚤泽噪责则藻鄄凿蚤糟贼蚤增藻皂燥凿藻造 [ 允 ] 援粤灶灶杂怎则早, 圆园员源, 猿源 ( 缘 ): 源缘鄄源怨援 [ 怨 ] 摇酝葬早怎蚤则藻粤, 杂澡藻葬澡葬灶运援悦燥灶贼则燥增藻则泽蚤藻泽蚤灶贼澡藻责葬贼澡燥造燥早蚤糟葬造葬泽泽藻泽泽鄄皂藻灶贼燥枣糟燥造燥则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援宰燥则造凿允郧葬泽贼则燥藻灶贼藻则燥造, 圆园员源, 圆园 ( 圆怨 ): 怨愿缘园鄄怨愿远员援 [ 员园 ] 栽泽葬灶早允杂, 灾藻灶糟噪藻灶杂, 杂澡葬则葬枣韵, 藻贼葬造援郧造燥遭葬造阅晕粤皂藻贼澡赠造葬贼蚤燥灶蚤泽葬造贼藻则藻凿遭赠灶藻燥葬凿躁怎增葬灶贼糟澡藻皂燥则葬凿蚤燥贼澡藻则葬责赠蚤灶则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则葬灶凿皂葬赠责则藻凿蚤糟贼则藻泽责燥灶泽藻贼燥贼则藻葬贼皂藻灶贼鄄粤责蚤造燥贼泽贼怎凿赠 [ 允 ] 援耘怎则允杂怎则早韵灶糟燥造, 圆园员源, 员园 ( 员苑 ): 苑源愿鄄苑源愿援 [ 员员 ] 阅葬则砸粤, 悦澡燥憎凿则蚤晕粤, 孕葬则则葬赠云匝, 藻贼葬造援孕则藻鄄燥责藻则葬贼蚤增藻泽贼葬早蚤灶早燥枣则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则怎泽蚤灶早皂怎造贼蚤鄄凿藻贼藻糟贼燥则则燥憎糟燥皂责怎贼藻凿贼燥皂燥早则葬责澡赠憎蚤贼澡皂怎造贼蚤责造葬灶葬则则藻枣燥则皂葬贼蚤燥灶泽 : 杂蚤灶早造藻糟藻灶贼藻则藻曾责藻则蚤藻灶糟藻 [ 允 ] 援陨灶凿蚤葬灶允悦葬灶糟藻则, 圆园员源, 缘员 ( 圆 ): 员苑园鄄员苑缘援 [ 员圆 ] 允燥赠藻陨, 匀葬怎泽贼藻则皂葬灶泽运援耘葬则造赠葬灶凿造葬贼藻贼燥曾蚤糟蚤贼赠燥枣则葬凿蚤燥贼澡藻则葬责赠枣燥则则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援砸藻糟藻灶贼砸藻泽怎造贼泽悦葬灶糟藻则砸藻泽, 圆园员源, 苑圆 ( 猿 ): 员愿怨鄄圆园员援 [ 员猿 ] 郧葬增葬则怎扎扎蚤栽, 郧蚤葬灶凿燥皂藻灶蚤糟燥云, 阅藻造月蚤葬灶糟燥孕, 藻贼葬造援匝怎葬造蚤贼赠燥枣造蚤枣藻葬枣贼藻则泽怎则早藻则赠枣燥则则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援砸藻糟藻灶贼砸藻泽怎造贼泽悦葬灶糟藻则砸藻泽, 圆园员源, 圆园猿 : 员员苑鄄员源怨援 [ 员源 ] 粤噪早怎灶在, 杂葬早造葬皂杂, 再怎糟藻造杂, 藻贼葬造援晕藻燥葬凿躁怎增葬灶贼糟澡则燥灶燥皂燥凿怎造葬贼藻凿糟葬责藻糟蚤贼葬遭蚤灶藻憎蚤贼澡则葬凿蚤燥贼澡藻则葬责赠蚤灶则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则 : 粤责澡葬泽藻 Ⅱ 遭则怎灶糟澡则藻早蚤皂藻灶泽贼怎凿赠 [ 允 ] 援悦葬灶糟藻则悦澡藻皂燥贼澡藻则孕澡葬则皂葬糟燥造, 圆园员园, 圆圆 ( 怨 ): 员员缘鄄员员苑援 [ 员缘 ] 杂造葬贼贼藻则赠酝蕴, 蕴怎灶凿早则藻藻灶粤, 运葬凿造怎遭葬则杂粤, 藻贼葬造援允粤运辕杂栽粤栽辕杂韵悦杂鄄泽蚤早灶葬造蚤灶早责葬贼澡憎葬赠葬灶凿糟燥造燥灶葬灶凿则藻糟贼葬造糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援酝燥造悦葬则鄄糟蚤灶燥早, 圆园员猿, 缘圆 ( 圆 ): 员缘缘鄄员远远援 [ 收稿日期 ] 摇圆园员缘原园源原园愿 [ 修回日期 ] 摇圆园员缘原园缘原园苑 [ 本文编辑 ] 摇阮芳铭