中国肿瘤生物治疗杂志摇澡贼贼责 : 辕辕憎憎憎援遭蚤燥贼澡藻则援燥则早悦澡蚤灶允悦葬灶糟藻则月蚤燥贼澡藻则, 允怎灶援圆园园怨, 灾燥造援员远, 晕燥援猿 圆缘猿 阅韵陨 : 员园援猿愿苑圆辕躁援蚤泽泽灶援员园园苑鄄猿愿缘载援圆园园怨援园猿援园园怨 基础研究 肝癌细胞特异性陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤对

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1 中国肿瘤生物治疗杂志摇澡贼贼责 : 辕辕憎憎憎援遭蚤燥贼澡藻则援燥则早悦澡蚤灶允悦葬灶糟藻则月蚤燥贼澡藻则, 允怎灶援圆园园怨, 灾燥造援员远, 晕燥援猿 圆缘猿 阅韵陨 : 员园援猿愿苑圆辕躁援蚤泽泽灶援员园园苑鄄猿愿缘载援圆园园怨援园猿援园园怨 基础研究 肝癌细胞特异性陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤对小鼠移植肝癌的抑制 刘艳艳, 梁淑娟, 王焕芹, 张素华, 肖伟玲, 吴慧娜 ( 潍坊医学院免疫学教研室, 山东省高校免疫学重点实验室, 山东潍坊摇圆远员园源圆 ) [ 摘摇要 ] 摇目的 : 构建肝癌细胞特异性小鼠陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤表达载体, 观察其对匀圆圆肝癌细胞小鼠移植瘤生长的影响及其相关机制 方法 : 构建由粤云孕最小启动子和悦酝灾增强子嵌合序列调控的携陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤表达载体责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员 和责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆, 经质粒孕悦砸 限制性酶谱分析 序列测定进行鉴定 反义砸晕粤表达载体转染小鼠匀圆圆肝癌细胞, 分 匀圆圆辕皂燥糟噪组 匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员组 匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆三组, 砸栽鄄孕悦砸检测陨蕴鄄员 β 的表达水平 以转染后的匀圆圆细胞皮下接种建立荷肝癌小鼠模型, 观察移植瘤体积和重量, 酝栽栽法检测荷瘤小鼠脾脏中分离的晕运细胞对匀圆圆细胞的杀伤活性 结果 : 经质粒孕悦砸 限制性酶谱分析 序列测定证实成功构建能够在肝癌细胞中特异性表达陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤的表达载体责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤鄄陨蕴鄄员 β 员和责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆, 转染匀圆圆细胞后细胞中陨蕴鄄员 β 表达水平明显下降, 以责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆更为显著 成功建立荷肝癌小鼠模型, 与匀圆圆辕皂燥糟噪组小鼠相比, 匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆组小鼠移植瘤体积较小, 生长显著减慢 ( 孕约园援园缘 ) 匀圆圆辕葬灶贼蚤鄄陨蕴鄄员 β 员 匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆组荷瘤小鼠的晕运细胞对匀圆圆细胞的杀伤活性明显增强 ( 孕约园援园缘或孕约园援园员 ) 结论 : 成功构建的肝癌细胞特异性陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤表达载体可有效抑制小鼠移植肝癌的生长, 其机制与靶向阻断陨蕴鄄员 β 表达 上调晕运细胞的杀伤活性有关 [ 关键词 ] 摇肝癌 ; 白细胞介素员 β; 反义砸晕粤 ; 晕运细胞 [ 中图分类号 ] 摇砸苑猿缘援苑 ; 砸苑猿缘援缘源摇摇摇摇 [ 文献标志码 ] 摇粤摇摇摇摇 [ 文章编号 ] 摇员园园苑鄄猿愿缘载 ( 圆园园怨 ) 园猿鄄园圆缘猿鄄园缘 匀藻责葬贼燥糟葬则糟蚤灶燥皂葬泽责藻糟蚤枣蚤糟陨蕴鄄员 β 葬灶贼蚤鄄泽藻灶泽藻砸晕粤蚤灶澡蚤遭蚤贼泽蚤皂责造葬灶贼藻凿澡藻责葬贼燥糟葬则糟蚤鄄灶燥皂葬蚤灶皂蚤糟藻 蕴陨哉再葬灶鄄赠葬灶, 蕴陨粤晕郧杂澡怎鄄躁怎葬灶, 宰粤晕郧匀怎葬灶鄄择蚤灶, 在匀粤晕郧杂怎鄄澡怎葬, 载陨粤韵宰藻蚤鄄造蚤灶早, 宰哉匀怎蚤鄄灶葬 ( 阅藻责葬则贼皂藻灶贼燥枣陨皂鄄皂怎灶燥造燥早赠, 宰藻蚤枣葬灶早酝藻凿蚤糟葬造悦燥造造藻早藻 ; 运藻赠陨皂皂怎灶燥造燥早赠蕴葬遭燥则葬贼燥则赠燥枣匀蚤早澡藻则陨灶泽贼蚤贼怎贼蚤燥灶燥枣杂澡葬灶凿燥灶早孕则燥增蚤灶糟藻, 宰藻蚤枣葬灶早圆远员园源圆, 杂澡葬灶凿燥灶早, 悦澡蚤灶葬 ) [ 粤遭泽贼则葬糟贼 ] 摇韵遭躁藻糟贼蚤增藻 : 栽燥糟燥灶泽贼则怎糟贼澡藻责葬贼燥糟葬则糟蚤灶燥皂葬泽责藻糟蚤枣蚤糟陨蕴鄄员 β 葬灶贼蚤鄄泽藻灶泽藻砸晕粤藻曾责则藻泽泽蚤燥灶增藻糟贼燥则葬灶凿贼燥藻曾责造燥则藻蚤贼泽藻枣枣藻糟贼燥灶贼澡藻早则燥憎贼澡燥枣蚤皂责造葬灶贼藻凿澡藻责葬贼燥糟葬则糟蚤灶燥皂葬匀圆圆糟藻造造泽蚤灶皂蚤糟藻葬灶凿贼澡藻责燥泽泽蚤遭造藻皂藻糟澡葬灶蚤泽皂援酝藻贼澡燥凿泽 : 酝怎则蚤灶藻陨蕴鄄员 β 葬灶贼蚤鄄泽藻灶泽藻砸晕粤藻曾责则藻泽泽蚤燥灶增藻糟贼燥则泽责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员葬灶凿责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆怎灶凿藻则贼澡藻则藻早怎造葬贼蚤燥灶燥枣皂蚤灶蚤皂葬造葬造责澡葬鄄枣藻贼燥责则燥贼藻蚤灶 ( 粤云孕 ) 责则燥皂燥贼藻则葬灶凿悦酝灾藻灶澡葬灶糟藻则憎藻则藻糟燥灶泽贼则怎糟贼藻凿, 葬灶凿枣怎则贼澡藻则增藻则蚤枣蚤藻凿遭赠孕悦砸, 则藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶藻灶凿燥灶怎鄄糟造藻葬泽藻葬灶葬造赠泽蚤泽葬灶凿阅晕粤泽藻择怎藻灶糟蚤灶早援匀圆圆糟藻造造泽贼则葬灶泽枣藻糟贼藻凿憎蚤贼澡责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员燥则责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆憎藻则藻凿蚤增蚤凿藻凿蚤灶贼燥猿早则燥怎责泽 : 匀圆圆辕皂燥糟噪, 匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员葬灶凿匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆早则燥怎责援耘曾责则藻泽泽蚤燥灶燥枣陨蕴鄄员 β 憎葬泽凿藻贼藻糟贼藻凿遭赠砸栽鄄孕悦砸援栽则葬灶泽枣藻糟贼藻凿匀圆圆糟藻造造泽憎藻则藻泽怎遭糟怎贼葬灶藻燥怎泽造赠蚤灶躁藻糟贼藻凿蚤灶贼燥皂蚤糟藻贼燥藻泽贼葬遭造蚤泽澡贼怎皂燥则蚤皂责造葬灶贼藻凿皂燥怎泽藻皂燥凿藻造援栽怎皂燥则增燥造鄄怎皂藻憎葬泽皂藻葬泽怎则藻凿 ; 贼澡藻糟赠贼燥贼燥糟蚤曾蚤贼赠燥枣泽责造藻藻灶晕运葬早葬蚤灶泽贼匀圆圆糟藻造造泽憎葬泽凿藻贼藻糟贼藻凿遭赠酝栽栽援砸藻泽怎造贼泽 : 匀藻责葬贼燥糟葬则糟蚤灶燥皂葬泽责藻鄄糟蚤枣蚤糟陨蕴鄄员 β 葬灶贼蚤鄄泽藻灶泽藻砸晕粤藻曾责则藻泽泽蚤燥灶增藻糟贼燥则泽责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员葬灶凿责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆憎藻则藻泽怎糟糟藻泽泽枣怎造造赠糟燥灶鄄泽贼则怎糟贼藻凿葬灶凿憎藻则藻增藻则蚤枣蚤藻凿遭赠孕悦砸, 则藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶藻灶凿燥灶怎糟造藻葬泽藻葬灶葬造赠泽蚤泽葬灶凿阅晕粤泽藻择怎藻灶糟蚤灶早援陨蕴鄄员 β 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶蚤灶匀圆圆糟藻造造泽憎葬泽凿燥憎灶鄄则藻早怎造葬贼藻凿葬枣贼藻则贼则葬灶泽枣藻糟贼藻凿憎蚤贼澡陨蕴鄄员 β 葬灶贼蚤鄄泽藻灶泽藻砸晕粤藻曾责则藻泽泽蚤燥灶增藻糟贼燥则泽, 藻泽责藻糟蚤葬造造赠憎蚤贼澡贼澡藻责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆增藻糟贼燥则援匀藻责葬贼燥糟葬则糟蚤灶燥皂葬糟藻造造泽蚤皂责造葬灶贼藻凿皂燥怎泽藻皂燥凿藻造憎葬泽泽怎糟糟藻泽泽枣怎造造赠藻泽贼葬遭造蚤泽澡藻凿援栽怎皂燥则增燥造怎皂藻葬灶凿早则燥憎贼澡燥枣贼怎皂燥则蚤灶匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆皂蚤糟藻憎葬泽燥遭增蚤燥怎泽造赠泽皂葬造造藻则贼澡葬灶贼澡葬贼蚤灶匀圆圆辕皂燥糟噪皂蚤糟藻, 葬灶凿贼澡藻糟赠贼燥贼燥糟蚤曾蚤贼赠燥枣泽责造藻藻灶晕运葬鄄早葬蚤灶泽贼匀圆圆糟藻造造泽蚤灶匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员葬灶凿匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆皂蚤糟藻憎葬泽葬造泽燥早则藻葬贼造赠藻灶澡葬灶糟藻凿援悦燥灶糟造怎泽蚤燥灶 : 匀藻责葬贼燥糟葬则糟蚤灶燥皂葬 [ 基金项目 ] 摇国家自然科学基金资助项目 ( 晕燥援猿园苑苑圆源怨苑 ); 山东省高层次卫生人才员园圆园工程专项基金 ; 教育部科学技术研究基金重点项目 ( 晕燥援圆园缘园怨园 ); 山东省科技攻关计划项目 ( 晕燥援圆园园愿郧郧员园园园圆园园苑 ) 杂怎责责燥则贼藻凿遭赠贼澡藻晕葬贼蚤燥灶葬造晕葬贼怎则葬造杂糟蚤藻灶糟藻云燥怎灶凿葬贼蚤燥灶燥枣悦澡蚤灶葬 ( 晕燥援猿园苑苑圆源怨苑 ); 贼澡藻 员园圆员 耘灶早蚤灶藻藻则蚤灶早云燥怎灶凿葬贼蚤燥灶燥枣杂澡葬灶凿燥灶早孕怎遭造蚤糟匀藻葬造贼澡杂赠泽贼藻皂 ; 贼澡藻酝葬躁燥则杂糟蚤藻灶糟藻葬灶凿栽藻糟澡灶燥造燥早赠孕则燥躁藻糟贼燥枣贼澡藻酝蚤灶蚤泽贼则赠燥枣耘凿怎糟葬贼蚤燥灶燥枣悦澡蚤灶葬 ( 晕燥援圆园缘园怨园 ); 贼澡藻杂糟蚤藻灶糟藻葬灶凿栽藻糟澡灶燥造燥早赠砸藻泽藻葬则糟澡孕则燥躁藻糟贼燥枣杂澡葬灶凿燥灶早孕则燥增蚤灶糟藻 ( 晕燥援圆园园愿郧郧员园园园圆园园园苑 ) [ 作者简介 ] 摇刘艳艳 ( 员怨愿圆鄄 ), 女, 山东省昌邑市人, 硕士生, 主要从事抗肿瘤免疫方面的研究 通讯作者 ( 悦燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早葬怎贼澡燥则 ) 援耘鄄皂葬蚤造 : 造蚤葬灶早泽澡躁岳憎枣皂糟援藻凿怎援糟灶

2 圆缘源 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园园怨年远月, 员远 ( 猿 ) 泽责藻糟蚤枣蚤糟陨蕴鄄员 β 葬灶贼蚤鄄泽藻灶泽藻砸晕粤藻曾责则藻泽泽蚤燥灶增藻糟贼燥则责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 憎葬泽泽怎糟糟藻泽泽枣怎造造赠糟燥灶泽贼则怎糟贼藻凿援陨贼藻枣枣藻糟贼蚤增藻造赠蚤灶澡蚤遭蚤贼泽贼澡藻早则燥憎贼澡燥枣蚤皂责造葬灶贼藻凿澡藻责葬贼燥糟葬则糟蚤灶燥皂葬蚤灶皂蚤糟藻责则燥遭葬遭造赠贼澡则燥怎早澡泽责藻糟蚤枣蚤糟葬造造赠遭造燥糟噪蚤灶早藻曾责则藻泽泽蚤燥灶燥枣陨蕴鄄员 β 葬灶凿蚤灶糟则藻葬泽蚤灶早糟赠贼燥贼燥糟蚤曾蚤贼赠燥枣泽责造藻藻灶晕运援 [ 运藻赠憎燥则凿泽 ] 摇造蚤增藻则灶藻燥责造葬泽皂泽 ; 陨蕴鄄员 β; 葬灶贼蚤鄄泽藻灶泽藻砸晕粤 ; 晕运糟藻造造 [ 悦澡蚤灶允悦葬灶糟藻则月蚤燥贼澡藻则, 圆园园怨, 员远 ( 猿 ): 圆缘猿鄄圆缘苑 ] 摇摇 摇摇在肿瘤的发生发展过程中, 肿瘤与周围的宿主成分形成肿瘤微环境, 主要包括肿瘤细胞 宿主细胞 细胞外基质以及大量分泌的细胞因子, 其中最重要的是细胞因子 慢性炎症性细胞因子在肿瘤的发 [ 员生发展中扮演重要角色 ] 白细胞介素员 ( 蚤灶贼藻则造藻怎鄄噪蚤灶鄄员 β, 陨蕴鄄员 β) 是肿瘤微环境分泌的一种重要的促炎性细胞因子, 在乳腺癌 肺癌 结肠癌及黑素瘤中 [ 圆都有较高水平的表达 ] [ 猿 ], 也有研究认为陨蕴鄄员 β 与病毒感染导致的肝细胞癌有关 陨蕴鄄员 β 通过促进恶性细胞或宿主来源的基质细胞分泌生长因子 血管生成因子 基质金属蛋白酶 乏氧因子和黏附分子促进肿瘤血管的生成并参与肿瘤的生长 局部浸润和 [ 源远处转移 ] 以陨蕴鄄员为靶点的靶向治疗策略呈现出良好的应用前景 本实验构建能够在肝癌细胞中特异性表达的由 粤云孕最小启动子和悦酝灾增强子嵌合序列调控的小鼠陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤表达载体, 观察其对陨蕴鄄员 β 表达的影响 ; 并以转染反义砸晕粤表达载体的匀圆圆肝癌细胞构建皮下荷瘤小鼠模型, 观察其对小鼠体内肿瘤生长的影响, 为下一步以陨蕴鄄员 β 为靶点的肝癌治疗奠定基础 员摇 员援员摇 材料与方法 实验材料 月粤蕴月辕糟小鼠 ( 远耀耀耀耀愿周龄 ) 购自北京维通利华实验动物有限公司 [ 合格证号为杂悦载运 ( 京 ) 圆园园远鄄园园园愿 ] 小鼠肝癌细胞匀圆圆 ( 购自粤栽悦悦公司 ) 培养于阅酝耘酝培养基 ( 含员园豫新生牛血清 ); 小鼠淋巴瘤细胞再粤悦鄄员 ( 购自粤栽哉公司 ) 培养于砸孕酝陨员远源园 培养基 ( 含员园豫新生牛血清 ); 小鼠结肠癌细胞悦栽鄄圆远由本室保存, 培养于砸孕酝陨员远源园完全培养基 ( 含 员园豫新生牛血清 ) 责陨砸耘杂圆鄄耘郧云孕由本室保存, 酝鄄酝蕴灾逆转录酶购自陨灶增蚤贼则燥早藻灶公司, 孕枣怎阅晕粤聚合酶 栽葬择阅晕粤聚合酶 限制性内切酶耘糟燥砸 Ⅰ 和载澡燥 Ⅰ 栽源连接酶等均购自酝月陨公司 ; 躁藻贼孕耘陨及淋巴细胞分离液均购自深圳达科为公司 员援圆摇 肝癌细胞特异性表达载体的构建 首先从责陨砸耘杂圆鄄耘郧云孕中扩增巨细胞病毒 ( 悦酝灾 ) 增强子 ( 猿圆源遭责 ), 引物序列 : 上游引物缘忆鄄 粤粤栽粤郧郧郧粤悦栽栽栽悦悦粤栽栽郧粤悦郧鄄猿忆, 下游引物缘忆鄄粤粤栽郧栽栽悦栽栽悦粤悦悦粤栽悦粤粤粤粤悦粤粤粤悦栽悦悦悦粤栽栽郧粤悦郧鄄猿忆 从小鼠匀圆圆细胞基因组阅晕粤中扩增甲胎蛋白 ( 粤云孕 ) 最小启动子 ( 圆圆怨遭责 ), 上游引物缘忆鄄粤栽郧郧栽郧粤粤郧粤粤悦粤栽栽栽郧悦粤郧悦鄄猿忆, 下游引物缘忆鄄栽栽郧悦栽粤郧悦栽栽悦郧粤郧悦粤郧栽郧悦栽郧悦栽郧粤粤郧栽悦悦栽栽鄄猿忆, 在耘悦酝灾的下游引物中含有与粤云孕启动子互补的员缘遭责序列 然后利用重叠延伸孕悦砸 ( 杂韵耘鄄孕悦砸 ) 将上述片段连接, 引入责陨砸耘杂圆鄄耘郧云孕, 构建由 粤云孕最小启动子调控的肝癌细胞特异性表达载体 责葬枣责陨砸耘杂圆鄄耘郧云孕 构建的载体经质粒孕悦砸 限制性酶谱分析 阅晕粤序列测定和细胞转染鉴定正确后, 用于陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤表达载体的构建 员援猿摇 小鼠腹腔巨噬细胞的分离及总砸晕粤的提取 分离前员耀耀耀耀圆凿, 小鼠腹腔内注射远豫无菌淀粉肉汤员皂造, 实验时向小鼠腹腔注入生理盐水圆皂造, 抽远取灌洗液, 离心分离腹腔巨噬细胞, 圆伊员园辕皂造细胞加入蕴孕杂 ( 缘 μ 早辕皂造 ) 培养源澡, 收集细胞, 按照砸晕粤 提取试剂盒说明提取总砸晕粤, 原苑园益保存备用 员援源摇肝癌细胞特异性陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤表达载体的构建及鉴定 选择两段反义砸晕粤的作用靶点 : 陨蕴鄄员 β 员针对 陨蕴鄄员 β 编码序列的原员圆耀耀耀耀圆猿源遭责, 跨越粤栽郧起始密码子附近区域, 是经典的反义砸晕粤靶向位点 ; 陨蕴鄄员 β 圆针对猿愿苑耀耀耀耀远苑员遭责, 跨越陨蕴鄄员 β 转化酶 ( 陨悦耘 ) 的作用位点 所用的孕悦砸引物如下 : 陨蕴鄄员 β 员 ( 圆远源遭责 ) 上游引物孕员 : 缘忆鄄悦悦郧郧粤粤栽栽悦郧栽悦栽郧粤粤郧悦粤郧悦栽粤栽郧郧悦粤粤悦栽鄄猿忆, 下游引物 : 缘忆鄄悦悦郧悦栽悦郧粤郧栽郧悦栽悦粤栽郧栽悦悦栽悦粤栽悦悦栽郧郧鄄猿忆 ; 陨蕴鄄员 β 圆 ( 圆愿源遭责 ) 上游引物缘忆鄄悦悦郧郧粤粤栽栽悦郧悦悦悦粤栽悦悦栽悦栽郧栽郧粤悦栽悦粤鄄猿忆, 下游引物缘忆鄄悦悦郧悦栽悦郧粤郧郧郧栽郧栽郧悦悦郧栽悦栽栽栽悦粤栽栽粤悦鄄猿忆 陨蕴鄄员 β 员和陨蕴鄄员 β 圆 的上游引物中引入载澡燥 Ⅰ, 下游引物中加入耘糟燥砸 Ⅰ 限制性内切酶位点 孕悦砸反应条件 : 怨缘益预变性缘皂蚤灶, 怨源益猿园泽, 缘苑益猿园泽, 苑圆益猿园泽, 共猿园个循环, 最后苑圆益延伸员园皂蚤灶 圆园早辕蕴琼脂糖凝胶电泳分析孕悦砸结果, 回收并纯化目的基因片段, 与责葬枣鄄责陨砸耘杂圆鄄耘郧云孕表达载体同时进行载澡燥 Ⅰ 和耘糟燥砸 Ⅰ 双酶切, 在栽源连接酶作用下反向连接, 员远益反应圆

3 刘艳艳, 等援肝癌细胞特异性陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤对小鼠移植肝癌的抑制 圆缘缘 澡 反应产物转化阅匀缘 α, 质粒孕悦砸方法初步鉴定后, 最后进行阅晕粤测序分析, 获得反义砸晕粤表达载体责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员和责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆 员援缘摇倒置相差荧光显微镜下观察重组载体在肿瘤细胞中的转染和表达 匀圆圆 再粤悦鄄员及悦栽鄄圆远细胞培养于完全培养基中, 细胞的转染根据躁藻贼孕耘陨说明书完成, 转染前员圆澡 更换培养液, 将细胞接种于远孔培养板, 使转染时细胞汇合达到愿缘豫 按照说明配制好质粒与躁藻贼孕耘陨 混合物, 加到匀圆圆细胞中, 实验分猿组 : 责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员组 ( 匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员 ) 责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆组 ( 匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆 ) 和责葬枣责陨砸耘杂圆鄄耘郧云孕对照组 ( 匀圆圆辕皂燥糟噪 ) 同时为证明载体的肝癌特异性, 将载体转染再粤悦鄄员及悦栽鄄圆远细胞 转染源愿澡后, 倒置相差荧光显微镜下观察重组载体在肿瘤细胞中的转染和表达 员援远摇 砸栽鄄孕悦砸检测陨蕴鄄员 β 皂砸晕粤的表达 取匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员 匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆 匀圆圆辕皂燥糟噪 细胞, 提取细胞总砸晕粤, 扩增小鼠陨蕴鄄员 β 全长基因 ( 愿员园遭责 ): 上游引物缘忆鄄悦悦郧郧粤粤栽栽悦粤悦悦粤栽郧郧悦粤粤悦栽郧栽栽悦悦栽郧粤粤鄄猿忆, 下游引物缘忆鄄悦悦郧悦栽悦郧粤郧栽栽粤郧郧粤粤郧粤悦粤悦粤郧粤栽栽悦鄄猿忆 反应条件 : 怨缘益预变性缘皂蚤灶, 怨源益猿园泽, 缘苑益猿园泽, 苑圆益员皂蚤灶, 共猿园个循环, 最后苑圆益延伸员园皂蚤灶 员缘早辕蕴 琼脂糖凝胶电泳分析孕悦砸结果 员援苑摇 荷瘤小鼠模型的建立及观察陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤 对移植瘤生长的影响 调整匀圆圆辕葬灶贼蚤鄄陨蕴鄄员 β 员 匀圆圆辕葬灶贼蚤鄄陨蕴鄄员 β 圆及 缘匀圆圆辕皂燥糟噪细胞的密度, 按圆伊员园辕只将细胞接种于 月粤蕴月辕糟小鼠右侧前肢腋下, 建立皮下荷瘤模型 缘凿后开始观察肿瘤生长状况, 以刚触及肿瘤为成瘤标准, 每隔圆凿游标卡尺测量员次, 并记录最大径和圆最小径 体积公式 : 灾越员辕远伊 π 伊葬伊遭 ( 葬 : 最大径 ; 遭 : 最小径 ) 比较各组肿瘤的生长情况 员援愿摇 酝栽栽法检测荷瘤小鼠脾脏晕运细胞杀伤活性 断颈处死荷瘤小鼠, 无菌分离荷瘤小鼠脾脏, 按照淋巴细胞分离液说明书中的方法, 称重后研磨并分离小鼠脾脏淋巴细胞, 重悬于完全阅酝耘酝培养液, 即得到晕运细胞杀伤活性中效应细胞 以匀圆圆 源细胞为靶细胞, 调整密度为缘伊员园辕皂造, 混匀后员园园 μ 造靶细胞辕孔加入怨远孔板, 培养圆源澡后按员园颐员 圆园颐员 源园颐员不同效靶比加入效应细胞员园园 μ 造辕孔, 培养远澡, 加入酝栽栽 ( 缘皂早辕皂造 ) 员园 μ 造辕孔, 培养源澡, 弃 员缘园 μ 造上清, 加入员缘园 μ 造阅酝杂韵溶解员园皂蚤灶, 测缘苑园灶皂和远猿园灶皂波长处的光密度值阅, 按照下述的公 式计算杀伤率 : 杀伤率 ( 豫 ) 越 [ 员原 ( 阅耘垣栽原阅耘 ) 辕阅栽 ] 伊员园园豫 其中阅耘为单纯效应细胞 ; 阅栽为单纯靶细胞, 阅耘垣栽为效应细胞加靶细胞 员援怨摇统计学处理采用杂孕杂杂员员援缘统计软件包, 数据的统计学分析采用配对贼检验的方法, 孕约园援园缘有统计学意义 圆摇结摇果圆援员摇肝癌细胞特异性表达载体的构建和鉴定利用杂韵耘鄄孕悦砸获得含有粤云孕启动子和耘悦酝灾嵌合的阅晕粤序列, 然后将获得的粤云孕鄄耘悦酝灾嵌合阅晕粤序列引入责陨砸耘杂圆鄄耘郧云孕, 构建由粤云孕最小启动子调控的肝癌细胞特异性表达载体, 经质粒孕悦砸 限制性酶谱分析 阅晕粤序列测定和细胞转染鉴定正确后将其命名为责葬枣责陨砸耘杂圆鄄耘郧云孕 ( 图员 ) 图员摇重组表达载体责葬枣责陨砸耘杂圆鄄耘郧云孕的限制性酶谱分析云蚤早援员摇砸藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶藻灶凿燥灶怎糟造藻葬泽藻葬灶葬造赠泽蚤泽燥枣则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼藻曾责则藻泽泽蚤燥灶增藻糟贼燥则责葬枣责陨砸耘杂圆鄄耘郧云孕员 : 员园园遭责郧藻灶砸怎造藻则阅晕粤酝葬则噪藻则 ; 圆, 源 : 责葬枣责陨砸耘杂圆鄄耘郧云孕 ; 猿 : 责葬枣责陨砸耘杂圆鄄耘郧云孕垣晕凿藻 Ⅰ; 缘 : 责葬枣责砸耘杂圆鄄耘郧云孕垣晕凿藻 Ⅰ 辕晕澡藻 Ⅰ 圆援圆摇肝癌细胞特异性陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤表达载体的 构建及鉴定砸栽鄄孕悦砸扩增陨蕴鄄员 β 员和陨蕴鄄员 β 圆获得两片段长度与预期产物相符, 产物经耘糟燥砸 Ⅰ 载澡燥 Ⅰ 双酶切后, 反向插入责葬枣责陨砸耘杂圆鄄耘郧云孕表达载体 孕悦砸鉴定阳性的质粒利用耘糟燥砸 Ⅰ 载澡燥 Ⅰ 进行限制性内切酶谱分析 ( 图圆 ) 序列测定证明陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤表达载体构建成功, 获得的重组表达载体含有与预期序列完全一致的基因片段, 分别命名为责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员和责葬枣责砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆 圆援猿摇陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤在匀圆圆细胞的特异性表达陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤表达载体责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤造蕴鄄员 β 员和责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤造蕴鄄员 β 圆转染源愿澡后荧光显微镜下, 可见转染责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤造蕴鄄员 β 的匀圆圆肝癌细胞发出明亮绿色荧光, 而再粤悦鄄员及悦栽鄄圆远细胞未见荧光, 证明陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤表达载体转染后肝癌细胞能够高效表达外源基因 ( 图猿 )

4 圆缘远 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园园怨年远月, 员远 ( 猿 ) 图圆摇责葬枣责陨砸耘杂圆鄄耘郧云孕鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员反义砸晕粤表达载体的耘糟燥砸 Ⅰ 载澡燥 Ⅰ 限制性酶谱分析云蚤早援圆摇砸藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶藻灶凿燥灶怎糟造藻葬泽藻葬灶葬造赠泽蚤泽燥枣葬灶贼蚤鄄泽藻灶泽藻砸晕粤藻曾责则藻泽泽蚤燥灶增藻糟贼燥则责葬枣责砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员 : 阅晕粤辕耘糟燥砸 Ⅰ 垣匀蚤灶凿 Ⅲ 酝葬则噪藻则 ; 圆, 猿 : 责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆垣耘糟燥砸 Ⅰ 葬灶凿载澡燥 Ⅰ; 源, 缘 : 责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员垣耘糟燥砸 Ⅰ 葬灶凿载澡燥 Ⅰ; 远, 苑 : 责葬枣责砸耘杂圆鄄耘郧云孕 图源摇砸栽鄄孕悦砸检测转染责葬枣责砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 后匀圆圆细胞中陨蕴鄄员 β 基因的表达云蚤早援源摇耘曾责则藻泽泽蚤燥灶燥枣陨蕴鄄员 β 早藻灶藻蚤灶匀圆圆糟藻造造泽葬枣贼藻则贼则葬灶泽枣藻糟贼蚤燥灶憎蚤贼澡责葬枣责砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员 : 阅晕粤辕耘糟燥砸 Ⅰ 垣匀蚤灶凿 Ⅲ 酝葬则噪藻则 ; 圆 : 晕藻早葬贼蚤增藻糟燥灶贼则燥造 ; 猿 : 匀圆圆辕皂燥糟噪糟藻造造泽 ; 源 : 匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员糟藻造造泽 ; 缘 : 匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆糟藻造造泽 图缘摇陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤表达载体对裸鼠移植瘤生长的影响云蚤早援缘摇耘枣枣藻糟贼燥枣陨蕴鄄员 β 葬灶贼蚤鄄泽藻灶泽藻砸晕粤藻曾责则藻泽泽蚤燥灶增藻糟贼燥则燥灶责则燥造蚤枣藻则葬贼蚤燥灶燥枣蚤皂责造葬灶贼藻凿贼怎皂燥则蚤灶灶怎凿藻皂蚤糟藻 孕约园援园缘增泽匀圆圆辕皂燥糟噪早则燥怎责 图猿摇陨蕴鄄员 β 员和陨蕴鄄员 β 圆反义砸晕粤在匀圆圆细胞中的表达云蚤早援猿摇耘曾责则藻泽泽蚤燥灶燥枣陨蕴鄄员 β 员葬灶凿陨蕴鄄员 β 圆 ( 伊员园园 ) 葬灶贼蚤鄄泽藻灶泽藻砸晕粤蚤灶匀圆圆糟藻造造泽粤 : 粤灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆贼则葬灶枣藻糟贼藻凿匀圆圆糟藻造造泽 ; 月 : 粤灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员贼则葬灶枣藻糟贼藻凿匀圆圆糟藻造造泽 ; 悦 : 酝燥糟噪贼则葬灶枣藻糟贼藻凿匀圆圆糟藻造造泽 ; 阅 : 粤灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆贼则葬灶枣藻糟贼藻凿再粤悦鄄员糟藻造造泽圆援源摇陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤表达载体转染后匀圆圆细胞的陨蕴鄄员 β 表达水平取匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员 匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆 匀圆圆辕皂燥糟噪细胞, 扩增陨蕴鄄员 β 全长基因, 得到目的基因片段 与匀圆圆辕皂燥糟噪比较, 匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员和匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆细胞中陨蕴鄄员 β 的表达受到抑制, 匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆中受抑制程度更为明显 ( 图源 ) 圆援缘摇陨蕴鄄员 β 圆反义砸晕粤表达载体对肿瘤生长的影响用陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤表达载体转染的匀圆圆细胞构建荷瘤小鼠, 每隔圆凿观察肿瘤的形成时间 生长速度等 ( 图缘 ) 匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员 匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆组与匀圆圆辕皂燥糟噪组小鼠比较, 匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆组肿瘤体积较小, 生长缓慢, 说明陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤可显著抑制肝癌移植瘤的生长 圆援远摇 陨蕴鄄员 β 圆反义砸晕粤表达载体对荷瘤小鼠脾脏 晕运细胞杀伤活性的影响 酝栽栽实验显示, 匀圆圆辕葬灶贼蚤鄄陨蕴鄄员 β 员和匀圆圆辕葬灶贼蚤鄄陨蕴鄄员 β 圆组与对照组相比, 荷瘤小鼠脾脏分离的晕运 细胞对靶细胞匀圆圆的杀伤活性明显提高, 其中以 匀圆圆辕葬灶贼蚤鄄陨蕴鄄员 β 圆组荷瘤小鼠晕运细胞的效果更为显著, 在效靶比圆园颐员时杀伤率升高了约圆愿援园源豫, 在效靶比源园颐员时升高了约缘园援苑猿豫 ( 图远 ) 猿摇讨摇论 [ 源 ] 研究表明, 全身或局部炎症可以使癌细胞更具有攻击性, 慢性炎症产生一种癌前微环境 炎性浸润能产生大量的促炎性因子, 如栽晕云鄄 α 陨蕴鄄员等 陨蕴鄄员 家族中主要包括陨蕴鄄员 α 陨蕴鄄员 β 和陨蕴鄄员砸葬, 与肿瘤的发 [ 缘 ] 生和发展关系最密切的是陨蕴鄄员 β 研究表明, 陨蕴鄄员 β 能增强肿瘤侵袭力, 促进肿瘤血管的形成, 并能引发 [ 远 ] 机体的免疫抑制 粤责贼藻等认为由微环境或恶性细胞过度表达的陨蕴鄄员 β 通过促进局部炎症反应致癌, 诱 [ 苑 ] 导肿瘤细胞增殖并转移 杂葬蚤躁燥等将陨蕴鄄员 β 转染 蕴藻憎蚤泽肺癌细胞 ( 蕴蕴悦辕陨蕴鄄员 β), 检测蕴蕴悦辕陨蕴鄄员 β 分泌的灾耘郧云和酝陨孕鄄圆生成增多 ; 利用蕴蕴悦辕陨蕴鄄员 β 构建的

5 刘艳艳, 等援肝癌细胞特异性陨蕴鄄员 β 反义砸晕粤对小鼠移植肝癌的抑制 圆缘苑 荷瘤小鼠体内, 肿瘤内的匀郧云表达明显增多, 用抗血管生成制剂栽晕孕鄄源苑园可以抑制蕴蕴悦辕陨蕴鄄员 β 肿瘤细胞的生长 月员远小鼠黑素瘤模型体内, 来源于基质的 陨蕴鄄员 β 可以促进黑素瘤的肝转移, 脾内注射陨蕴鄄员 β 则能提高肝转移率 ; 而在陨蕴鄄员 β 敲除的小鼠体内, 肝转 [ 愿移减少 ; 陨悦耘敲除的小鼠体内, 肝转移完全被抑制 ] [ 怨 ] 再葬皂葬灶葬噪葬等也证实, 在胃癌细胞郧悦栽酝鄄员中陨蕴鄄员 β 能增强细胞的侵袭力 陨蕴鄄员 β 还能启动纤维肉瘤细胞 [ 员园中的炎症反应, 促进细胞的生长 ] [ 猿 ] 研究表明, 匀月灾感染患者 肝癌患者血清中陨蕴鄄员 β 表达水平均明 [ 员员 ] 显升高 本研究前期实验也证实该因子具有促进肝癌细胞生长和行为恶化的作用, 提示该因子与肝癌的关系密切 本实验中, 为了增加陨蕴鄄员 β 表达的组织特异性, 首先构建了能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达的真核载体, 随后建立小鼠体内移植瘤模型, 观察靶向阻断陨蕴鄄员 β 对肿瘤细胞增殖 浸润和免疫杀伤敏感性影响 图远摇反义砸晕粤表达载体对荷瘤鼠脾脏晕运细胞杀伤活性的影响 云蚤早援远摇耘枣枣藻糟贼燥枣陨蕴鄄员 β 葬灶贼蚤鄄泽藻灶泽藻砸晕粤藻曾责则藻泽泽蚤燥灶增藻糟贼燥则燥灶糟赠贼燥贼燥糟蚤曾蚤贼赠燥枣泽责造藻藻灶晕运蚤灶贼怎皂燥则蚤皂责造葬灶贼藻凿灶怎凿藻皂蚤糟藻 孕约园援园缘, 孕约园援园员增泽匀圆圆辕皂燥糟噪早则燥怎责 摇摇反义砸晕粤 ( 葬灶贼蚤泽藻灶泽藻砸晕粤 ) 技术就是指利用基因重组技术构建表达载体, 使其离体或体内表达能够与靶基因皂砸晕粤特异结合的反义砸晕粤, 从而达到封闭或抑制靶基因表达, 进而实现对基因功能调控的技术 本研究中设计陨蕴鄄员的反义砸晕粤时选取了两个潜在靶点 : 陨蕴鄄员 β 员针对陨蕴鄄员 β 皂砸晕粤的缘鸳端, 跨越粤栽郧起始密码子, 通过互补结合可抑制陨蕴鄄员 β 前体蛋白的翻译 ; 陨蕴鄄员 β 圆跨越了陨悦耘的剪切位点, 可以抑制前体蛋白的剪切, 阻碍成熟蛋白的分泌 上述片段与构建的肝癌特异性表达载体责葬枣责陨砸耘杂圆鄄耘郧云孕连接后, 形成能够在肝癌细胞中特异性表达的重组载体, 该载体的优势在于 : 能够提高目的基因在特定的靶细胞即肝癌细胞中的表达水平, 最大程 度地减少对正常组织的毒性作用 研究证明, 上述载体转染后, 在匀圆圆细胞中能够高水平表达两段反义砸晕粤序列, 同时细胞中陨蕴鄄员 β 的水平明显下降, 尤以责葬枣责陨砸耘杂圆鄄葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆组下降更为明显 ; 其转染匀圆圆细胞之后构建移植瘤小鼠, 与匀圆圆辕皂燥糟噪对照组相比, 匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 员和匀圆圆辕葬灶贼蚤陨蕴鄄员 β 圆实验组荷瘤小鼠体内晕运细胞介导的杀伤活性升高, 小鼠肿瘤生长减慢, 表明构建的载体具有较好的靶向阻断效果, 但其确切机制还有待于深究 [ 参考文献 ] [ 员 ] 摇悦燥怎泽泽藻灶泽蕴酝, 宰藻则遭在援陨灶枣造葬皂皂葬贼蚤燥灶葬灶凿糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援晕葬贼怎则藻, 圆园园圆, 源圆园 ( 远怨员苑 ): 愿远园鄄愿远苑援 [ 圆 ] 摇耘造葬则葬躁阅酝, 宰藻蚤灶则藻蚤糟澡阅酝, 灾葬则早澡藻泽藻杂, 藻贼葬造援栽澡藻则燥造藻燥枣蚤灶贼藻则鄄造藻怎噪蚤灶鄄员蚤灶早则燥憎贼澡葬灶凿皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽燥枣澡怎皂葬灶糟葬灶糟藻则曾藻灶燥早则葬枣贼泽 [ 允 ] 援悦造蚤灶悦葬灶糟藻则砸藻泽, 圆园园远, 员圆 ( 源 ): 员园愿愿鄄员园怨远援 [ 猿 ] 摇匀蚤则葬灶噪葬则灶晕, 运蚤皂噪燥灶早陨, 运怎皂皂藻藻孕, 藻贼葬造援陨灶贼藻则造藻怎噪蚤灶鄄员 β 早藻灶藻责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿憎蚤贼澡澡藻责葬贼燥糟藻造造怎造葬则糟葬则糟蚤灶燥皂葬蚤灶澡藻责葬贼蚤贼蚤泽月增蚤则怎泽蚤灶枣藻糟贼蚤燥灶 [ 允 ] 援宰燥则造凿允郧葬泽贼则燥藻灶贼藻则燥造, 圆园园远, 员圆 ( 缘 ): 苑苑远鄄苑苑怨援 [ 源 ] 摇晕葬皂遭怎粤, 晕葬噪葬藻杂, 陨憎葬噪怎则葬再援陨蕴鄄员遭藻贼葬, 遭怎贼灶燥贼陨蕴鄄员葬造责澡葬, 蚤泽则藻择怎蚤则藻凿枣燥则葬灶贼蚤早藻灶鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟栽糟藻造造葬糟贼蚤增葬贼蚤燥灶葬灶凿贼澡藻蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶燥枣造燥糟葬造蚤灶枣造葬皂皂葬贼蚤燥灶蚤灶贼澡藻凿藻造葬赠藻凿鄄贼赠责藻澡赠责藻则泽藻灶泽蚤贼蚤增蚤贼赠则藻泽责燥灶泽藻泽 [ 允 ] 援陨灶贼陨皂皂怎灶燥造, 圆园园远, 员愿 ( 缘 ): 苑园员鄄苑员圆援 [ 缘 ] 摇杂燥灶早载, 灾燥则燥灶燥增耘, 阅增燥则噪蚤灶栽, 藻贼葬造援阅蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬造藻枣枣藻糟贼泽燥枣陨蕴鄄员 α 葬灶凿陨蕴鄄员 β 燥灶贼怎皂燥则蚤早藻灶蚤糟蚤贼赠责葬贼贼藻则灶泽葬灶凿蚤灶增葬泽蚤增藻灶藻泽泽 [ 允 ] 援允陨皂皂怎灶燥造, 圆园园猿, 员苑员 ( 圆 ): 远源源愿鄄远源缘远援 [ 远 ] 摇粤责贼藻砸晕, 阅燥贼葬灶杂, 耘造噪葬遭藻贼泽酝, 藻贼葬造援栽澡藻蚤灶增燥造增藻皂藻灶贼燥枣陨蕴鄄员 β 蚤灶贼怎皂燥则蚤早藻灶藻泽蚤泽, 贼怎皂燥则蚤灶增葬泽蚤增藻灶藻泽泽, 皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽葬灶凿贼怎皂燥则鄄澡燥泽贼蚤灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶泽 [ 允 ] 援悦葬灶糟藻则酝藻贼葬泽贼葬泽蚤泽砸藻增, 圆园园远, 圆缘 ( 猿 ): 猿愿苑鄄源园愿援 [ 苑 ] 摇杂葬蚤躁燥再, 栽葬灶葬噪葬酝, 酝蚤噪蚤酝, 藻贼葬造援孕则燥蚤灶枣造葬皂皂葬贼燥则赠糟赠贼燥噪蚤灶藻陨蕴鄄员遭藻贼葬责则燥皂燥贼藻泽贼怎皂燥则早则燥憎贼澡燥枣蕴藻憎蚤泽造怎灶早糟葬则糟蚤灶燥皂葬遭赠蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶燥枣葬灶早蚤燥早藻灶蚤糟枣葬糟贼燥则泽 : 蚤灶增蚤增燥葬灶葬造赠泽蚤泽燥枣贼怎皂燥则鄄泽贼则燥皂葬造蚤灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶 [ 允 ] 援允陨皂皂怎灶燥造, 圆园园圆, 员远怨 ( 员 ): 源远怨鄄源苑缘援 [ 愿 ] 摇再葬灶燥杂, 晕燥噪蚤澡葬则葬匀, 再葬皂葬皂燥贼燥粤, 藻贼葬造援酝怎造贼蚤枣怎灶糟贼蚤燥灶葬造蚤灶贼藻则鄄造藻怎噪蚤灶鄄员 β 责则燥皂燥贼藻泽皂藻贼葬泽贼葬泽蚤泽燥枣澡怎皂葬灶造怎灶早糟葬灶糟藻则糟藻造造泽蚤灶杂悦陨阅皂蚤糟藻增蚤葬藻灶澡葬灶糟藻凿藻曾责则藻泽泽蚤燥灶燥枣葬凿澡藻泽蚤燥灶鄄 κ 月, 蚤灶增葬泽蚤燥灶鄄葬灶凿葬灶鄄早蚤燥早藻灶藻泽蚤泽鄄则藻造葬贼藻凿皂燥造藻糟怎造藻泽 [ 允 ] 援悦葬灶糟藻则杂糟蚤, 圆园园猿, 怨源 ( 猿 ): 圆源源鄄圆缘圆援 [ 怨 ] 摇再葬皂葬灶葬噪葬晕, 酝燥则蚤泽葬噪蚤栽, 晕葬噪葬泽澡蚤皂葬匀, 藻贼葬造援陨灶贼藻则造藻怎噪蚤灶鄄员 β 藻灶澡葬灶糟藻泽蚤灶增葬泽蚤增藻葬遭蚤造蚤贼赠燥枣早葬泽贼则蚤糟糟葬则糟蚤灶燥皂葬贼澡则燥怎早澡灶怎糟造藻葬则枣葬糟贼燥则鄄 κ 月葬糟贼蚤增葬贼蚤燥灶 [ 允 ] 援悦造蚤灶悦葬灶糟藻则砸藻泽, 圆园园源, 员园 ( 缘 ): 员愿缘猿鄄员愿缘怨援 [ 员园 ] 晕葬扎葬则藻灶噪燥陨, 酝葬则澡葬遭葬砸, 砸藻蚤糟澡耘, 藻贼葬造援栽怎皂燥则蚤早藻灶蚤糟蚤贼赠燥枣陨蕴鄄员 α 葬灶凿陨蕴鄄员 β 鄄凿藻枣蚤糟蚤藻灶贼枣蚤遭则燥泽葬则糟燥皂葬糟藻造造泽 [ 允 ] 援晕藻燥责造葬泽蚤葬, 圆园园愿, 员园 ( 远 ): 缘源怨鄄缘远圆援 [ 员员 ] 肖伟玲, 梁淑娟, 牟东珍, 等援小鼠陨蕴鄄员 β 在匀圆圆细胞的表达及对晕运细胞杀伤活性的影响 [ 允 ], 细胞与分子免疫学杂志, 圆园园苑, 圆猿 ( 员圆 ): 员员猿园鄄员员猿圆援 [ 收稿日期 ] 摇圆园园怨原园猿原园怨 [ 修回日期 ] 摇圆园园怨原园缘原员员 [ 本文编辑 ] 摇韩摇丹