胡春晓, 等援肿瘤过继免疫治疗临床级抗原特异性栽细胞的研究进展 员园缘 使用悦阅猿单抗 ( 韵运栽鄄猿 ) 活化栽细胞, 效果不佳 ; 之 [ 缘 ] 后, 砸蚤凿凿藻造造等提出联合悦阅猿单抗 γ 鄄辐照异体外周血单核细胞辕临床级耘月病毒转化的成淋巴饲养细胞 ( 孕月酝悦泽辕蕴悦蕴枣藻藻凿藻则糟藻造

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1 员园源 中国肿瘤生物治疗杂志摇澡贼贼责 : 辕辕憎憎憎援遭蚤燥贼澡藻则援燥则早悦澡蚤灶允悦葬灶糟藻则月蚤燥贼澡藻则, 云藻遭援圆园员源, 灾燥造援圆员, 晕燥援员 阅韵陨 : 员园援猿愿苑圆辕躁援蚤泽泽灶援员园园苑鄄猿愿缘载援圆园员源援园员援园员愿 综摇述 肿瘤过继免疫治疗临床级抗原特异性栽细胞的研究进展 孕则燥早则藻泽泽燥枣糟造蚤灶蚤糟葬造早则葬凿藻葬灶贼蚤早藻灶鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟栽糟藻造造泽枣燥则糟葬灶糟藻则葬凿燥责贼蚤增藻蚤皂皂怎灶燥贼澡藻则葬责赠 员员员圆胡春晓, 冯鹏飞综述 ; 韩双印, 朱武凌审阅 ( 员援郑州大学人民医院消化内科, 河南郑州源缘园园园猿 ; 圆援新乡医学院基础医学院, 河南新乡源缘猿园园猿 ) [ 摘摇要 ] 摇抗原特异性栽细胞是肿瘤过继免疫治疗的核心, 靶向性强 杀伤活性高 毒性作用小 疗效卓越的临床级细胞的制备是提高治疗效果的关键 近年来, 全封闭自动化栽细胞分离系统提高了安全性, 新型人工抗原提呈方法和 γ 糟家族细胞因子增加了栽细胞扩增效率, 低分化表型栽细胞的选择提高了有效性, 而栽细胞受体和嵌合抗原受体基因修饰赋予栽细胞抗原特异性杀伤性能, 病毒基因转导和理化基因转染栽细胞方法的不断改进为基因修饰重定向栽细胞的抗原特异性提供了保障 越来越多的临床试验展示了令人鼓舞的治疗效果, 为肿瘤过继免疫治疗注入了新的生命力 [ 关键词 ] 摇过继免疫治疗 ; 基因修饰 ; 栽细胞受体 ; 嵌合抗原受体 [ 中图分类号 ] 摇砸苑猿园援缘员 ; 砸猿怨圆援员摇摇摇摇 [ 文献标志码 ] 摇粤摇摇摇摇 [ 文章编号 ] 摇员园园苑鄄猿愿缘载 ( 圆园员源 ) 园员鄄园员园源鄄园缘 摇摇过继免疫治疗 ( 葬凿燥责贼蚤增藻蚤皂皂怎灶燥贼澡藻则葬责赠, 粤陨栽 ) 作为肿瘤治疗方法之一, 经历了猿园年的风雨历程 多年来研究者一直致力于提高过继转移栽细胞的靶向性 杀伤性和持久性, 期望通过制备临床级抗原特异性栽细胞, 穿越肿瘤的多重保护屏障, 实现对肿瘤细胞的致命追杀 近年来随着肿瘤免疫学理论的发展和技术的进步, 从栽细胞的分离 活化与扩增, 栽细胞亚群治疗潜能的发掘, 到基因修饰栽细胞, 都为放飞攻克肿瘤的梦想带来了机遇, 期待过继 [ 员免疫治疗为肿瘤治疗带来新的惊喜 ] 员摇 员援员摇 栽细胞的分离 活化与扩增 栽细胞的分离 怨正常人外周血含有 ( 缘耀耀耀耀耀耀员圆援缘 ) 伊员园个栽淋巴怨垣细胞, 包括 ( 圆援缘耀耀耀耀耀耀愿援源 ) 伊员园悦阅源栽个细胞和怨垣 ( 员援缘耀耀耀耀耀耀源郾缘 ) 伊员园悦阅愿个栽淋巴细胞, 并稳定维持 垣垣悦阅源辕悦阅愿细胞的生理比例在员援缘左右 栽淋巴细胞中, 源缘豫为初始栽细胞 ( 灶葬蚤增藻栽糟藻造造, 栽晕 ), 圆豫为干细胞样记忆栽细胞 ( 泽贼藻皂糟藻造造鄄造蚤噪藻皂藻皂燥则赠栽糟藻造造, 栽杂悦酝 ), 员缘豫为中枢记忆栽细胞 ( 糟藻灶贼则葬造皂藻皂燥则赠栽糟藻造造, 栽悦酝 ) 和猿愿豫为效应记忆栽细胞 ( 藻枣枣藻糟贼燥则皂藻皂燥鄄则赠栽糟藻造造, 栽耘酝 ) [ 圆 ] 不断增多的证据表明, 体外扩增前对潜在最有效的栽细胞亚群进行精确的检测和分离能提高肿瘤粤陨栽的疗效, 因此, 分离纯化特定表型的栽细胞逐渐受到重视 传统的单个核细胞分离方法 密度梯度离心法 ( 云蚤糟燥造造或孕藻则糟燥造造分层液栽酝法 ) 和半自动化细胞处理系统 ( 如悦赠贼燥酝葬贼藻和 栽酝耘造怎贼则葬 ) 均不能有效地分离出特定表型的栽细胞亚 群, 现在多使用免疫磁珠分选仪 ( 如陨泽燥造藻曾猿园园蚤和 悦造蚤灶蚤鄄酝粤悦杂 ) 流式细胞仪 ( 枣造怎燥则藻泽糟藻灶糟藻鄄葬糟贼蚤增葬贼藻凿糟藻造造泽燥则贼藻则, 云粤悦杂 ) 以及微流体细胞分选设备 ( 郧蚤早葬鄄栽酝泽燥则贼 ), 通过特异性单克隆抗体或抗原肽鄄匀蕴粤 Ⅰ 复合物识别细胞表面特异性标志物筛选出特定栽细 [ 猿 ] 胞亚群 研究表明, 识别和选择悦阅远圆 悦悦砸和 悦阅源缘亚型 ( 悦阅源缘砸粤表达于幼稚辕非活化栽细胞, 悦阅源缘砸韵表达于记忆辕活化栽细胞 ) 的单克隆抗体分澡蚤垣垣选出的栽悦酝 ( 悦阅远圆悦悦砸苑悦阅源缘砸韵 ), 因其具有良好的归巢 增殖 应答能力, 为肿瘤粤陨栽提供了能在体内长期生存的免疫细胞来源 此外, 通过定量聚合酶链式反应, 筛选体外致敏的 高表达细胞因子的患者外周血淋巴细胞克隆, 亦成为一种分离抗原特 [ 源异性栽细胞的新途径 ] 员援圆摇 栽细胞的活化 栽细胞活化需要栽悦砸辕悦阅猿复合物以及共刺激分子的双信号刺激 体外的栽细胞活化, 起初单独 [ 基金项目 ] 摇国家自然科学基金资助项目 ( 晕燥援愿员员苑圆源员缘, 晕燥援愿员圆源员园苑苑 ), 河南省医学重点科技攻关项目 ( 晕燥援圆园员园园圆园员源 ) 孕则燥躁藻糟贼泽怎责责燥则贼藻凿遭赠贼澡藻晕葬贼蚤燥灶葬造晕葬贼怎则葬造杂糟蚤藻灶糟藻云燥怎灶凿葬贼蚤燥灶燥枣悦澡蚤灶葬 ( 晕燥援愿员员苑圆源员缘, 晕燥援愿员圆源员园苑苑 ), 葬灶凿贼澡藻运藻赠酝藻凿蚤糟葬造杂糟蚤藻灶贼蚤枣蚤糟孕则燥躁藻糟贼燥枣匀藻灶葬灶孕则燥增蚤灶糟藻 ( 晕燥援圆园员园园圆园员源 ) [ 作者简介 ] 摇胡春晓 ( 员怨愿怨原 ), 女, 浙江省金华人, 硕士生, 主要从事肿瘤生物治疗基础研究, 耘鄄皂葬蚤造 : 澡糟曾猿员怨岳员远猿援糟燥皂 冯鹏飞 ( 员怨愿怨原 ), 男, 河南省驻马店人, 硕士生, 主要从事肿瘤生物治疗基础研究, 耘鄄皂葬蚤造 : 枣藻灶早责藻灶早枣藻蚤灶岳员远猿援糟燥皂 [ 通信作者 ] 摇韩双印 ( 匀葬灶杂澡怎葬灶早赠蚤灶, 糟燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早葬怎贼澡燥则 ), 耘鄄皂葬蚤造 : 泽澡怎葬灶早赠蚤灶澡葬灶岳扎扎怎援藻凿怎援糟灶 ; 朱武凌 ( 在澡怎宰怎造蚤灶早, 糟燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早葬怎鄄贼澡燥则 ), 耘鄄皂葬蚤造 : 憎怎造蚤灶早扎澡怎圆园园怨岳员圆远援糟燥皂

2 胡春晓, 等援肿瘤过继免疫治疗临床级抗原特异性栽细胞的研究进展 员园缘 使用悦阅猿单抗 ( 韵运栽鄄猿 ) 活化栽细胞, 效果不佳 ; 之 [ 缘 ] 后, 砸蚤凿凿藻造造等提出联合悦阅猿单抗 γ 鄄辐照异体外周血单核细胞辕临床级耘月病毒转化的成淋巴饲养细胞 ( 孕月酝悦泽辕蕴悦蕴枣藻藻凿藻则糟藻造造泽 ) 和陨蕴鄄圆活化 快速扩增栽细胞方法 ( 则葬责蚤凿藻曾责葬灶泽蚤燥灶皂藻贼澡燥凿, 砸耘酝 ), 该方法已经应用于淋巴瘤 神经胶质瘤 成神经细胞瘤和病毒性疾病的 Ⅰ 辕 Ⅱ 期过继免疫治疗临床研究 然而, 维护饲养细胞费用昂贵, 限制了临床的广泛应用 近年, 研究人员尝试用人工抗原提呈细胞 ( 葬则贼蚤鄄枣蚤糟蚤葬造葬灶贼蚤早藻灶鄄责则藻泽藻灶贼蚤灶早糟藻造造泽, 葬粤孕悦泽 ) 取代孕月酝悦辕 [ 远蕴悦蕴饲养细胞 ] 葬粤孕悦泽能提供栽细胞活化的双信号, 有效地活化栽细胞并提高其持续增殖能力 稳定表达云糟 γ 砸 Ⅱ 和源鄄员月月蕴的运缘远圆细胞株 ( 又名运猿圆 细胞 ), 表面偶联悦阅猿与悦阅圆愿单抗后即构成葬粤孕悦泽 ( 运猿圆辕源鄄员月月蕴辕悦阅猿辕悦阅圆愿 ), 已证明能促进栽细胞分泌陨蕴鄄圆和陨蕴鄄员缘, 维持悦栽蕴的持续扩增 此外, 多种新的葬粤孕悦泽制备方法被建立并成功用于临床试验, 如悦阅猿辕悦阅圆愿免疫磁珠在体外对栽细胞扩增达 [ 苑员园园园园倍以上 ] ; 用脂质体构建的葬粤孕悦泽能与栽细 [ 愿胞形成免疫突触, 从而活化栽细胞 ] 然而, 葬粤孕悦泽 垣优先扩增悦阅源栽细胞, 需要提供抗原特异性再刺激垣以提高悦阅愿栽细胞的优势扩增 员援猿摇 栽细胞的扩增 肿瘤粤陨栽的疗效与过继转移栽细胞的数量相关, 长期以来人们一直致力于体外临床级栽细胞的制备 细胞因子对栽细胞的体外扩增 分化以及体内的抗肿瘤活性有重要作用 陨蕴鄄圆是栽细胞体外扩增最常用的细胞因子, 但大剂量使用陨蕴鄄圆会导致过继转移后迟发效应细胞的生长, 终末分化的栽细胞长期抗肿瘤作用不佳 近年发现, 陨蕴鄄圆可能通过耗竭记忆性栽细胞和增加调节性栽细胞 ( 则藻早怎造葬贼燥则赠栽 [ 怨糟藻造造, 栽则藻早 ) 产生负面效应 ], 而 γ 糟家族细胞因子 ( 共有 γ 糟澡葬蚤灶 ) 如陨蕴鄄苑 陨蕴鄄员缘及陨蕴鄄圆员等可能发挥更强 垣更持久的扩增栽细胞能力, 尤其对悦阅愿记忆栽细 [ 员园胞 ] 陨蕴鄄员缘通过 β 链介导允葬噪员和允葬噪猿信号通路促进栽细胞增殖, 还能阻止云葬泽诱导的栽细胞凋亡 ( 云葬泽鄄蚤灶凿怎糟藻凿葬责燥责贼燥泽蚤泽 ); 陨蕴鄄员缘 α 受体可减少活化诱导的细胞死亡 ( 葬糟贼蚤增葬贼蚤燥灶蚤灶凿怎糟藻凿糟藻造造凿藻葬贼澡, 粤陨悦阅 ); 垣陨蕴鄄员缘扩增的初始悦阅愿栽细胞能产生表型 功能和代谢上类似栽悦酝的细胞, 回输患者体内后表现出比 [ 员员陨蕴鄄圆扩增的栽耘酝细胞更佳的增殖和抗肿瘤效应 ] 同样, 陨蕴鄄圆员通过活化允粤运鄄杂栽粤栽信号通路, 促进肿垣瘤特异性悦阅愿栽细胞大量增殖并保留低分化表型, 动物实验中表现出比陨蕴鄄圆和陨蕴鄄员缘扩增的栽细胞更 [ 员圆强的抗肿瘤能力 ] 此外, 一些调节栽细胞分化通 路 ( 孕陨猿运鄄粤运栽鄄皂栽韵砸和宰灶贼鄄 β 连环蛋白通路 ) 的小分子也被评价 : 如帕雷霉素通过抑制转录因子栽鄄遭藻贼 垣阻断皂栽韵砸信号通路, 促进悦阅愿记忆栽细胞形成 ; 郧杂运猿 β 拮抗剂栽宰杂员员怨或重组宰晕栽蛋白可增强 [ 员猿鄄员源宰晕栽鄄 β 信号通路 促进栽杂悦酝及栽悦酝的形成 ] 总之, 选择 γ 糟家族细胞因子结合关键信号通路的调节小分子可保持增殖栽细胞低分化状态, 可能成为临床级栽细胞制备的关键, 但是需要更多的实验研究证实 圆摇 栽细胞亚群的治疗潜能 多年来大多数过继免疫治疗使用未经分选的 垣垣垣悦阅猿栽细胞 ( 包括抗原特异性悦阅源辕悦阅愿栽细胞 ), 然而混合栽细胞的异质性和多克隆性可能会影响肿瘤粤陨栽的效应和安全性, 选择最佳治疗潜能的栽细胞会对治疗产生积极的影响 那么, 哪种栽 细胞亚群具有最好的治疗效果呢? 垣垣悦阅愿栽细胞一般分为悦阅源缘砸粤初始栽细胞垣 ( 栽晕 ) 和接触抗原后增殖的悦阅源缘砸韵记忆栽细胞垣 ( 包括栽悦酝和栽耘酝亚群 ) 研究发现, 悦阅愿栽细胞在体外反复刺激分化成早 中 晚猿期效应栽细胞 ( 藻枣鄄枣藻糟贼燥则栽糟藻造造, 栽耘耘云 ), 中晚期栽耘云云回输后, 其扩增和存活能力尤其是引起肿瘤回缩能力不如栽晕和早期 垣栽耘云云 为探讨过继转移的悦阅愿记忆栽细胞亚群介导肿瘤应答的能力, 研究者将接种肿瘤细胞的小鼠模型分别输注不同亚群的栽细胞, 结果显示在体内 栽悦酝比栽耘酝有更持久的存活时间和更佳的抗肿瘤效 [ 员缘应 ] 尽管两种记忆栽细胞在回输初期均表现出肿瘤回缩的作用, 然而只有栽悦酝能诱导完全反应, 接受栽耘酝的小鼠最终死于不可控制的肿瘤, 上述抗肿瘤效应的不同是因为栽悦酝在体内能够自我更新并分 [ 员远化成效应细胞, 而栽耘酝无此特性 ] [ 员苑 ] 月藻则早藻则等使 [ 员愿 ] 用悦酝灾感染的灵长类动物模型 宰澡藻则则赠等使用 蕴悦酝灾感染的小鼠模型也都证实了以上观点 随后 [ 员怨 ] 郧葬贼贼蚤灶燥灶蚤等发现一种兼有干细胞和记忆细胞特性的栽细胞亚群 ( 栽杂悦酝 ), 能够自我更新并分化出 栽耘云云 栽悦酝和栽耘酝 栽杂悦酝具有类似栽晕 造燥憎的表型悦阅源源 澡蚤早澡悦阅远圆蕴, 还表达杂糟葬鄄员 月糟造鄄圆 陨蕴鄄圆砸 β 和悦载悦砸猿, 已经证明栽杂悦酝比栽悦酝和栽耘酝具有更强的抗肿瘤效能 如果把缩减肿瘤的有效性作为输注栽细胞亚群的功能来评价, 发现栽细胞分化状态和抗肿瘤效能之间存在着一种明显的线性关系即 : 栽杂悦酝跃栽悦酝跃 [ 圆园栽耘酝 ] 垣 以上数据表明过继转移低分化悦阅愿栽细胞亚群与临床抗肿瘤反应具有相关性, 因此未来的

3 员园远 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园员源年圆月, 圆员 ( 员 ) 过继免疫治疗临床级抗原特异性细胞支持应用低分垣化的悦阅远圆蕴栽杂悦酝 栽悦酝亚群, 而非悦阅远圆蕴鄄栽耘酝 栽耘云云 猿摇 栽细胞的抗原特异性修饰 过继转移栽细胞的肿瘤靶向性与粤陨栽疗效密切相关, 临床级抗原特异性栽细胞的制备面临很大的挑战 近年来, 利用肿瘤特异性栽细胞受体 ( 栽糟藻造造则藻糟藻责贼燥则, 栽悦砸 ) 和嵌合抗原受体 ( 糟澡蚤皂藻则蚤糟葬灶贼蚤早藻灶则藻鄄糟藻责贼燥则, 悦粤砸 ) 修饰栽细胞, 赋予栽细胞肿瘤抗原特异性, 使栽细胞有效地识别并杀伤肿瘤细胞 猿援员摇 栽悦砸修饰栽细胞 栽细胞的抗原特异性主要由栽悦砸决定, 识别肿瘤相关抗原或特异抗原的的栽悦砸基因 α 辕 β 链可从高亲和力的人栽细胞或从接种了肿瘤抗原的人源化小鼠栽细胞中分离, 将其克隆入载体修饰栽细胞, 赋予其肿瘤特异性杀伤作用 圆园园远年 [ 圆员 ] 酝燥则早藻灶等采用黑素瘤分化抗原 ( 酝粤砸栽鄄员 ) 特异性栽悦砸转染淋巴细胞陨期临床试验治疗员苑例转移性黑素瘤, 员缘例过继转移患者外周血可检测到超过员园豫的基因修饰栽细胞持续存在, 圆例患垣者员年后仍可检测到栽悦砸栽细胞 虽然这项临床试验患者肿瘤应答率不如肿瘤侵润淋巴细胞 ( 贼怎皂燥则蚤灶枣蚤造贼则葬贼蚤灶早造赠皂责澡燥糟赠贼藻, 栽陨蕴 ) 高, 但为基因修饰栽细胞免疫治疗奠定了基础 随后的肿瘤睾丸抗原 ( 晕再鄄耘杂韵鄄员 ) 特异性栽悦砸过继免疫治疗临床试验表现出较好的临床效果, 对员员例高表达晕再鄄耘杂韵鄄员的黑素瘤患者进行回输治疗, 缘例 [ 圆圆患者的症状得到改善 ] 此外, 黑素瘤相关抗原 ( 早责鄄员园园 ) 癌胚抗原 ( 悦耘粤 ) 和宰蚤造皂泽鸳肿瘤基因蛋白 ( 宰栽鄄员 ) 等肿瘤抗原的特异性栽悦砸基因也被 [ 圆猿用于修饰栽细胞提高靶向性 ] 然而栽悦砸基因修饰栽细胞肿瘤免疫治疗存在一些缺陷, 如许多肿瘤通过下调或缺失酝匀悦免疫逃逸 ; 需要对每位患者匀蕴粤等位基因进行测定, 以保证栽悦砸抗原特异性识别 ; 基因转导的外源性栽悦砸链与内源性栽悦砸链间的错配, 可能导致对宿主正常组织的 [ 圆源破坏 ] 研究人员正通过增加半胱氨酸残基以形成更多的链间二硫键 选择特定的栽细胞亚群如缺乏 αβ 链的 γδ 栽细胞或病毒特异性栽细胞作为基因修饰的细胞, 以提高有效性和安全 [ 圆缘性 ] 猿援圆摇 悦粤砸修饰栽细胞 [ 圆远 ] 嵌合抗原受体是耘泽澡澡葬则研究小组于员怨愿怨 年首次提出, 由识别肿瘤表面抗原的单链抗体 ( 泽蚤灶早造藻糟澡葬蚤灶增葬则蚤葬遭造藻枣则葬早皂藻灶贼, 杂糟云增 ) 和栽细胞活 化基序组成, 以非酝匀悦限制的方式结合肿瘤抗原, 启动并活化下游级联反应, 特异性杀伤肿瘤细胞 第一代悦粤砸由肿瘤抗原特异性杂糟云增和免疫受体酪氨酸活化基序 ( 陨栽粤酝 ) 构成, 第二代和三代悦粤砸引入了共刺激分子, 如悦阅圆愿 源鄄员月月 ( 悦阅员猿苑 ) 韵载源园 ( 悦阅员猿源 ) 和陨悦韵杂 ( 蚤灶凿怎糟蚤遭造藻糟燥泽鄄垣贼蚤皂怎造葬贼燥则 ) 等, 旨在提高过继转移悦粤砸栽细胞的 [ 圆苑杀伤性持久性 ] 悦粤砸修饰栽细胞的抗肿瘤作用在众多的体外试验和动物实验中得到证实, 临床疗效和安全性正在进行之中 ( 憎憎憎援糟造蚤灶蚤糟葬造贼则蚤鄄垣葬造泽援早燥增 ) 悦粤砸栽细胞在血液系恶性肿瘤的临 [ 圆愿 ] 床试验成绩卓著 允怎灶藻研究小组用第二代 悦阅员怨鄄悦粤砸 ( 杂糟云增悦阅员怨鄄悦阅员猿苑鄄悦阅猿 ζ) 修饰栽细胞治疗慢性淋巴细胞白血病 ( 悦澡则燥灶蚤糟造赠皂责澡燥糟赠贼蚤糟造藻怎噪藻皂蚤葬, 悦蕴蕴 ), 接受治疗的猿例患者圆例达完全垣缓解 ( 糟燥皂责造藻贼藻则藻泽责燥灶泽藻, 悦砸 ), 悦粤砸栽细胞在体内扩增超过员园园园倍, 维持有效治疗活性达远个垣月以上, 部分悦粤砸栽细胞甚至以记忆细胞形式存在 来自苑个研究中心的结果表明, 悦阅员怨鄄悦粤砸修饰的栽细胞治疗白血病和淋巴瘤的悦砸 率达圆缘豫 [ 圆怨 ] 此外, 靶向悦阅圆园 悦阅圆圆 悦阅猿园 垣悦阅猿猿的悦粤砸栽细胞在血液系肿瘤治疗作用也在研究之中 悦粤砸修饰栽细胞在实体肿瘤的临床研究中也取得了进展 靶向二唾液酸神经节苷脂 ( 凿蚤泽蚤葬造燥早葬灶早造蚤燥泽蚤凿藻, 郧阅圆 ) 和蕴员细胞黏附分垣子 ( 蕴员悦酝 ) 的悦粤砸栽细胞 Ⅰ 辕 Ⅱ 期临床试验治 [ 猿园 ] 疗儿童成神经细胞瘤, 蕴燥怎蚤泽等用第一代郧阅圆鄄悦粤砸修饰耘月病毒反应性栽细胞治疗员员例患者中猿例出现悦砸 尽管悦粤砸修饰栽细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景, 但临床试验也出现了细胞因子风暴 ( 糟赠贼燥噪蚤灶藻泽贼燥则皂 ) 脱靶效应 ( 燥枣枣鄄泽蚤贼藻燥灶鄄贼葬则早藻贼藻枣枣藻糟贼 ) 和移植物抗宿主病等潜在的风险, 研究者正在采取措施克服安全性问题 源摇 栽细胞基因转导方法 高效与安全的基因转导方法对临床级肿瘤抗原特异性栽细胞的制备非常重要 因为体外扩增栽 细胞是粤陨栽治疗的必要步骤, 稳定的染色体嵌入式基因修饰方法将会优于短暂或瞬时表达的基因转导方法 近年来围绕栽细胞的病毒基因转导方法和理化基因转染方法都取得了可喜的进步 源援员摇 病毒载体转导方法 病毒载体最大的优点是转染效率高, 在栽细胞基因修饰中得到较多的应用 逆转录病毒 ( 则藻贼则燥增蚤则怎泽 ) 是第一个批准用于临床的病毒载体,

4 胡春晓, 等援肿瘤过继免疫治疗临床级抗原特异性栽细胞的研究进展 员园苑 [ 猿员 ] 栽细胞转导效率达圆园豫耀耀耀耀耀耀远园豫 杂糟澡燥造造藻则等最近报告了来自猿个临床试验的圆园园例患者长达 员员年的临床观察, 逆转录病毒修饰栽细胞在 怨愿豫患者中能够长期的追踪到, 且没有发现插入突变导致的细胞恶性转化, 但是逆转录病毒载体不能转染非增殖细胞 ( 如栽晕细胞 ) 而影响其转导效率 慢病毒 ( 造藻灶贼蚤增蚤则怎泽 ) 能感染增殖期及静止期的多种类型细胞, 感染效率接近员园园豫, 随着安全性的进一步提高, 在临床试验中应用日益增 [ 猿圆多 ] [ 圆愿 ] 允怎灶藻等采用蕴藻灶贼蚤早藻灶公司的慢病毒包装系统能够达到临床要求的病毒滴度和纯度, 在 悦粤砸修饰栽细胞治疗血液系肿瘤中得到了很好 [ 猿猿 ] 的应用 ; 悦蚤则糟燥泽贼葬等利用慢病毒载体介导 酝粤砸栽鄄员鄄栽悦砸修饰悦阅愿 垣 栽晕 细胞达到猿源豫耀耀耀耀耀耀 源缘豫的转导效率 此外, 粤凿缘辕云猿缘腺病毒载体能够达到员园豫静息栽细胞和猿园豫耀耀耀耀耀耀源缘豫活化栽细 [ 猿源胞的转导效率, 有望成为候选的病毒载体 ] 泡沫病毒 ( 枣燥葬皂赠增蚤则怎泽 ) 载体可能比逆转录病毒和慢病毒有安全优势, 因为野生型泡沫病毒对人类及其他灵长类动物没有致病性, 可能很快进入临 [ 猿缘床试验 ] 源援圆摇 理化基因转染方法 理化基因转染方法操作简单 安全性好 免疫原性低, 但转染效率低于病毒载体 近年, 以睡美人 ( 泽造藻藻责蚤灶早遭藻葬怎贼赠, 杂月 ) 和孕蚤早早赠遭葬糟为代表的转座子系 [ 猿远鄄猿苑统 ( ] 贼则葬灶泽责燥泽燥灶鄄遭葬泽藻凿泽赠泽贼藻皂 ) 提高了理化方法的转染效率 转座子系统含有两个质粒, 一个编码转座酶, 另一个是两端携带有反向重复序列 ( 陨砸辕阅砸泽 ) 的目的基因 转座酶识别基因组的陨砸辕阅砸泽重复序列, 将目的基因整合到靶细胞 杂月系统在悦粤砸修饰栽细胞研究中能达到猿园豫的基因转染效率, 展示 [ 猿愿出良好的应用前景 ] 孕蚤早早赠遭葬糟系统能够同时转导多个基因, 使被修饰的细胞获得多重功能表 [ 猿怨型 ] 然而和其他的整合型基因转导方法一样, 转座子系统也存在插入突变风险, 但迄今为止尚未发现插入突变相关的临床报道 锌指蛋白核酸酶 ( 扎蚤灶糟枣蚤灶早藻则灶怎糟造藻葬泽藻 ) 是最近开发的基因转导方法, 它是通过锌指蛋白的位点识别 核酸酶的定点切割 细胞的修复机制来实现的, 其在栽细胞基因修饰中 [ 源园的作用正在研究之中 ] 缘摇 结语 临床级抗原特异性栽细胞制备的进展重燃了人们对粤陨栽的信心, 尤其是基因修饰栽细胞临床研究的成就加速了其从实验室到临床的转化 未来的 过继免疫治疗将会根据细胞表型分选最佳治疗潜质的栽细胞亚群, 优化培养条件, 保持增殖栽细胞的低分化状态, 提高基因转导效率, 增强栽细胞的抗肿瘤效能, 为临床治疗提供靶向性强 杀伤活性高 毒性作用小 疗效卓越的临床级细胞产品 随着研究的深入, 相信过继免疫治疗将会给肿瘤患者带来福祉 [ 参考文献 ] [ 员 ] 摇砸燥泽藻灶遭藻则早杂粤援砸葬蚤泽蚤灶早贼澡藻遭葬则 : 贼澡藻糟怎则葬贼蚤增藻责燥贼藻灶贼蚤葬造燥枣澡怎皂葬灶糟葬灶糟藻则蚤皂皂怎灶燥贼澡藻则葬责赠 [ 允 ] 援杂糟蚤栽则葬灶泽造酝藻凿, 圆园员圆, 源 ( 员圆苑 ): 员圆苑责泽愿援 [ 圆 ] 摇运造藻遭葬灶燥枣枣悦粤, 郧葬贼贼蚤灶燥灶蚤蕴, 砸藻泽贼蚤枣燥晕孕援杂燥则贼蚤灶早贼澡则燥怎早澡泽怎遭泽藻贼泽 : 宰澡蚤糟澡栽鄄糟藻造造责燥责怎造葬贼蚤燥灶泽皂藻凿蚤葬贼藻澡蚤早澡造赠藻枣枣藻糟贼蚤增藻葬凿燥责贼蚤增藻蚤皂皂怎鄄灶燥贼澡藻则葬责赠?[ 允 ] 援允陨皂皂怎灶燥贼澡藻则, 圆园员圆, 猿缘 ( 怨 ): 远缘员鄄远远园援 [ 猿 ] 摇阅蚤早蚤怎泽贼燥阅蕴, 悦燥燥责藻则蕴允晕援孕则藻责葬则蚤灶早糟造蚤灶蚤糟葬造早则葬凿藻粤早鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟栽糟藻造造泽枣燥则葬凿燥责贼蚤增藻蚤皂皂怎灶燥贼澡藻则葬责赠贼则蚤葬造泽 [ 允 ] 援悦赠贼燥贼澡藻则葬责赠, 圆园园苑, 怨 ( 苑 ): 远员猿鄄远圆怨援 [ 源 ] 摇运葬皂皂怎造葬哉杂, 杂藻则则葬灶燥韵运援哉泽藻燥枣澡蚤早澡贼澡则燥怎早澡责怎贼择孕悦砸泽糟则藻藻灶鄄蚤灶早贼燥则葬责蚤凿造赠糟造燥灶藻造燥憎枣则藻择怎藻灶糟赠贼怎皂燥则泽责藻糟蚤枣蚤糟栽鄄糟藻造造泽枣则燥皂责藻鄄则蚤责澡藻则葬造遭造燥燥凿枣燥则葬凿燥责贼蚤增藻蚤皂皂怎灶燥贼澡藻则葬责赠 [ 允 ] 援允栽则葬灶泽造酝藻凿, 圆园园愿, 远 ( 员 ): 远园援 [ 缘 ] 摇月藻则早藻则悦, 栽怎则贼造藻悦允, 允藻灶泽藻灶酝悦, 藻贼葬造援粤凿燥责贼蚤增藻贼则葬灶泽枣藻则燥枣增蚤则怎泽鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟葬灶凿贼怎皂燥则鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟栽糟藻造造蚤皂皂怎灶蚤贼赠 [ 允 ] 援悦怎则则韵责蚤灶陨皂鄄皂怎灶燥造, 圆园园怨, 圆员 ( 圆 ): 圆圆源鄄圆猿圆援 [ 远 ] 摇栽怎则贼造藻悦允, 砸蚤凿凿藻造造杂砸援粤则贼蚤枣蚤糟蚤葬造葬灶贼蚤早藻灶责则藻泽藻灶贼蚤灶早糟藻造造泽枣燥则怎泽藻蚤灶葬凿燥责贼蚤增藻蚤皂皂怎灶燥贼澡藻则葬责赠 [ 允 ] 援悦葬灶糟藻则允, 圆园员园, 员远 ( 源 ): 猿苑源鄄猿愿员援 [ 苑 ] 摇蕴蚤再, 运怎则造葬灶凿藻则砸允援悦燥皂责葬则蚤泽燥灶燥枣葬灶贼蚤鄄悦阅猿葬灶凿葬灶贼蚤鄄悦阅圆愿鄄糟燥葬鄄贼藻凿遭藻葬凿泽憎蚤贼澡泽燥造怎遭造藻葬灶贼蚤鄄悦阅猿枣燥则藻曾责葬灶凿蚤灶早澡怎皂葬灶栽糟藻造造泽 : 凿蚤枣鄄枣藻则蚤灶早蚤皂责葬糟贼燥灶悦阅愿栽糟藻造造责澡藻灶燥贼赠责藻葬灶凿则藻泽责燥灶泽蚤增藻灶藻泽泽贼燥则藻泽鄄贼蚤皂怎造葬贼蚤燥灶 [ 允 ] 援允栽则葬灶泽造酝藻凿, 圆园员园, 愿 ( 员 ): 员园源援 [ 愿 ] 摇运燥枣枣藻皂葬灶耘, 运藻燥早澡耘, 运造藻蚤灶酝, 藻贼葬造援陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶葬灶凿皂葬灶蚤责怎鄄造葬贼蚤燥灶燥枣葬灶贼蚤早藻灶泽责藻糟蚤枣蚤糟栽鄄糟藻造造泽憎蚤贼澡葬则贼蚤枣蚤糟蚤葬造葬灶贼蚤早藻灶责则藻泽藻灶贼蚤灶早糟藻造造泽 [ 允 ] 援酝藻贼澡燥凿泽酝燥造酝藻凿, 圆园园苑, 员猿远 ( 员 ): 远怨鄄愿远援 [ 怨 ] 摇蕴蚤葬燥宰, 蕴蚤灶允载, 蕴藻燥灶葬则凿宰允援陨灶贼藻则造藻怎噪蚤灶鄄圆葬贼贼澡藻糟则燥泽泽则燥葬凿泽燥枣藻枣枣藻糟贼燥则则藻泽责燥灶泽藻泽, 贼燥造藻则葬灶糟藻, 葬灶凿蚤皂皂怎灶燥贼澡藻则葬责赠 [ 允 ] 援陨皂皂怎灶蚤鄄贼赠, 圆园员猿, 猿愿 ( 员 ): 员猿鄄圆缘援 [ 员园 ] 再葬灶早杂, 允蚤再, 郧葬贼贼蚤灶燥灶蚤蕴, 藻贼葬造援酝燥凿怎造葬贼蚤灶早贼澡藻凿蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬贼蚤燥灶泽贼葬贼怎泽燥枣藻曾增蚤增燥鄄糟怎造贼怎则藻凿葬灶贼蚤鄄贼怎皂燥则栽糟藻造造泽怎泽蚤灶早糟赠贼燥噪蚤灶藻糟燥糟噪贼葬蚤造泽 [ 允 ] 援悦葬灶糟藻则陨皂皂怎灶燥造陨皂皂怎灶燥贼澡藻则, 圆园员猿, 远圆 ( 源 ): 苑圆苑鄄苑猿远援 [ 员员 ] 悦蚤藻则蚤晕, 悦葬皂蚤泽葬月, 悦燥糟糟澡蚤葬则藻造造葬云, 藻贼葬造援陨蕴鄄苑葬灶凿陨蕴鄄员缘蚤灶泽贼则怎糟贼贼澡藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶燥枣澡怎皂葬灶皂藻皂燥则赠泽栽耘酝栽糟藻造造泽枣则燥皂灶葬蚤增藻责则藻糟怎则泽燥则泽 [ 允 ] 援月造燥燥凿, 圆园员猿, 员圆员 ( 源 ): 缘苑猿鄄缘愿源援 [ 员圆 ] 匀蚤灶则蚤糟澡泽悦杂, 杂责燥造泽噪蚤砸, 孕葬怎造燥泽悦酝, 藻贼葬造援陨蕴鄄圆葬灶凿陨蕴鄄圆员糟燥灶枣藻则垣燥责责燥泽蚤灶早凿蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬贼蚤燥灶责则燥早则葬皂泽贼燥悦阅愿栽糟藻造造泽枣燥则葬凿燥责贼蚤增藻蚤皂鄄皂怎灶燥贼澡藻则葬责赠 [ 允 ] 援月造燥燥凿, 圆园园愿, 员员员 ( 员员 ): 缘猿圆远鄄缘猿猿猿援 [ 员猿 ] 砸葬燥砸砸, 蕴蚤匝, 韵凿怎灶泽蚤运, 藻贼葬造援栽澡藻皂栽韵砸噪蚤灶葬泽藻凿藻贼藻则皂蚤灶藻泽藻枣鄄垣枣藻糟贼燥则增藻则泽怎泽皂藻皂燥则赠悦阅愿栽糟藻造造枣葬贼藻遭赠则藻早怎造葬贼蚤灶早贼澡藻藻曾责则藻泽泽蚤燥灶燥枣贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶枣葬糟贼燥则泽栽鄄遭藻贼葬灶凿耘燥皂藻泽燥凿藻则皂蚤灶 [ 允 ] 援陨皂皂怎灶蚤贼赠, 圆园员园, 猿圆 ( 员 ): 远苑鄄苑愿援

5 员园愿 中国肿瘤生物治疗杂志, 圆园员源年圆月, 圆员 ( 员 ) [ 员源 ] 郧葬贼贼蚤灶燥灶蚤蕴, 在澡燥灶早载杂, 孕葬造皂藻则阅悦, 藻贼葬造援宰灶贼泽蚤早灶葬造蚤灶早葬则则藻泽贼泽垣藻枣枣藻糟贼燥则栽糟藻造造凿蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬贼蚤燥灶葬灶凿早藻灶藻则葬贼藻泽悦阅愿皂藻皂燥则赠泽栽耘酝 糟藻造造泽 [ 允 ] 援晕葬贼酝藻凿, 圆园园怨, 员缘 ( 苑 ): 愿园愿鄄愿员猿援 [ 员缘 ] 运造藻遭葬灶燥枣枣悦粤, 郧葬贼贼蚤灶燥灶蚤蕴, 栽燥则葬遭蚤鄄孕葬则蚤扎蚤孕, 藻贼葬造援悦藻灶贼则葬造皂藻皂燥则赠垣泽藻造枣辕贼怎皂燥则鄄则藻葬糟贼蚤增藻悦阅愿栽糟藻造造泽糟燥灶枣藻则泽怎责藻则蚤燥则葬灶贼蚤贼怎皂燥则蚤皂皂怎鄄灶蚤贼赠糟燥皂责葬则藻凿憎蚤贼澡藻枣枣藻糟贼燥则皂藻皂燥则赠栽糟藻造造泽 [ 允 ] 援孕则燥糟晕葬贼造粤糟葬凿杂糟蚤哉杂粤, 圆园园缘, 员园圆 ( 圆苑 ): 怨缘苑员鄄怨缘苑远援 [ 员远 ] 月藻则早藻则悦, 允藻灶泽藻灶酝悦, 蕴葬灶泽凿燥则责孕酝, 藻贼葬造援粤凿燥责贼蚤增藻贼则葬灶泽枣藻则燥枣垣藻枣枣藻糟贼燥则悦阅愿栽糟藻造造泽凿藻则蚤增藻凿枣则燥皂糟藻灶贼则葬造皂藻皂燥则赠糟藻造造泽藻泽贼葬遭造蚤泽澡藻泽责藻则泽蚤泽贼藻灶贼栽糟藻造造皂藻皂燥则赠蚤灶责则蚤皂葬贼藻泽 [ 允 ] 援允悦造蚤灶陨灶增藻泽贼, 圆园园愿, 员员愿 ( 员 ): 圆怨源鄄猿园缘援 [ 员苑 ] 月藻则早藻则悦, 栽怎则贼造藻悦允, 允藻灶泽藻灶酝悦, 藻贼葬造援粤凿燥责贼蚤增藻贼则葬灶泽枣藻则燥枣增蚤则怎泽鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟葬灶凿贼怎皂燥则鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟栽糟藻造造蚤皂皂怎灶蚤贼赠 [ 允 ] 援悦怎则则韵责蚤灶陨皂皂怎鄄灶燥造, 圆园园怨, 圆员 ( 圆 ): 圆圆源鄄圆猿圆援 [ 员愿 ] 员愿杂葬则噪葬则杂, 栽藻蚤糟澡早则覿遭藻则灾, 运葬造蚤葬灾, 藻贼葬造援杂贼则藻灶早贼澡燥枣泽贼蚤皂怎造怎泽垣葬灶凿糟造燥灶葬造糟燥皂责藻贼蚤贼蚤燥灶蚤皂责葬糟贼贼澡藻则葬贼藻燥枣皂藻皂燥则赠悦阅愿栽糟藻造造凿蚤枣鄄枣藻则藻灶贼蚤葬贼蚤燥灶 [ 允 ] 援允陨皂皂怎灶燥造, 圆园园苑, 员苑怨 ( 员园 ): 远苑园源鄄远苑员源援 [ 员怨 ] 郧葬贼贼蚤灶燥灶蚤蕴, 蕴怎早造蚤耘, 允蚤再, 藻贼葬造援粤澡怎皂葬灶皂藻皂燥则赠栽糟藻造造泽怎遭泽藻贼憎蚤贼澡泽栽耘酝糟藻造造鄄造蚤噪藻责则燥责藻则贼蚤藻泽 [ 允 ] 援晕葬贼酝藻凿, 圆园员员, 员苑 ( 员园 ): 员圆怨园鄄员圆怨苑援 [ 圆园 ] 运造藻遭葬灶燥枣枣悦粤, 郧葬贼贼蚤灶燥灶蚤蕴, 孕葬造皂藻则阅悦, 藻贼葬造援阅藻贼藻则皂蚤灶葬灶贼泽燥枣垣泽怎糟糟藻泽泽枣怎造悦阅愿栽糟藻造造葬凿燥责贼蚤增藻蚤皂皂怎灶燥贼澡藻则葬责赠枣燥则造葬则早藻藻泽贼葬遭鄄造蚤泽澡藻凿贼怎皂燥则泽蚤灶皂蚤糟藻 [ 允 ] 援悦造蚤灶悦葬灶糟藻则砸藻泽, 圆园员员, 员苑 ( 员远 ): 缘猿源猿鄄缘猿缘圆援 [ 圆员 ] 郧燥枣枣杂蕴, 允燥澡灶泽燥灶蕴粤, 月造葬糟噪酝粤, 藻贼葬造援耘灶澡葬灶糟藻凿则藻糟藻责贼燥则藻曾鄄责则藻泽泽蚤燥灶葬灶凿蚤灶增蚤贼则燥藻枣枣藻糟贼燥则枣怎灶糟贼蚤燥灶燥枣葬皂怎则蚤灶藻鄄澡怎皂葬灶澡赠遭则蚤凿酝粤砸栽鄄员鄄则藻葬糟贼蚤增藻栽糟藻造造则藻糟藻责贼燥则枣燥造造燥憎蚤灶早葬则葬责蚤凿藻曾责葬灶泽蚤燥灶 [ 允 ] 援悦葬灶糟藻则陨皂皂怎灶燥造陨皂皂怎灶燥贼澡藻则, 圆园员园, 缘怨 ( 员园 ): 员缘缘员鄄员缘远园援 [ 圆圆 ] 砸燥遭遭蚤灶泽孕云, 酝燥则早藻灶砸粤, 云藻造凿皂葬灶杂粤, 藻贼葬造援栽怎皂燥则则藻早则藻泽泽蚤燥灶蚤灶责葬贼蚤藻灶贼泽憎蚤贼澡皂藻贼葬泽贼葬贼蚤糟泽赠灶燥增蚤葬造糟藻造造泽葬则糟燥皂葬葬灶凿皂藻造葬灶燥皂葬怎泽蚤灶早早藻灶藻贼蚤糟葬造造赠藻灶早蚤灶藻藻则藻凿造赠皂责澡燥糟赠贼藻泽则藻葬糟贼蚤增藻憎蚤贼澡晕再鄄耘杂韵鄄员 [ 允 ] 援允悦造蚤灶韵灶糟燥造, 圆园员员, 圆怨 ( 苑 ): 怨员苑鄄怨圆源援 [ 圆猿 ] 杂贼燥灶藻允阅, 运则葬灶扎阅酝援砸燥造藻燥枣栽糟藻造造则藻糟藻责贼燥则葬枣枣蚤灶蚤贼赠蚤灶贼澡藻藻枣枣蚤糟葬糟赠葬灶凿泽责藻糟蚤枣蚤糟蚤贼赠燥枣葬凿燥责贼蚤增藻栽糟藻造造贼澡藻则葬责蚤藻泽 [ 允 ] 援云则燥灶贼陨皂皂怎灶燥造, 圆园员猿, 源 ( 圆 ): 圆源源援 [ 圆源 ] 郧燥增藻则泽悦, 杂藻遭藻泽贼赠藻灶在, 悦燥糟糟燥则蚤泽酝, 藻贼葬造援栽糟藻造造则藻糟藻责贼燥则早藻灶藻贼澡藻则葬责赠 : 杂贼则葬贼藻早蚤藻泽枣燥则燥责贼蚤皂蚤扎蚤灶早贼则葬灶泽早藻灶蚤糟栽悦砸责葬蚤则蚤灶早 [ 允 ] 援栽则藻灶凿泽酝燥造酝藻凿, 圆园员园, 员远 ( 圆 ): 苑苑鄄愿苑援 [ 圆缘 ] 匀藻遭藻蚤泽藻灶酝, 韵遭藻则造藻杂郧, 孕则藻泽燥贼贼燥阅, 藻贼葬造援酝燥造藻糟怎造葬则蚤灶泽蚤早澡贼泽枣燥则燥责贼蚤皂蚤扎蚤灶早栽糟藻造造泽则藻糟藻责贼燥则泽责藻糟蚤枣蚤糟蚤贼赠葬早葬蚤灶泽贼糟葬灶糟藻则 [ 允 ] 援云则燥灶贼陨皂皂怎灶燥造, 圆园员猿, 源 ( 员 ): 员缘源援 [ 圆远 ] 郧则燥泽泽郧, 宰葬噪泽栽, 耘泽澡澡葬则在援耘曾责则藻泽泽蚤燥灶燥枣蚤皂皂怎灶燥早造燥遭怎造蚤灶鄄栽鄄糟藻造造则藻糟藻责贼燥则糟澡蚤皂藻则蚤糟皂燥造藻糟怎造藻泽葬泽枣怎灶糟贼蚤燥灶葬造则藻糟藻责贼燥则泽憎蚤贼澡葬灶贼蚤遭燥凿赠鄄贼赠责藻泽责藻糟蚤枣蚤糟蚤贼赠 [ 允 ] 援孕则燥糟晕葬贼造粤糟葬凿杂糟蚤哉杂粤, 员怨愿怨, 愿远 ( 圆源 ): 员园园圆源鄄员园园圆愿援 [ 圆苑 ] 匀葬灶耘匝, 蕴蚤载蕴, 宰葬灶早悦砸, 藻贼葬造援悦澡蚤皂藻则蚤糟葬灶贼蚤早藻灶则藻糟藻责贼燥则鄄藻灶早蚤鄄灶藻藻则藻凿栽糟藻造造泽枣燥则糟葬灶糟藻则蚤皂皂怎灶燥贼澡藻则葬责赠 : 责则燥早则藻泽泽葬灶凿糟澡葬造造藻灶早藻泽 [ 允 ] 援允匀藻皂葬贼燥造韵灶糟燥造, 圆园员猿, 远 ( 员 ): 源苑援 [ 圆愿 ] 孕燥则贼藻则阅蕴, 蕴藻增蚤灶藻月蕴, 运葬造燥泽酝, 藻贼葬造援悦澡蚤皂藻则蚤糟葬灶贼蚤早藻灶则藻糟藻责贼燥则鄄皂燥凿蚤枣蚤藻凿栽糟藻造造泽蚤灶糟澡则燥灶蚤糟造赠皂责澡燥蚤凿造藻怎噪藻皂蚤葬 [ 允 ] 援晕耘灶早造允酝藻凿, 圆园员员, 猿远缘 ( 愿 ): 苑圆缘鄄苑猿猿援 [ 圆怨 ] 运燥糟澡藻灶凿藻则枣藻则允晕, 砸燥泽藻灶遭藻则早杂粤援栽则藻葬贼蚤灶早月鄄糟藻造造糟葬灶糟藻则憎蚤贼澡栽糟藻造造泽藻曾责则藻泽泽蚤灶早葬灶贼蚤鄄悦阅员怨糟澡蚤皂藻则蚤糟葬灶贼蚤早藻灶则藻糟藻责贼燥则泽 [ 允 ] 援晕葬贼砸藻增悦造蚤灶韵灶糟燥造, 圆园员猿, 员园 ( 缘 ): 圆远苑鄄圆苑远援 [ 猿园 ] 蕴燥怎蚤泽悦哉, 杂葬增燥造凿燥月, 阅燥贼贼蚤郧, 藻贼葬造援粤灶贼蚤贼怎皂燥则葬糟贼蚤增蚤贼赠葬灶凿造燥灶早鄄贼藻则皂枣葬贼藻燥枣糟澡蚤皂藻则蚤糟葬灶贼蚤早藻灶则藻糟藻责贼燥则鄄责燥泽蚤贼蚤增藻栽糟藻造造泽蚤灶责葬贼蚤藻灶贼泽憎蚤贼澡灶藻怎则燥遭造葬泽贼燥皂葬 [ 允 ] 援月造燥燥凿, 圆园员员, 员员愿 ( 圆猿 ): 远园缘园鄄远园缘远援 [ 猿员 ] 杂糟澡燥造造藻则允, 月则葬凿赠栽蕴, 月蚤灶凿藻则鄄杂糟澡燥造造郧, 藻贼葬造援阅藻糟葬凿藻鄄造燥灶早泽葬枣藻贼赠葬灶凿枣怎灶糟贼蚤燥灶燥枣则藻贼则燥增蚤则葬造鄄皂燥凿蚤枣蚤藻凿糟澡蚤皂藻则蚤糟葬灶贼蚤早藻灶则藻糟藻责贼燥则栽糟藻造造泽 [ 允 ] 援杂糟蚤栽则葬灶泽造酝藻凿, 圆园员圆, 源 ( 员猿圆 ): 员猿圆鄄员缘猿援 [ 猿圆 ] 杂藻早怎则葬酝酝, 酝葬灶早蚤燥灶酝, 郧葬蚤造造藻贼月, 藻贼葬造援晕藻憎凿藻增藻造燥责皂藻灶贼泽蚤灶造藻灶贼蚤增蚤则葬造增藻糟贼燥则凿藻泽蚤早灶, 责则燥凿怎糟贼蚤燥灶葬灶凿责怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 [ 允 ] 援耘曾责藻则贼韵责蚤灶月蚤燥造栽澡藻则, 圆园员猿, 员猿 ( 苑 ): 怨愿苑鄄员园员员援 [ 猿猿 ] 悦蚤则糟燥泽贼葬孕, 郧则葬灶扎蚤藻则燥蕴, 云燥造造藻灶扎蚤粤, 藻贼葬员援栽糟藻造造则藻糟藻责贼燥则 ( 栽悦砸 ) 早藻灶藻贼则葬灶泽枣藻则憎蚤贼澡造藻灶贼蚤增蚤则葬造增藻糟贼燥则泽葬造造燥憎泽藻枣枣蚤糟蚤藻灶贼则藻凿蚤则藻糟贼蚤燥灶燥枣贼怎皂燥则泽责藻糟蚤枣蚤糟蚤贼赠蚤灶灶葬蚤增藻葬灶凿皂藻皂燥则赠栽糟藻造造泽憎蚤贼澡燥怎贼责则蚤燥则泽贼蚤皂怎造葬鄄贼蚤燥灶燥枣藻灶凿燥早藻灶燥怎泽栽悦砸 [ 允 ] 援匀怎皂郧藻灶藻栽澡藻则, 圆园园怨, 圆园 ( 员圆 ): 员缘苑远鄄员缘愿愿援 [ 猿源 ] 杂糟澡则燥藻则泽砸, 匀蚤造凿藻遭则葬灶凿贼再, 匀葬泽藻灶噪葬皂责允, 藻贼葬造援郧藻灶藻贼则葬灶泽枣藻则蚤灶鄄贼燥澡怎皂葬灶栽造赠皂责澡燥糟赠贼藻泽葬灶凿灶葬贼怎则葬造噪蚤造造藻则糟藻造造泽遭赠粤凿缘辕云猿缘糟澡蚤皂鄄藻则蚤糟葬凿藻灶燥增蚤则葬造增藻糟贼燥则泽 [ 允 ] 援耘曾责匀藻皂葬贼燥造, 圆园园源, 猿圆 ( 远 ): 缘猿远鄄缘源远援 [ 猿缘 ] 栽则燥遭则蚤凿早藻郧阅, 匀燥则灶孕粤, 月藻葬则凿月悦, 藻贼葬造援蕴葬则早藻葬灶蚤皂葬造皂燥凿藻造泽枣燥则枣燥葬皂赠增蚤则怎泽增藻糟贼燥则早藻灶藻贼澡藻则葬责赠 [ 允 ] 援灾蚤则怎泽藻泽, 圆园员圆, 源 ( 员圆 ): 猿缘苑圆鄄猿缘愿愿援 [ 猿远 ] 酝葬蚤贼蚤杂晕, 匀怎造泽匀, 杂蚤灶早澡匀, 藻贼葬造援杂造藻藻责蚤灶早遭藻葬怎贼赠泽赠泽栽耘酝贼燥则藻凿蚤鄄则藻糟贼栽鄄糟藻造造泽责藻糟蚤枣蚤糟蚤贼赠枣燥则澡怎皂葬灶葬责责造蚤糟葬贼蚤燥灶泽 [ 允 ] 援允陨皂皂怎灶燥贼澡藻则, 圆园员猿, 猿远 ( 圆 ): 员员圆鄄员圆猿援 [ 猿苑 ] 晕葬噪葬扎葬憎葬再, 杂葬澡葬杂, 郧葬造增葬灶阅蕴, 藻贼葬造援耘增葬造怎葬贼蚤燥灶燥枣造燥灶早鄄贼藻则皂贼则葬灶泽早藻灶藻藻曾责则藻泽泽蚤燥灶蚤灶责蚤早早赠月葬糟鄄皂燥凿蚤枣蚤藻凿澡怎皂葬灶栽造赠皂责澡燥糟赠贼藻泽 [ 允 ] 援允陨皂皂怎灶燥贼澡藻则, 圆园员猿, 猿远 ( 员 ): 猿鄄员园援 [ 猿愿 ] 杂蚤灶早澡匀, 云蚤早造蚤燥造葬酝允, 阅葬憎泽燥灶酝允, 藻贼葬造援酝葬灶怎枣葬糟贼怎则藻燥枣糟造蚤灶蚤糟葬造鄄早则葬凿藻悦阅员怨鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟栽糟藻造造泽泽贼葬遭造赠藻曾责则藻泽泽蚤灶早糟澡蚤皂藻则蚤糟葬灶贼蚤早藻灶则藻鄄糟藻责贼燥则怎泽蚤灶早泽藻藻责蚤灶早遭藻葬怎贼赠泽赠泽栽耘酝葬灶凿葬则贼蚤枣蚤糟蚤葬造葬灶贼蚤早藻灶责则藻泽藻灶贼蚤灶早糟藻造造泽 [ 允 ] 援孕蕴燥杂韵灶藻, 圆园员猿, 愿 ( 缘 ): 藻远源员猿愿援 [ 猿怨 ] 杂葬澡葬杂, 晕葬噪葬扎葬憎葬再, 匀怎赠藻蕴耘, 藻贼葬造援孕蚤早早赠月葬糟贼则葬灶泽责燥泽燥灶泽赠泽鄄栽耘酝皂燥凿蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶燥枣责则蚤皂葬则赠澡怎皂葬灶栽糟藻造造泽 [ 允 ] 援允灾蚤泽耘曾责, 圆园员圆, ( 远怨 ): 藻源圆猿缘援 [ 源园 ] 酝葬蚤藻则阅粤, 月则藻灶灶葬灶粤蕴, 允蚤葬灶早杂, 藻贼葬造援耘枣枣蚤糟蚤藻灶贼糟造蚤灶蚤糟葬造泽糟葬造藻早藻灶藻皂燥凿蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶增蚤葬扎蚤灶糟枣蚤灶早藻则灶怎糟造藻葬泽藻鄄贼葬则早藻贼藻凿凿蚤泽则怎责贼蚤燥灶燥枣贼澡藻匀陨灾糟燥鄄则藻糟藻责贼燥则悦悦砸缘 [ 允 ] 援匀怎皂郧藻灶藻栽澡藻则, 圆园员猿, 圆源 ( 猿 ): 圆源缘鄄圆缘愿援 [ 收稿日期 ] 摇圆园员猿原园怨原园缘 [ 修回日期 ] 摇圆园员猿原员圆原圆愿 [ 本文编辑 ] 摇韩丹